羅 芳，陶金忠

(寧夏大學農學院 動物科學系，銀川 750021)

受精后早期妊娠診斷是決定牛場經(jīng)濟效益高低的重要因素之一，人工授精后盡早識別未妊娠奶牛是減少因檢測發(fā)情效率低下而導致妊娠間隔延長的最好方法。若不能盡早識別未妊娠奶牛，會導致下一次情期配種時間延長，從而加大產犢間隔，引起牧場繁殖力低下和育種成本升高等一系列問題[1]。早期妊娠診斷不僅影響牧場繁殖率，還會導致產奶量降低，有研究報道，奶?？諔褧r間超過21 d(一個發(fā)情周期)，每頭奶牛的產奶量將會減少168～315 kg[2]。從授精當天到第17天是精卵結合到妊娠識別的一個階段。奶牛妊娠建立是一個極其復雜的過程，要經(jīng)歷排卵、受精、胚泡形成、孕體生長、妊娠識別信號分泌以及胚胎和胎盤的發(fā)育等一系列復雜的反應[3]。授精后15～17 d也被認為是維持妊娠的關鍵時期，妊娠識別發(fā)生在配種后的15～17 d，而母體接納孕體的時間最晚不超過17 d[4]。在妊娠早期，孕體與母體之間建立密切聯(lián)系，孕體發(fā)育到囊胚期滋養(yǎng)外胚層開始分泌適當?shù)目裹S體溶解信號(INF-τ)來阻斷子宮內膜前列腺素(PGF2α)的產生，INF-τ會抑制黃體周期性溶解，保證孕酮正常分泌從而維持妊娠[5-6]。目前，生產上已經(jīng)通過經(jīng)直腸超聲檢測對奶牛進行早期妊娠診斷，或者人工授精后35 d內通過觸診子宮形態(tài)變化來判別妊娠狀態(tài)[7]。如果奶牛沒有妊娠且發(fā)情周期持續(xù)21 d，那么人工授精后的第27～29天相當于發(fā)情周期的第6～8天。發(fā)情周期第6～8天時第一個優(yōu)勢卵泡達到其最大直徑[8]，如果在第6～8天給予PGF2α處理，母牛將于40～48 h 后開始發(fā)情[9]。未妊娠奶牛可在人工授精后第27～29天使用PGF2a誘導黃體退化，并在檢測到發(fā)情后進行重復的定時輸精或者再受精。因此，早期準確的妊娠診斷可以減少奶?？諔褧r間、縮短產犢間隔，進一步提高牧場經(jīng)濟效益。

代謝組學是目前常用的系統(tǒng)生物學技術之一，主要研究機體受擾動后相對分子質量小于1 000的內源性小分子代謝物的動態(tài)變化。近年來，代謝組學方法已被成功應用于奶牛疾病診斷和生理機制以及包括轉基因動物在內的疾病動物模型的確證、藥物篩選、藥效及毒性評價、作用機制和臨床評價等方面[10]。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質譜(UHPLC-QTOF/MS)具有UHPLC快速高效的色譜分離能力和QTOF的高分辨率、高靈敏度。目前，基于UHPLC-QTOF/MS的代謝組學技術已廣泛應用于動物疾病標志物的篩選及藥效毒性評價等多個領域。郭延生和陶金忠[11]應用LC-Q/TOF-MS代謝組學方法對人工授精當天和第17天的荷斯坦奶牛乳樣進行研究，發(fā)現(xiàn)牛奶中的L-酪氨酸、N-乙?；?L-酪氨酸、L-脯氨酸、四氫1-苯甲基-1, 2, 3, 4-四氫異喹啉、鳥苷和十七烷基肉堿有望成為妊娠識別期妊娠診斷標識物，可為深入研究奶牛早期妊娠識別機理提供新視角。Yang等[12]基于UHPLC-QTOF/MS代謝組學技術研究高谷物飲食與肉牛生長性能之間的關系，發(fā)現(xiàn)飼喂高玉米日糧能夠增加瘤胃和血液中的脂多糖和有害代謝產物，這些差異代謝物及其相關代謝通路可能有助于探索飼喂高玉米日糧導致代謝性疾病的潛在生物標志物。

本研究基于UHPLC-QTOF/MS的代謝組學方法對奶牛人工授精后第17天的血漿代謝輪廓及代謝物變化進行研究，觀察胚胎發(fā)育過程中不同時間點代謝物變化規(guī)律，尋找早期妊娠診斷的候選生物標識物，為提高母畜受胎率奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Triple TOF 6600高分辨質譜儀(AB SCIEX)，1290 UHPLC 超高壓液相色譜儀(Agilent)，Heraeus Fresco17低溫高速離心機(Thermo Fisher Sci-entific)，液相色譜柱(Waters ACQUITY UPLC BEH Amide，2.1*100 mm, 1.7 μm)，BSA124S-CW天平(Sartorius)，明澈 D24 UV純水儀(Merck Millipore)，YM-080S超聲儀(深圳市方奧微電子有限公司)，甲醇(CNW Technologies，67-56-1)，乙腈(CNW Technologies，75-05-8)，乙酸銨(CNW Technologies，631-61-8)，氨水(Ammonium hydroxide)，內標：L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司，103616-89-3)。

1.2 試驗動物與分組

以寧夏某奶牛場體重為(550±50)kg，體況評分相近的經(jīng)產(2～3胎次)健康荷斯坦奶牛為試驗對象。同期發(fā)情后，在人工授精后第17天晨飼前對奶牛進行尾靜脈采血，肝素抗凝后，3 000 r·min-1離心10 min，收集上層血漿，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，以備后續(xù)分析。后期采用計步器對奶牛進行發(fā)情鑒定，觀察記錄授精28 d前奶牛的返情情況，并且在授精第32天時采用B超儀進一步進行早期妊娠診斷，根據(jù)診斷結果將奶牛分為妊娠組(A組，n=12)和未妊娠返情組(B組，n=24)，將這兩組樣品進行代謝組學分析。

1.3 樣本預處理

從-80 ℃冰箱中取出樣本，在 4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，分別移取100 μL 樣本至EP管中，加入400 μL 提取液(甲醇∶乙腈=1∶1(V/V)，含內標2 μg·mL-1)，渦旋混勻1 min；冰水浴超聲10 min；然后在-40 ℃條件下靜置60 min后在4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；取上清425 μL于EP管中，真空干燥后加入100 μL 50%乙腈復溶，渦旋30 s，冰 水浴超聲10 min后在4 ℃，13 000 r·min-1條件下離心15 min；取70 μL上清液于進樣瓶中上機檢測；同時，分別取所有樣品10 μL上清液混合成質量控制(quality control, QC)樣品上機檢測。

1.4 樣本UHPLC-QTOF-MS分析

本研究整個分析過程樣品盤溫度始終為4 ℃，通過超高效液相色譜系統(tǒng)的液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離，分離結束后使用Thermo Q Exactive Orbitrap 質譜儀進行一級、二級質譜數(shù)據(jù)采集。色譜分離時進樣體積為2 μL，柱溫為25 ℃，流動相流速為0.5 mL·min-1；液相色譜A相為水相，含25 mmol·L-1乙酸銨和25 mmol·L-1氨水；B相為乙腈，采用梯度洗脫。質譜參數(shù)如下：氣體溫度為250 ℃；氣流為16 L·min-1；鞘氣溫度為350 ℃；鞘氣流量為12 L·min-1；霧化器為20 psi；碎裂機為175 V；毛細管電壓為3 000 V。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

使用ProteoWizard軟件將質譜原始數(shù)據(jù)轉成mzXML格式，進一步采用XCMS 程序進行峰對齊、保留時間校正和峰面積提取。刪除組內缺失值超過50%的離子峰面積數(shù)據(jù)，而缺失值未超過50%的離子峰面積數(shù)據(jù)按最小值的二分之一進行填充。然后使用SIMCA-P14.1軟件對預處理后的數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，主要包括無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis, PCA)和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)。PCA用于確定組內聚集和組間分離趨勢，而OPLS-DA用于進一步確定組間差異。使用PCA和OPLS-DA模型反映A、B兩組樣品代謝輪廓的變化，經(jīng)過7次循環(huán)交互驗證得到模型解釋率(R2Y)和模型預測率(Q2)，當R2Y和Q2大于0.4，Q2intercept<0時，認為模型穩(wěn)定可靠。然后采用T檢驗及差異倍數(shù)分析對VIP(variable importance in the projection)>1的代謝物進行統(tǒng)計分析，結果用P值表示，P<0.05說明差異顯著。

1.6 差異代謝物的鑒定分析

差異代謝物的鑒定采用精確質量數(shù)匹配(<25 ppm)與二級譜圖匹配相結合的方式，檢索對比在線HMDB(http://www.hmdb.ca)、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)和 METLIN(http://metlin.scripps.edu/)數(shù)據(jù)庫；然后使用牛代謝組學數(shù)據(jù)庫(DMDB, http://www.cowmetdb.ca/)進行比對和校正。使用MetaboAnalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca)和Origin8.0軟件中的ROC曲線對已經(jīng)鑒定的差異代謝物進行聚類分析和分類識別。

2 結 果

2.1 血漿樣品代謝譜及數(shù)據(jù)分析

分別將QC樣本在正、負離子檢測模式下的總離子流圖(TIC)進行譜圖疊加比較，結果顯示，在正、負離子模式下QC樣品TIC圖的保留時間和信號強度都基本重疊，說明在整個試驗過程中儀器誤差帶來的變異很小，測得的數(shù)據(jù)質量可靠。

由PCA得分圖(圖1)可知，A和B兩組樣品之間沒有呈明顯的分離趨勢，正負離子模式下AvsB組之間的模型解釋率(R2X)分別為0.433和0.518。進一步使用有監(jiān)督正交偏最小二乘法來評估A、B兩組間的樣本差異，正負離子模式下AvsB 組OPLS-DA得分圖(圖2)的R2Y和Q2參數(shù)分別為0.941、-0.064和0.936、-0.268；AvsB 組Q2<0.4，說明這兩組構建的模型預測能力偏低，R2X和R2Y均>0.4，說明從人工授精后奶牛血漿代謝物發(fā)生了改變。為驗證OPLS-DA模型是否存在過擬合，采用200次排序檢驗對OPLS-DA模型進行驗證，正負離子模式下的Q2intercept分別為-0.192和-0.260，Q2intercept均<0，說明OPLS-DA 模型未過度擬合，OPLS-DA 模型可靠有效。

圖1 正(a)、負(b)離子模式下PCA-X得分圖

圖2 正(a)、負(b)離子模式下OPLS-DA得分圖

2.2 兩組樣品差異代謝物的篩選與鑒定結果

根據(jù)OPLS-DA模型得到的VIP值初步篩選出對兩組有分類識別能力的代謝物，然后對VIP>1的代謝物進行單因素方差分析，再篩選出P<0.05、差異倍數(shù)(fold change, FC)>1.5或FC<0.67的差異代謝物，共篩選出18種滿足條件的差異代謝物，見表1。然后使用MetaboAnalyst 5.0(http://www.metaboanalyst.ca)對這18種候選代謝物進行聚類分析，由圖3可知，除個別樣品外，A、B兩組樣品基本上呈分離趨勢。進一步采用Origin8.0軟件中的ROC曲線篩選出8種AUC>0.8的代謝物，每種代謝物的AUC值見表1。

圖3 人工授精后第17天A、B兩組代謝物聚類分析熱圖

表1 已鑒定差異代謝物

3 討 論

有研究報道，妊娠母牛的胚胎植入前組織液中均發(fā)現(xiàn)甘氨酸濃度升高，并顯著高于其它氨基酸[13]。甘氨酸是妊娠期間DNA甲基化和蛋白質合成所必需的一碳來源[14]。隨著妊娠時間增長，甘氨酸由母體不斷向孕體供給，以滿足胚胎細胞分裂和生長發(fā)育的需求[15-16]。此外，甘氨酸還是天然的滲透壓調節(jié)劑，當細胞被滲透壓脅迫時，甘氨酸能對細胞起到保護作用。維持細胞形態(tài)和功能，減輕滲透壓的損傷，使細胞在不利的環(huán)境條件下仍然能夠正常生長和增殖[17]。由于早期胚胎在輸卵管內需要積累大量的甘氨酸來維持滲透壓，因此甘氨酸對維持早期胚胎滲透壓和胚胎體積正常有重要的調節(jié)作用，它能夠避免滲透壓變化導致的發(fā)育停滯現(xiàn)象，目前甘氨酸已是早期胚胎體外培養(yǎng)液中創(chuàng)造類似體內輸卵管環(huán)境的重要成分之一[18-19]。因此，甘氨酸對早期胚胎發(fā)育至關重要，隨著妊娠進行，胚胎對甘氨酸的需求量不斷增加。本研究發(fā)現(xiàn)授精第17天血漿中妊娠組的甘氨酸含量顯著高于未妊娠返情組，這可能是由于母體妊娠需要大量的甘氨酸來滿足胚胎發(fā)育所致。

脯氨酸是合成蛋白質、精氨酸和多胺(精胺、亞精胺和腐胺)的功能性氨基酸之一。通過激活mTOR信號通路促進孕體蛋白質合成和胚胎干細胞分化[20]。脯氨酸是DNA合成、細胞增殖和分化的關鍵調控因子，參與妊娠豬和綿羊的胎盤發(fā)育[21]。脯氨酸在鳥氨酸脫羧酶、鳥氨酸轉氨酶和脯氨酸氧化酶的作用下合成多胺[22]，參與調節(jié)妊娠期間蛋白質的合成以及多胺和一氧化氮的水平[23]。有研究表明，胎盤中的多胺和一氧化氮水平在妊娠初期達到最高[24]，而且胎盤發(fā)育與羊水中脯氨酸和多胺的濃度呈正相關，也就是說，脯氨酸和多胺水平越高，越有利于胎盤發(fā)育[25]。說明脯氨酸在胎盤生長發(fā)育中起重要作用。本研究也得到一樣的結果，即第17天妊娠組脯氨酸的含量顯著高于未妊娠返情組，說明妊娠早期需要大量的脯氨酸和多胺來促進胎盤形成和發(fā)育。因此，妊娠期間補充脯氨酸可以改善多胺的合成，促進胚胎發(fā)育和生長。

肌氨酸是一種天然存在的氨基酸化合物，在骨骼肌、大腦和睪丸中均有存在。它主要參與機體能量代謝，并且還可以作為妊娠期間的能量緩沖劑，保護胚胎大腦免受缺氧缺血的傷害[26]。妊娠期間母體處于一種高強度的代謝狀態(tài)，母體需要充足的營養(yǎng)和氧氣為胎盤發(fā)育提供良好的條件。肌氨酸通過肌酸轉運蛋白主動轉運到組織中，并且大部分在細胞內被磷酸化為磷酸肌酸，在能量需求高的組織中將二磷酸腺苷再生為三磷酸腺苷(ATP)，維持ATP的可用性[27-28]。子宮血流量減少導致胎盤供血不足會嚴重影響胎盤內ATP的穩(wěn)態(tài)，會誘發(fā)胚胎生長受限等一系列疾病[29]。肌氨酸和肌酸激酶之間的相互轉化是無氧條件下產生ATP的方法[30]。胎盤的肌氨酸需求一直依靠母體供給直到妊娠晚期[31]，妊娠后期給母體補充肌氨酸不但可以改善胚胎存活率，而且還能防止器官受損[32-33]。在妊娠期間外源性的補充肌氨酸能夠保護胎兒大腦免受因缺氧缺血、興奮性中毒或氧化應激等相關傷害，并且不會對胚胎或母體造成傷害[34]。因此，妊娠期間補充肌氨酸更有利于胎盤保持代謝穩(wěn)態(tài)，確保胚胎健康發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，人工授精第17天的妊娠組肌氨酸含量顯著高于未妊娠返情組，這可能與早期胚胎發(fā)育密切相關。

纈氨酸是支鏈氨基酸中運輸效率最高的一種機體必需氨基酸，它在調節(jié)蛋白合成、細胞增殖和信號通路激活等方面發(fā)揮重要作用[35]。有研究報道，母豬從妊娠到分娩，機體對乳腺蛋白的需求逐漸增加[36]。纈氨酸可以經(jīng)過轉氨基作用和氧化脫羧脫氫后進入三羧酸循環(huán)提供能量，并為乳腺合成乳蛋白提供底物[37]。也可衍生成谷氨酸，被酰胺化或者轉胺化生成谷氨酰胺，合成丙氨酸、天門冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸和多胺[38]。而谷氨酰胺和多胺是胎盤生長發(fā)育和血管形成的必需物質，它們不但是組織蛋白的基本成分，而且還能刺激DNA的合成，促進胎盤中的血管生長，進而改善胚胎存活與發(fā)育[39]。而本研究發(fā)現(xiàn)，授精后第17天妊娠組中纈氨酸-蛋氨酸的含量顯著高于未妊娠返情組，這可能與早期胎盤血管形成和生長發(fā)育有關。

4 結 論

本試驗運用UHPLC-QTOF-MS代謝組學方法對人工授精后第17天妊娠組和未妊娠返情組奶牛血漿代謝物及變化趨勢進行研究。丙氨酸-亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸、L-正亮氨酸、DL-苯丙氨酸、肌氨酸、吡咯-2-羧酸和纈氨酸-蛋氨酸8種代謝物有望成為妊娠早期識別奶牛妊娠狀態(tài)的候選生物標志物。