張武君, 劉保財(cái), 陳菁瑛, 趙云青, 黃穎楨, 程遠(yuǎn)航

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心，福建 福州 350003)

馬藍(lán)[Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek.]為爵床科多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)華東、華南及西南地區(qū)，其葉干燥后可做南大青葉使用；莖、葉加工炮制成中藥材青黛，具有清熱解毒、涼血消斑和瀉火定驚的功效；根莖和根可作為南板藍(lán)根入藥[1]。馬藍(lán)葉的主要藥效成分為靛玉紅、靛藍(lán)、吲哚苷、靛紅等吲哚類生物堿和色胺酮等喹唑啉類生物堿。靛玉紅臨床可用于治療慢性粒細(xì)胞白血病[2]；靛藍(lán)既可作染料又具有抗紫外線、抗氧化、抗菌消炎等作用[3]；色胺酮具有較強(qiáng)的抑菌作用，也有一定的抗炎作用[4]。當(dāng)前對(duì)馬藍(lán)的研究主要集中在藥效成分形成與積累的分子機(jī)制上[5-6]，有關(guān)栽培生境的研究較少。寧書(shū)菊等[7]比較了3種光照強(qiáng)度對(duì)馬藍(lán)光合特性的影響，發(fā)現(xiàn)30%自然光照下的間作套種或林下栽培有利其生長(zhǎng)。覃軍等[8]比較了全陰、半陰、露地條件下馬藍(lán)的生長(zhǎng)和靛玉紅含量，發(fā)現(xiàn)全陰及半陰條件更適宜馬藍(lán)的種植。

福建省仙游縣書(shū)峰鄉(xiāng)為高品質(zhì)青黛的道地產(chǎn)區(qū)，馬藍(lán)栽培和青黛加工已有800多年歷史，所產(chǎn)青黛質(zhì)量居同類產(chǎn)品之冠，素有“建青黛”美稱，為福建省大宗道地藥材之一[9]。本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)主要在山間田地或林下套種馬藍(lán)，以陽(yáng)生和半陰生為主，少量種植于坡底或密林下形成的陰生生境中。栽培生境中的光照強(qiáng)度以及當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的種植方式是影響馬藍(lán)栽培和青黛品質(zhì)的主要因素。陳文其[10]認(rèn)為，“建青黛”品質(zhì)優(yōu)良有賴于其植物基原爵床科馬藍(lán)獨(dú)特的栽培生境及近千年的人工馴化栽培。有關(guān)仙游縣書(shū)峰鄉(xiāng)不同栽培生境下馬藍(lán)植株的生理及藥效成分差異尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究比較了書(shū)峰鄉(xiāng)3種栽培生境下馬藍(lán)葉片形態(tài)、生理與藥效成分等的差異，探究影響其生理及藥效成分含量的因素，旨在為書(shū)峰鄉(xiāng)馬藍(lán)的生態(tài)栽培和青黛產(chǎn)量品質(zhì)的提升提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試馬藍(lán)為2018年越冬的植株在2019年生發(fā)的新枝，種植于仙游縣書(shū)峰鄉(xiāng)四黃村(118°39′79″E,25°26′51″N)，海拔400 m左右。該地屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，全年無(wú)霜期340 d，年平均氣溫16～28 ℃，年平均降雨量1 700～2 400 mm，土層深厚，土壤肥沃，水源清澈、無(wú)污染。本試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生境，每個(gè)生境種植3個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積10 m2，每小區(qū)種植100株，株行距30 cm×30 cm，種植和田間管理按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)進(jìn)行。3個(gè)栽培生境如下。①陽(yáng)生：種植在山間田地，上午100%自然光照，午后有高山陰影遮蓋，幼苗期或采收后用稻草在距畦面約30 cm高處搭蓋遮陰，隨著植株長(zhǎng)高，稻草自然干枯掉落，采樣時(shí)已無(wú)遮陰；②半陰生，種植在桉樹(shù)林下，40%左右自然光照；③陰生：種植在背陰坡林下，3%～5%自然光照。參照陳宗樑等[11]的采收要求，于2019年7月30日進(jìn)行第1次采樣； 9月30日即當(dāng)年最后一次收割時(shí)進(jìn)行第2次采樣。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 形態(tài)與生理指標(biāo) 各生境每小區(qū)隨機(jī)選取40株，每株取頂端向下第2節(jié)的成熟葉1片，10片葉用于形態(tài)測(cè)定、30片用于生理指標(biāo)測(cè)定。葉片長(zhǎng)、寬采用刻度尺測(cè)量，單葉質(zhì)量采用電子天平測(cè)量，以每小區(qū)隨機(jī)摘取的10片葉子測(cè)得的平均值為一個(gè)重復(fù)。參考文獻(xiàn)[12]，含水量測(cè)定采用常壓烘干法；葉綠素、類胡蘿卜素測(cè)定采用95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇提取法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法；可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮比色法；脯氨酸含量測(cè)定采用酸性茚三酮法；過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。參考試劑盒說(shuō)明(南京建成生物研究所)，可溶性蛋白含量測(cè)定采用BCA法；超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用羥胺法。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.2.2 藥效成分含量 各生境每小區(qū)隨機(jī)取10株馬藍(lán)，將全部葉片置于60 ℃下烘干、磨粉，過(guò)80目篩后用于藥效成分測(cè)定。靛玉紅、靛藍(lán)、色胺酮和吲哚苷含量采用1260高效液相色譜儀(Agilent公司)測(cè)定，精密稱取0.5 g左右馬藍(lán)葉片樣品粉末于三角燒瓶中，準(zhǔn)確加入70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇30 mL，30 ℃恒溫超聲提取40 min(功率100 W，頻率50 kHz)，搖勻，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取濾液作為供試品。色譜條件：Ultimate XB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,3 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-水(B),梯度洗脫(0～5 min, 8%～8% A；5～8 min，8%～20% A；8～11 min，20%～22% A；11～13 min，22%～22% A；13～18 min，22%～30% A；18～23 min，30%～45% A；23～33 min，45%～60% A；33～48 min，60%～80% A；48～58 min，80%～100% A；58～68 min，100%～8% A)，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。方法學(xué)考察試驗(yàn)結(jié)果表明，相鄰峰之間的分離度均大于1.5，精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性均符合試驗(yàn)要求。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。若差異顯著(P<0.05)，則采用Ducan′s新復(fù)極差法檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)間的差異性。數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Excel 2010軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培生境對(duì)馬藍(lán)葉片形態(tài)和含水量的影響

由表1可知，3種生境兩次采樣的馬藍(lán)葉寬、單葉質(zhì)量和含水量變化均為：陰生>半陰生>陽(yáng)生，差異達(dá)顯著水平。與陽(yáng)生馬藍(lán)相比，7月30日采樣的半陰生、陰生馬藍(lán)葉長(zhǎng)分別增長(zhǎng)22.34%、49.27%，葉寬分別增長(zhǎng)29.55%、56.79%；單葉質(zhì)量分別增長(zhǎng)40.45%、86.73%，含水量分別增長(zhǎng)1.70%、6.33%；9月30日采樣的半陰生、陰生馬藍(lán)葉長(zhǎng)分別增長(zhǎng)25.40%、32.89%，葉寬分別增長(zhǎng)35.80%、53.85%；單葉質(zhì)量分別增長(zhǎng)62.22%、86.67%，含水量分別增長(zhǎng)2.31%、11.87%。以上表明，低光照強(qiáng)度的生境有利于馬藍(lán)葉片生長(zhǎng)。從表1還可見(jiàn)，9月30日采樣的數(shù)值均低于7月30日，可能受到降雨量減少的影響。2019年7月，當(dāng)?shù)仃幱晏煊?7 d，而8—9月降雨量持續(xù)降低，9月僅12 d陰雨天，且采樣前數(shù)日均為晴天。

表1 不同栽培生境下馬藍(lán)葉片形態(tài)和含水量比較1)Table 1 Comparison on morphology and water content of B.cusia leaves in different cultivation habitats

2.2 栽培生境對(duì)馬藍(lán)葉片生理指標(biāo)的影響

2.2.1 光合色素含量 從表2可見(jiàn)，3種生境兩次采樣的馬藍(lán)葉片總?cè)~綠素含量變化均表現(xiàn)為：陰生>半陰生>陽(yáng)生，差異達(dá)顯著水平。與陽(yáng)生馬藍(lán)相比，7月30日采樣的半陰生、陰生馬藍(lán)總?cè)~綠素分別提高了66.89%、102.03%；9月30日采樣的半陰生、陰生馬藍(lán)總?cè)~綠素分別提高了34.31%、91.24%。兩次采樣的葉綠素a/葉綠素b均為陰生馬藍(lán)葉片顯著小于陽(yáng)生和半陰生；類胡蘿卜素/總?cè)~綠素均為：陽(yáng)生>半陰生>陰生，且三者差異顯著。從表2還可見(jiàn)，9月30日各生境測(cè)得的光合色素含量均低于7月30日，可能與干旱或植株衰老有關(guān)。這與武云杰等[13]、柴勝豐等[14]發(fā)現(xiàn)的衰老和干旱情況會(huì)導(dǎo)致葉綠素和類胡蘿卜素含量下降的研究結(jié)果相同。

表2 不同栽培生境下馬藍(lán)葉片光合色素含量比較1)Table 2 Comparison of photosynthetic pigments contents in B.cusia leaves in different cultivation habitats

2.2.2 MDA含量和SOD、POD活性 遭遇環(huán)境脅迫會(huì)引起植物體內(nèi)自由基水平的升高，加劇膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA 含量上升[15]。SOD酶、POD酶活性提高能起到減少自由基的作用[16]。(1)由圖1可知，不同生境下兩次采樣的馬藍(lán)葉片MDA含量變化表現(xiàn)為：陽(yáng)生>半陰生>陰生，陽(yáng)生與半陰生、陰生差異均達(dá)到顯著水平，表明陽(yáng)生馬藍(lán)葉的細(xì)胞膜較其他栽培生境受損嚴(yán)重。(2)由圖1還可知，不同生境下兩次采樣的馬藍(lán)葉片SOD酶活性為：陰生>陽(yáng)生>半陰生，且差異達(dá)顯著水平；POD酶活性為：陰生>半陰生>陽(yáng)生，其中陰生與陽(yáng)生的差異達(dá)到顯著水平。SOD、POD的變化與MDA不一致，可能在于長(zhǎng)期的強(qiáng)光或干旱脅迫導(dǎo)致活性氧產(chǎn)生速度大于清除速度，造成抗氧化系統(tǒng)的不可逆損傷。何天友等[17]研究表明，在嚴(yán)重或長(zhǎng)期脅迫條件下植物體內(nèi)的活性氧清除酶活性可能出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

不同小寫(xiě)字母者表示同時(shí)期樣品差異達(dá)0.05顯著水平。圖1 不同栽培生境下馬藍(lán)葉片MDA含量及SOD和POD酶活性比較Figure 1 Comparison on MDA contents and activities of SOD and POD of B.cusia leaves in different cultivation habitats

2.2.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)提高植物抗逆能力有重要作用。從圖2可以看出，不同生境下兩次采樣馬藍(lán)葉片的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量變化除了7月30日采樣的半陰生馬藍(lán)葉片可溶性蛋白含量略高于陽(yáng)生外，基本表現(xiàn)為：陽(yáng)生>半陰生>陰生。陽(yáng)生和半陰生的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均顯著高于陰生，表明陽(yáng)生和半陰生環(huán)境可能對(duì)馬藍(lán)生長(zhǎng)造成了一定的脅迫。馬藍(lán)葉片的脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量變化與葉片含水量(表1)變化相反，表明水分脅迫可能是造成不同栽培生境滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量差異的主要原因。9月30日各生境測(cè)得的脯氨酸含量是7月30日采樣的26～36倍，可能主要與9月晴多雨少有關(guān)。脯氨酸是植物細(xì)胞內(nèi)分布最廣的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，多數(shù)植物在干旱脅迫會(huì)大量積累[18]。脯氨酸大量積累具有維持細(xì)胞滲透平衡、清除活性氧與減輕逆境脅迫對(duì)細(xì)胞的傷害等作用。

不同小寫(xiě)字母者表示同時(shí)期樣品差異達(dá)0.05顯著水平。圖2 不同栽培生境下馬藍(lán)葉片可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量比較Figure 2 Comparison on contents of soluble sugar, soluble protein, proline in B.cusia leaves in different cultivation habitats

2.3 栽培生境對(duì)馬藍(lán)葉片藥效成分含量的影響

由表3可見(jiàn)，不同生境下兩次采樣的馬藍(lán)葉片藥效成分含量基本表現(xiàn)為：陽(yáng)生>半陰生>陰生，除了半陰生馬藍(lán)7月30日采樣的吲哚苷含量和9月30日采樣的色胺酮含量顯著高于陽(yáng)生，9月30日采樣的吲哚苷顯著低于陰生外。兩次取樣陽(yáng)生馬藍(lán)葉藥用成分含量均高于陰生，其中，7月30日采樣的陽(yáng)生馬藍(lán)葉片色胺酮含量較陰生約提高7.5倍；9月30日采樣的陽(yáng)生馬藍(lán)葉片吲哚苷含量較陰生約提高了5.6倍。由表3還可見(jiàn)，7月30日采樣的馬藍(lán)葉片色胺酮含量高于9月30日采樣；9月30日陽(yáng)生和陰生馬藍(lán)的吲哚苷、靛藍(lán)、靛玉紅含量高于7月30日采樣。以上表明，陽(yáng)生生境更有利于馬藍(lán)藥效成分的積累，且藥效成分含量高低隨季節(jié)而變化。

表3 不同栽培生境下馬藍(lán)葉片藥效成分含量比較1)Table 3 Comparison of medicinal content in B.cusia leaves in different cultivation habitats

3 討論與結(jié)論

3.1 栽培環(huán)境對(duì)馬藍(lán)生長(zhǎng)和生理的影響

本研究在書(shū)峰鄉(xiāng)馬藍(lán)產(chǎn)區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同生境下的馬藍(lán)葉片形態(tài)差異顯著。大田種植的馬藍(lán)葉片小而黃綠，葉面隆起，搓揉易碎，株形較為緊湊；半陰生與陰生環(huán)境下的馬藍(lán)葉片則大而深綠，株幅大于陽(yáng)生。這種隨栽培環(huán)境不同而改變自身形態(tài)和葉綠素含量以應(yīng)對(duì)光能過(guò)?；蚨倘钡奶匦栽谀灸坦鸞19]、謝君魔芋[20]等喜蔭植物上也有表現(xiàn)。本研究中，馬藍(lán)葉片大小表現(xiàn)為：陰生>半陰生>陽(yáng)生，與朱仁磊[21]的調(diào)查研究類似，表明較陰的生境更適合馬藍(lán)生長(zhǎng)。此外，本研究中MDA含量表現(xiàn)(陽(yáng)生>半陰生>陰生)與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量表現(xiàn)(陽(yáng)生>半陰生>陰生)也可以作為佐證。因此，陰生或半陰生的生境更有利于馬藍(lán)的生長(zhǎng)。

本研究中，陰生生境下9月30日采樣的馬藍(lán)葉片大、葉綠素含量高、葉綠素a/葉綠素b和類胡蘿卜素/總?cè)~綠素低，與大多數(shù)植物遮陰處理的變化規(guī)律相同[22]，與寧書(shū)菊等[7]模擬不同光強(qiáng)獲得馬藍(lán)的葉片大小和葉綠素含量變化略有不同，可能由于光質(zhì)和栽培密度不同。孫小玲等[22]研究表明，樹(shù)木的遮陰不僅會(huì)降低光照強(qiáng)度，也會(huì)改變光譜組成，導(dǎo)致紅光比例降低、藍(lán)光比例增高，而通常試驗(yàn)所用的遮陽(yáng)網(wǎng)只能降低光照強(qiáng)度，沒(méi)有改變光譜組成。此外，樹(shù)林下馬藍(lán)種植密度相對(duì)更稀疏，植株間遮蓋更少也有利于獲得更多光能。

3.2 栽培環(huán)境對(duì)馬藍(lán)藥效成分積累的影響

本調(diào)查發(fā)現(xiàn)，書(shū)峰鄉(xiāng)馬藍(lán)每年采收2次，一般在端午節(jié)后的一個(gè)半月進(jìn)行第1次采收,中秋節(jié)后至立冬前進(jìn)行第2次采收，采收后留地上部?jī)晒?jié)。本研究測(cè)得9月30日(中秋后17 d)采樣的陽(yáng)生馬藍(lán)葉藥效成分較7月30日(端午后53 d)采樣的高，印證了地道產(chǎn)區(qū)農(nóng)民在中秋前后進(jìn)行大面積采割，且以采收葉面隆起、搓揉易碎的馬藍(lán)(大田種植的馬藍(lán))加工青黛得率更高、品質(zhì)更好的傳統(tǒng)做法?？赡茉蚴且吧R藍(lán)一般分布在陰濕環(huán)境，陽(yáng)生環(huán)境對(duì)其造成脅迫，從而誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的次生代謝產(chǎn)物。資源獲得假說(shuō)認(rèn)為[23]，植物在惡劣的自然環(huán)境條件下會(huì)生長(zhǎng)緩慢且次生代謝產(chǎn)物含量高，在良好的自然條件下則會(huì)生長(zhǎng)較快且次生代謝產(chǎn)物含量低。吲哚苷、靛藍(lán)、靛玉紅和色胺酮均為馬藍(lán)的次生代謝產(chǎn)物。吲哚苷、靛藍(lán)、靛玉紅為吲哚類生物堿。一般認(rèn)為吲哚的合成主要通過(guò)莽草酸途徑，莽草酸激酶是莽草酸途徑的關(guān)鍵酶。黃玉香[24]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)紫外線照射后馬藍(lán)葉片編碼莽草酸激酶的BcSK基因表達(dá)上升，或許能從分子層面解釋大田種植的馬藍(lán)吲哚苷、靛藍(lán)、靛玉紅含量更高的原因。

中藥材栽培不同于農(nóng)作物或觀賞植物，不僅要考察其產(chǎn)量更要注重品質(zhì)和藥效。本研究表明，馬藍(lán)在陰生和半陰生條件下長(zhǎng)勢(shì)更好，但藥效成分含量低于陽(yáng)生條件?！敖ㄇ圜臁钡赖禺a(chǎn)區(qū)種植的馬藍(lán)如用于炮制生產(chǎn)青黛或提取靛藍(lán)、靛玉紅、色胺酮，建議在陽(yáng)生或在能獲得較強(qiáng)光照的生境條件下種植，但在生長(zhǎng)前期及采割后的恢復(fù)生長(zhǎng)期需采用適度遮陽(yáng)處理；若馬藍(lán)作為鄉(xiāng)村旅游的觀賞植物，可在人行道樹(shù)蔭下等弱光環(huán)境下種植。