張貝貝，李夢(mèng)霄，馬騰壑，2*，李雪男，魏佳榮，康國(guó)磊，王紅娜，劉 超，王 斌，孫研研

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，邯鄲 056038；2.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，邯鄲 056038；3.河北天凱食品有限責(zé)任公司，沙河 054100；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖(家禽)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

卵泡抑素(follistatin,FST)于1987年被Ueno 等[1]首次從卵巢卵泡液中發(fā)現(xiàn)，并證明其能抑制垂體前葉的卵泡刺激素分泌。FST以糖蛋白的形式廣泛存在于血清和組織，被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員的天然抑制劑，其存在形式為單體多肽，可產(chǎn)生分子量為31～42 ku的生物活性蛋白，包括肌肉生長(zhǎng)抑素和激活素[2-4]。大量研究表明，F(xiàn)ST在哺乳動(dòng)物的組織和器官中廣泛表達(dá)，如卵巢、皮膚和骨骼肌[5-6]，F(xiàn)ST是卵巢顆粒細(xì)胞的特異性基因之一，已被確定為小鼠早孕建立所必需的基因，可能在卵泡發(fā)生及黃體形成過(guò)程中起作用[7-10]。Qin等[11]通過(guò)對(duì)雞卵泡發(fā)育過(guò)程的研究表明FOXL2與激活素A、GDF9或FST共同參與FSHRmRNA表達(dá)和顆粒細(xì)胞增殖的復(fù)雜機(jī)制。另外，Wasti等[12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ST在蛋雞子宮組織的腔和腺上皮中表達(dá)，且對(duì)蛋殼礦化產(chǎn)生影響。FST序列已經(jīng)在綿羊、豬、馬及魚中被克隆，并利用表達(dá)載體研究了其功能。何新等[13]克隆了豬FSTcDNA，獲得了完整的豬FSTcDNA編碼序列，獲得63 ku的蛋白表達(dá)載體，并表明其在大腸桿菌中以谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白的形式表達(dá)卵泡抑素蛋白。Pang等[14]克隆了鰱魚的FST基因(HynFST)，并進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)HynFSTcDNA含有一個(gè)2 134 bp的ORF片段，編碼349個(gè)氨基酸，HynFST在大多數(shù)發(fā)育階段和各種組織中均有表達(dá)，并在卵巢表達(dá)水平最高。Yang等[15]克隆并分析了大黃魚FST基因5′側(cè)翼區(qū)的部分序列。Ni等[16]克隆了葡萄牙牡蠣FST的全長(zhǎng)cDNA，共1 297 bp，編碼241個(gè)氨基酸，證明FST可能通過(guò)自分泌信號(hào)在牡蠣卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用。張寧等[17]從綿羊卵巢RNA中擴(kuò)增出1 038 bp的FST全長(zhǎng)cDNA序列，并通過(guò)SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)到66 ku的FSTcDNA表達(dá)產(chǎn)物。另外，有研究人員從馬卵巢cDNA文庫(kù)中分離到編碼馬FST的cDNA克隆，表明FST在馬不同組織中均有表達(dá)，且對(duì)維持妊娠有重要作用[18]。雖已證明FST在多種生物的不同組織器官中發(fā)揮作用，更是卵巢發(fā)育所必須的基因[19]，然而，目前尚沒(méi)有關(guān)于雞FST基因序列信息和功能的研究報(bào)道。

太行雞是河北省首個(gè)通過(guò)國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)認(rèn)定的地方品種，蛋肉品質(zhì)優(yōu)良，但產(chǎn)蛋量較低。本試驗(yàn)以太行雞為研究對(duì)象，克隆FST基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)基因功能，并在此基礎(chǔ)上通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究該基因在各個(gè)組織及不同發(fā)育階段卵泡的表達(dá)水平，以期為進(jìn)一步探究FST基因的調(diào)控功能、改善地方品種太行雞的產(chǎn)蛋性能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物選自河北天凱食品有限責(zé)任公司太行雞保種基地，選用相同的飼糧水平和飼養(yǎng)條件下進(jìn)行單籠飼養(yǎng)的43周齡麻羽太行母雞。

1.2 試劑

PCR反應(yīng)相關(guān)試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒均由江蘇諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)，pMD19-T Vector 由TaKaRa Bio公司生產(chǎn)，RNA提取試劑盒由北京艾德萊生物科技有限公司生產(chǎn)，氨芐青霉素由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由上海生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn)，質(zhì)粒小提取試劑盒由天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)NCBI 網(wǎng)站原雞(Gallusgallus)FST基因(NM_205200.1)的CDS序列，用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)編碼區(qū)擴(kuò)增引物。上游引物P1-F：5′-ATGTTAAATCAGAGGATCCACCC-3′；下游引物 P1-R：5′-ACCACTCTAGAATGGAAGATATAGGA-3′。引物由上海生工生物股份有限公司合成。熒光定量PCR引物P2-F: 5′-CTTATCCGAGCGAGTGTGCCATG-3′; P2-R: 5′-TCCTCTTCTTCCTCTGGGTCTTCG-3′，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3.2 組織總RNA的提取及cDNA合成 選擇5只健康的太行雞(43周齡)，頸靜脈采血，在屠宰后快速采集心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢樣品，參照郭曉莉[20]文中所述，分離卵巢中小白卵泡(small white follicles, SWF,直徑<3 mm)、大白卵泡(large white follicles, LWF, 直徑3～5 mm)、小黃卵泡(small yellow follicles, SYF, 直徑6～8 mm)和大黃卵泡(large yellow follicles, LYF, 直徑9～12 mm)及等級(jí)卵泡：F6、F5、F4、F3、F2和F1卵泡。將采集到的所有組織用液氮冷凍后，置于-80 ℃保存，備用。

采用RNA提取試劑盒提取所采集太行雞組織的總RNA，提取完成后使用超微量分光光度計(jì)及凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)RNA的濃度及完整性，利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康為世紀(jì)，中國(guó))將得到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄總體系為 20 μL：RNA模板1 μL，10×gDNA Eraser Buffer 1 μL，gDNA Eraser 0.5 μL，DEPC-ddH2O 12.5 μL，5×Script RT Buffer 4 μL，HiFi Script(200 U·μL-1)0.5 μL，Primer Mix(10 μmol·L-1)0.5 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 孵育15 min，85 ℃ 滅活5 min。將cDNA模板放到-20 ℃冰箱保存，備用。

1.3.3FST基因PCR擴(kuò)增、克隆測(cè)序 以合成的 cDNA 第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，2×Taq Plus Master MixII 10 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃變性30 s，61 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR產(chǎn)物直接與pMD19-T Vector載體4 ℃恒溫連接過(guò)夜，利用熱激法轉(zhuǎn)至大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鋪板挑單克隆培養(yǎng)，根據(jù)菌液PCR產(chǎn)物大小驗(yàn)證載體連接情況，菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用SeqMan軟件比對(duì)拼接，獲得太行雞FST基因完整的CDS序列。

1.3.4FST基因的生物信息學(xué)分析FST基因的電子翻譯采用DNAstar軟件的Editseq工具完成。利用NCBI中的ORF Finder程序?qū)ふ褾ST完整開(kāi)放閱讀框；將測(cè)序獲得的太行雞FST基因CDS區(qū)的氨基酸序列與日本鵪鶉(NP_001310120.1)、盔珠雞(XP_021236409.1)、虎皮鸚鵡(XP_005152012.1)、獵隼(XP_005443976.1)、黑胸山蜂鳥(NXU70976.1)、大杜鵑(XP_009554129.1)、野鴿(XP_005500938.1)、幾維鳥(XP_025918523.1)、白腰文鳥(XP_021409534.1)、金絲雀(XP_030093406.1)和白喉雀(XP_005490721.1)的FST基因序列進(jìn)行同源性分析。利用在線軟件(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)FST蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用Expasy-Protscale軟件預(yù)測(cè)FST蛋白的親疏水性，使用SignalP 5.0軟件預(yù)測(cè)FST蛋白的信號(hào)肽，采用NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)FST的N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)，用NetPhos 3.1 Server 軟件預(yù)測(cè)太行雞FST的磷酸化位點(diǎn)；運(yùn)用在線分析軟件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，利用在線服務(wù)器ExPASy中的PSORT Prediction程序進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用NCBI CD的CD-Search工具對(duì)FST蛋白進(jìn)行蛋白保守域預(yù)測(cè)；使用NPSA預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)平臺(tái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3.5FST基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析 以太行雞心、肝、脾、肺、腎、卵巢和肌肉7種組織及不同時(shí)期卵泡的cDNA為模板，P2-F/R為引物，GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green I 染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，對(duì)FST基因在不同組織及不同發(fā)育時(shí)期卵泡中的表達(dá)量進(jìn)行分析。RT-qPCR反應(yīng)總體系為20 μL：上、下游引物各0.5 μL，SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。反應(yīng)結(jié)束后，分析熔解曲線，檢測(cè)引物特異性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)2-△△Ct法[21]計(jì)算太行雞不同組織中FST基因的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參，分別以肝和卵巢組織中的表達(dá)量為對(duì)照，用SPSS 20.0軟件中的一般線性模型分析不同組織及發(fā)育時(shí)期卵泡中基因的表達(dá)量差異，以P<0.05表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 FST基因的克隆

以cDNA為模板PCR擴(kuò)增FST基因，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一、清晰，片段大小與預(yù)期結(jié)果相符。將PCR產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒，菌液PCR驗(yàn)證，得到片段大小與預(yù)期一致(圖2)，測(cè)序結(jié)果證實(shí)其編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1 032 bp，大小與預(yù)期一致。

圖1 太行雞FST基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 pMD-19T-FST菌液PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 FST蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1 FST同源性比對(duì)分析 序列分析發(fā)現(xiàn)，在104～1 135 bp處存在完整開(kāi)放閱讀框，長(zhǎng)為1 032 bp，編碼343個(gè)氨基酸。測(cè)序結(jié)果同NCBI發(fā)表的基因序列進(jìn)行氨基酸同源性比對(duì)分析表明，太行雞FST基因與原雞基因(登錄號(hào)：NP_990531.1)氨基酸序列同源性為100.0%，與日本鵪鶉FST的同源性為99.7%，與盔珠雞同源性為99.4%，與虎皮鸚鵡和獵隼同源性為98.3%，與黑胸山蜂鳥和大杜鵑同源性為98.0%，野鴿和幾維鳥同源性為97.7%，與白腰文鳥、金絲雀和白喉雀同源性為97.4%(圖3)。

圖3 不同物種間FST基因編碼氨基酸同源性分析

2.2.2 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 采用NJ(neighor-jioning)法，通過(guò)Mega7.0 軟件構(gòu)建FST蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，設(shè)定為Kimura2-parameter model，重復(fù)次數(shù)1 000次，結(jié)果如4圖，太行雞與原雞、日本鵪鶉、盔珠雞先聚在一起，再與幾維鳥聚在一起，然后與大杜鵑聚在一起，再與野鴿聚在一起。表明太行雞與原雞、日本鵪鶉、盔珠雞的親緣關(guān)系最接近。

圖4 太行雞FST系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

2.2.3 氨基酸序列理化性質(zhì)分析 利用在線網(wǎng)站ExPASy(https：//web.expasy.org/protparam/)分析太行雞FST蛋白理化性質(zhì)，蛋白的分子式為C1619H2567N459O520S44，蛋白的分子量為38.192 6 ku，共編碼343個(gè)氨基酸，理論等電點(diǎn)為5.59，其中含量較高的氨基酸有Cys(C)(10.50%)、Glu(E)(8.50%)和Lys(K)(8.20%)，含量較少的是His(H)(1.50%)；帶正電荷的殘基總數(shù)(精氨酸+賴氨酸)(Arg + Lys)42個(gè)，帶負(fù)電的殘基總數(shù)(天冬氨酸+谷氨酸)(Asp + Glu)48個(gè)。半衰期為：在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外表達(dá)為30 h；在酵母體內(nèi)表達(dá)為20 h以上；在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)為10 h以上。其不穩(wěn)定系數(shù)為42.76，證明其為不穩(wěn)定蛋白。

2.2.4 蛋白疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域分析 親疏水性分析表明，F(xiàn)ST蛋白的親水性氨基酸多于疏水性氨基酸。預(yù)測(cè)FST蛋白的總平均親水性(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.498，由于GRAVY值的范圍為-2～2，正值表明此蛋白為疏水蛋白，負(fù)值表明為親水蛋白，所以FST蛋白為親水蛋白(圖5)。

圖5 太行雞FST蛋白疏水性分析

運(yùn)用在線分析軟件 TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)，顯示該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)(圖6)。

圖6 太行雞FST蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.5 蛋白質(zhì)信號(hào)肽和糖基化位點(diǎn)分析 采用在線軟件SignalP 5.0預(yù)測(cè)FST蛋白潛在的信號(hào)肽，其Sec信號(hào)肽(Sec/SPI)概率分值為0.995 5(圖7)，表明太行雞FST蛋白存在Sec信號(hào)肽。

圖7 太行雞FST蛋白信號(hào)肽

FST蛋白N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，第123和287位氨基酸處存在潛在的N-糖基化位點(diǎn)(圖8)。潛力值分別為0.644 0、0.516 4，均大于閾值0.5。另外，在57、61、65、176、183、199、285、314、327處發(fā)現(xiàn)了O-糖基化位點(diǎn)。

圖8 太行雞FST蛋白N-糖基化位點(diǎn)

2.2.6 蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析 FST蛋白存在46個(gè)潛在的磷酸位點(diǎn)，分別為第21個(gè)絲氨酸、15個(gè)蘇氨酸和10個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，潛力值均大于0.5(圖9)。

圖9 太行雞FST蛋白磷酸化位點(diǎn)

2.2.7 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用在線服務(wù)器 PSORT WWW Server中的PSORT II Prediction程序進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，K/NN預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，太行雞FST蛋白主要定位于細(xì)胞核(52.2%)，其他定位于線粒體(26.1%)、細(xì)胞質(zhì)(4.3%)、液泡(4.3%)、細(xì)胞骨架(4.3%)和細(xì)胞外(包括細(xì)胞壁)(8.7%)。

2.2.8 蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 利用在線軟件HMME R預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，太行雞FST蛋白在93～116、166～189、243～267 位3處氨基酸片段間均存在1個(gè) 卵泡抑素-N-末端結(jié)構(gòu)域樣(FOLN 結(jié)構(gòu)域)，在116～163、190～238、268～315 位3處氨基酸片段間均存在1個(gè)Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域(KAZAL_FS 結(jié)構(gòu)域)，預(yù)測(cè)太行雞FST蛋白與SNN、INHBA、MSTN、BMP4等蛋白質(zhì)相互作用，結(jié)果如圖10所示。

A.FST蛋白保守結(jié)構(gòu)域示意圖；B.預(yù)測(cè)FST蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.9 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用在線軟件NPS@:NetworkProteinSequenceAnalysis對(duì)太行雞FST蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖11)，56個(gè)氨基酸參與α-螺旋，占比為16.33%；57個(gè)氨基酸參與氨基酸殘基構(gòu)成的延伸鏈，占比為16.62%；18個(gè)氨基酸參與β轉(zhuǎn)角，占比為5.25%，212個(gè)氨基酸參與無(wú)規(guī)卷曲，占比為61.81%。由此說(shuō)明，在太行雞FST蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)卷曲是主要的結(jié)構(gòu)形式。

圖11 太行雞FST蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2.10 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用在線軟件SWISS-MODEL的自動(dòng)建模功能，對(duì)太行雞FST蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，三維模型見(jiàn)圖12。用于建立該模型的氨基酸殘基范圍為29～326位，該模型以5jhw.1(Crystal Structure of the GDF11:Follistatin288 complex)蛋白為模板，序列同源性為93.06%。

圖12 太行雞FST蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.3 太行雞FST基因在不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

2.3.1FST基因在不同組織中的表達(dá) 如圖13所示，F(xiàn)ST基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉及卵巢中均有表達(dá)，且在各組織中的表達(dá)量存在顯著差異(P<0.05)。FST在肝中表達(dá)最豐富，其次是脾、肺和腎，在心、卵巢和胸肌表達(dá)水平較低。統(tǒng)計(jì)分析表明，F(xiàn)ST基因在肝與脾組織中表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，但顯著高于卵巢、心、肺、腎和胸肌(P<0.05)。

相同字母表示無(wú)顯著性差異(P>0.05)，不同字母表示存在顯著差異(P<0.05)，下同

2.3.2FST基因在不同發(fā)育階段卵泡中的表達(dá)FST基因在卵巢中的表達(dá)量較低，卵泡發(fā)育至大白卵泡(3～5 mm)過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，并達(dá)到峰值；之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在小黃卵泡(6～8 mm)向大黃卵泡(9～12 mm)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量明顯減少，并存在1.6倍差異(小黃卵泡平均差異倍數(shù)：22.03；大黃卵泡平均差異倍數(shù)：13.75)。在F5卵泡中小幅度升高后，在F4～F1發(fā)育過(guò)程中一直維持在相對(duì)較低的水平。統(tǒng)計(jì)分析表明，F(xiàn)ST基因在大白卵泡中的表達(dá)量顯著高于其它發(fā)育時(shí)期卵泡(P<0.05)；另外，該基因在卵泡選擇前的小黃卵泡中表達(dá)水平與F3～F1階段存在顯著差異(P<0.05)(圖14)。

SWF.小白卵泡；LWF.大白卵泡；SYF.小黃卵泡；LYF.大黃卵泡。等級(jí)卵泡由小到大依次為F6～F1表示

3 討 論

太行雞是國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì)審定的第一個(gè)河北省地方家禽品種。其雞蛋品質(zhì)好，耐粗飼[22]，但產(chǎn)蛋性能低，500天產(chǎn)蛋數(shù)為160～180枚，影響規(guī)模化養(yǎng)殖效益，故在育種中著重研究如何提高其產(chǎn)蛋性能具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn)以太行雞為研究對(duì)象，成功獲得FST基因外顯子克隆拼接后的完整CDS區(qū)序列，對(duì)該序列結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到FST基因CDS區(qū)片段長(zhǎng)度1 032 bp，編碼343個(gè)氨基酸，該結(jié)果與Connolly等[23]在雛雞中的研究結(jié)果相同，另外，劉賀賀等[24]在鴨中同樣克隆出1 032 bpFST基因CDS區(qū)，但與其它物種該基因開(kāi)放閱讀框并不相同。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及同源性分析，表明太行雞FST基因與日本鵪鶉和盔珠雞的同源性較高(>99%)，與野鴿等其他鳥類同源性在95%以內(nèi)，說(shuō)明該基因在鳥類中高度保守，可能發(fā)揮相似的功能。

Jiao等[25]和Luo等[26]通過(guò)免疫組織化學(xué)分析證實(shí)了豬的骨骼肌、脂肪組織、心肌、肝、脾、肺和腎中均有FST基因表達(dá)。這與本研究相似，本試驗(yàn)證明，F(xiàn)ST基因在太行雞各組織中均有表達(dá)，其中在肝、脾、腎中高表達(dá)。已有研究顯示，F(xiàn)ST可誘導(dǎo)完整的肝細(xì)胞增殖[27]，F(xiàn)ST體外和體內(nèi)試驗(yàn)均顯示，該基因可獨(dú)立于其激活素發(fā)揮中和作用，通過(guò)中和活性氧和抑制氧化應(yīng)激來(lái)保護(hù)TG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[28]。雖然本試驗(yàn)中FST基因在心和肌肉中的表達(dá)量不高，但大量研究顯示，該基因在心及肌肉組織中發(fā)揮著重要作用，Van Den Berg等[29]指出，F(xiàn)ST在發(fā)育中瓣膜上覆蓋的心內(nèi)膜高度定位表達(dá)，表明其在瓣膜形成中發(fā)揮作用。此外，F(xiàn)ST在肌肉發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[30]。過(guò)表達(dá)FST的轉(zhuǎn)基因虹鱒魚表現(xiàn)出肌肉發(fā)達(dá)的現(xiàn)象[31]，更有研究指出，F(xiàn)ST有可能成為促進(jìn)農(nóng)業(yè)動(dòng)物骨骼肌生長(zhǎng)和治療人類骨骼肌萎縮性疾病的潛在藥物[32]，但是本研究中FST在肌肉中的表達(dá)量不高，這可能是由于物種間的差異，也可能是由于所選時(shí)期不是肌肉發(fā)育高峰期造成的。

雖然FST基因在太行雞卵巢組織中表達(dá)量較低，但其在卵巢中發(fā)揮的重要作用不容忽視。目前的研究表明，在成年卵巢中，垂體FSH通過(guò)與其受體(FSHR)相互作用是卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖和分化所必需的[33-34]。Xu等[35]對(duì)牦牛在非繁殖季節(jié)卵巢組織中FST的表達(dá)分析顯示，其表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；Li等[36]研究了FST在促進(jìn)豬早期胚胎發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)不同F(xiàn)ST亞型產(chǎn)生效果并不相同，F(xiàn)ST-300可以促進(jìn)初始卵裂時(shí)間并提高胚泡形成率，而FST-315可以提高胚泡質(zhì)量。FST是卵泡發(fā)育中不同階段卵泡分化的關(guān)鍵介質(zhì)之一；可通過(guò)調(diào)節(jié)FSH的分泌和嚙齒動(dòng)物性腺的活動(dòng)、雄激素的產(chǎn)生和妊娠，在生殖過(guò)程中發(fā)揮作用[37]。鑒于FST基因在卵泡發(fā)育過(guò)程中的重要作用，本研究對(duì)太行雞不同發(fā)育時(shí)期卵泡中FST的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在大白卵泡(LWF)中表達(dá)量最高，且在卵泡選擇前后的小黃卵泡、大黃卵泡中表達(dá)量有1.6倍的差異。Qin等[38]在馬崗鵝中的研究提到，血液中抑制素和卵泡抑素的持續(xù)存在可能會(huì)抑制馬崗鵝產(chǎn)蛋后新的SYF重新進(jìn)入排卵前的LYF發(fā)育。此外，在產(chǎn)卵過(guò)程中，一些大量存在于血液循環(huán)中的激素，由于抑制素和FST抵消了激活素從而促進(jìn)小卵泡發(fā)育[39]。Moros-Nicols等[40]研究顯示，F(xiàn)ST在豬小卵泡(<3 mm)的卵母細(xì)胞和周圍卵丘細(xì)胞(CCS)的轉(zhuǎn)錄豐度高于中等卵泡(3～6 mm)CCS；但Costermans等[41]提出，F(xiàn)ST在不同大小直徑卵泡的CCS中轉(zhuǎn)錄豐度無(wú)顯著差異。Owens等[42]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ST在人小竇卵泡顆粒細(xì)胞(GC)表達(dá)量顯著高于大的黃素化卵泡GC；Xia等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在布氏母羊黃體晚期卵泡液和卵巢血中FST濃度升高，表明FST對(duì)現(xiàn)有功能黃體的黃體溶解和新卵泡隊(duì)列的發(fā)育具有雙重作用。有趣的是，在雌激素激活的牛卵泡顆粒細(xì)胞大卵泡中，F(xiàn)ST基因互作網(wǎng)絡(luò)上MSTN的mRNA在顆粒細(xì)胞(GC)中的表達(dá)最低，而GCFST在這一階段的表達(dá)最高[44]。本研究顯示，太行雞FST在3～5 mm卵泡中表達(dá)量最高，且在F3～F1這一時(shí)期卵泡中穩(wěn)定表達(dá)，與Qin等[11]在雞上的研究結(jié)果基本一致，他們的研究顯示，雞FSTmRNA在4～8 mm和9～12 mm卵泡中表達(dá)水平最高。但是，Lovell等[39]在蛋雞上的研究顯示，在4～5 mm卵泡的G層未檢測(cè)到FST，而在5～6 mm 的卵泡中可檢測(cè)到FST，G層FST含量在小幅升高后下降，并一直維持在這一相對(duì)較低的水平至F1。通過(guò)免疫組織化學(xué)方法研究FST在大鼠組織中的定位發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ST的表達(dá)強(qiáng)度隨著卵泡的發(fā)育而變化，F(xiàn)ST的表達(dá)在排卵前卵泡的發(fā)育過(guò)程中起重要作用，但在排卵后它的表達(dá)會(huì)降低，從而形成黃體[45]。本研究得到的結(jié)果與前人結(jié)果部分一致，驗(yàn)證了FST基因在太行雞不同發(fā)育時(shí)期卵泡中的表達(dá)差異，推測(cè)該基因在太行雞產(chǎn)蛋過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，進(jìn)一步證明該基因?qū)μ岣咛须u產(chǎn)蛋量有調(diào)控作用，是研究太行雞繁殖性能的重要候選基因之一。

4 結(jié) 論

太行雞FST基因CDS序列全長(zhǎng)1 032 bp，共編碼343個(gè)氨基酸，該基因在禽類中高度保守。FST基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉、卵巢等組織中均有表達(dá)，且在肝中表達(dá)量最高。卵泡選擇過(guò)程中FST表達(dá)存在1.6倍差異，表明該基因是雞產(chǎn)蛋量的重要候選基因，對(duì)繁殖性能的選育提高有積極作用。