張婧怡，姜仁平，孟祥龍，黃 成，劉茂松

( 1.南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023； 2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017 )

互花米草(Spartinaalterniflora)原產(chǎn)于美洲大西洋西海岸以及墨西哥灣[1]，20世紀(jì)引入我國(guó)后迅速蔓延，目前已成為我國(guó)海岸灘涂濕地生態(tài)系統(tǒng)最主要的外來入侵植物[2]。植物群落凈第一性生產(chǎn)力的大部分是以凋落物的形式流入土壤并進(jìn)入食物鏈[3]?！董h(huán)境再生設(shè)計(jì)》[4]一書中曾推薦“鏨式犁耕作”技術(shù)，即將植物殘?bào)w埋入土中，作為一項(xiàng)對(duì)擾動(dòng)后的土壤進(jìn)行恢復(fù)的有效技術(shù)。但互花米草凋落物殘?bào)w大量輸入土壤中，對(duì)底棲動(dòng)物和濕地生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)均有很大影響。

為探究鹽城濱海灘涂上凋落物流入土壤對(duì)底棲動(dòng)物的影響，以及適當(dāng)干預(yù)后的響應(yīng)，設(shè)計(jì)了本次試驗(yàn)。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)為鹽城濱海灘涂淡水潮溝及兩側(cè)潮坪上常見的優(yōu)勢(shì)底棲動(dòng)物之一[5]，該物種原本也是外來物種，但是經(jīng)過多年繁育養(yǎng)殖，已成為我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，故而本試驗(yàn)選擇克氏原螯蝦幼苗作為底棲動(dòng)物的考察目標(biāo)。EM菌(Effective Microorganisms)是一種常見且成熟的混合菌劑，能處理水體中有害廢物，同時(shí)被動(dòng)物攝入后可以增強(qiáng)動(dòng)物免疫力，有利于動(dòng)物生長(zhǎng)和提高動(dòng)物飼料轉(zhuǎn)化率等[6]。筆者以EM菌作為改良底質(zhì)的功能菌群，對(duì)比在4種不同基質(zhì)下克氏原螯蝦幼苗的存活和生長(zhǎng)情況，以及不同土壤基底中微生物群落結(jié)構(gòu)[7]、土壤有機(jī)碳和總氮含量的差異，旨在探究增強(qiáng)克氏原螯蝦對(duì)凋落物土壤混合基質(zhì)的適應(yīng)性措施，為其在沿海灘涂養(yǎng)殖的推廣提供技術(shù)支持。

試驗(yàn)采樣地為列入《世界遺產(chǎn)名錄》中的中國(guó)黃(渤)海候鳥棲息地，同樣也是全球第二塊潮間帶濕地遺產(chǎn)、江蘇省首項(xiàng)自然遺產(chǎn)，該研究將對(duì)鹽城濱海灘涂濕地生態(tài)系統(tǒng)的功能提升及適應(yīng)性管理有一定的實(shí)踐應(yīng)用意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)樣地位于江蘇鹽城濱海濕地(N 32°34′～34°28′、E 119°48′～120°56′)，用采泥器收集江蘇鹽城灘涂淤泥，帶回后干燥處理；收集互花米草凋落物，帶回后晾干脫水并打碎；EM菌原液(光合細(xì)菌、乳酸菌、酵母菌等多種高效活性菌)由愛睦樂環(huán)保生物技術(shù)(南京)有限公司提供。

克氏原螯蝦幼苗，體長(zhǎng)(2.2±0.2) cm，體質(zhì)量(600±100) mg，采自鹽城灘涂潮溝咸淡水區(qū)域。試驗(yàn)水體采用充分曝氣的自來水, 水溫約25 ℃。飼養(yǎng)容器為高8 cm、直徑8 cm的圓柱形透明塑料盒(圖1)。

圖1 飼養(yǎng)盒示意Fig.1 Schematic diagram of a feeding box

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)基底制備

清水基底：容器中加入100 mL水，此為清水組；

泥土基底：容器中添加1 cm的干燥土，加水保持100 mL上清液，此為泥土組；

互花米草基底：互花米草和干燥土按1∶24的質(zhì)量比例均勻混合制成混合土。容器中添加1 cm厚的混合土，加水保持100 mL上清液，此為草泥組；

EM菌+互花米草基底：參照說明書，將EM菌液100 mL、水1000 mL、紅糖100 g混合，恒溫22 ℃置搖床間歇搖晃，培養(yǎng)10 d后制成發(fā)酵液，發(fā)酵液按1 mL∶1000 mL稀釋1000倍。容器中添加1 cm厚的上述混合土，并加入稀釋后的發(fā)酵液充分浸潤(rùn)，然后加水，保持100 mL上清液，此為EM組；

每組基底常溫下靜置3 d后投入克氏原螯蝦幼苗。

1.2.2 分組、飼養(yǎng)與測(cè)定數(shù)據(jù)

試驗(yàn)分4組，每組30個(gè)平行。每盒放置1只克氏原螯蝦幼苗。投喂餌料為江蘇省淡水水產(chǎn)研究所配制的克氏原螯蝦專用餌料，蛋白水平35%，隔2 d投喂1粒，每粒40 mg，殘餌不除。室溫飼養(yǎng)持續(xù)30 d后，統(tǒng)計(jì)克氏原螯蝦幼苗存活率及體長(zhǎng)(L)和體質(zhì)量(m)生長(zhǎng)指標(biāo)，對(duì)體長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系進(jìn)行擬合，計(jì)算肥滿度(CF=m/L3)。肥滿度又稱豐滿系數(shù)，是體長(zhǎng)和體質(zhì)量關(guān)系的另一種表達(dá)式，可衡量克氏原螯蝦的肥瘦程度[8]。

試驗(yàn)結(jié)束后采用16S rDNA法來測(cè)定基底土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)、采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測(cè)定土壤總有機(jī)碳(TOC)、采用半微量凱式法測(cè)定總氮(TN)[9]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)存活率等數(shù)據(jù)進(jìn)行檢驗(yàn)，采用單因子方差分析對(duì)體長(zhǎng)增長(zhǎng)量和體質(zhì)量增加量等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 存活率比較

根據(jù)各組存活率及卡方檢驗(yàn)結(jié)果(表1)得出，相較于只有互花米草底泥的草泥組，經(jīng)EM菌活化底泥后的EM組克氏原螯蝦幼苗的存活率顯著提高，與清水組和泥土組無顯著差異。該結(jié)果表明底泥中混入互花米草凋落物對(duì)克氏原螯蝦幼苗的存活有顯著抑制作用，經(jīng)EM菌活化后能抵消這一抑制。

表1 各組存活率及顯著性檢驗(yàn)

2.2 體長(zhǎng)、體質(zhì)量的比較

試驗(yàn)結(jié)束后，克氏原螯蝦的體長(zhǎng)排序?yàn)镋M組>草泥組>泥土組>清水組(圖2)。EM組的克氏原螯蝦幼苗平均體長(zhǎng)最大，平均增長(zhǎng)量顯著高于其他3組，而其他3組間的平均增長(zhǎng)量無顯著差異(表2)。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)EM菌活化后的互花米草底泥對(duì)克氏原螯蝦幼苗的體長(zhǎng)有顯著促進(jìn)效果。

試驗(yàn)結(jié)束后，體質(zhì)量分布規(guī)律與體長(zhǎng)一致，即分布排序?yàn)镋M組>草泥組>泥土組>清水組(圖2)。EM組的克氏原螯蝦幼苗平均體質(zhì)量最大，平均增加量顯著高于泥土組和清水組，與草泥組之間差異不顯著(表2)。草泥組雖稍高于泥土組和清水組，但差異不顯著。清水組和泥土組差異不顯著。

圖2 各組終末體長(zhǎng)及終末體質(zhì)量的分布Fig.2 Distribution of final body length and body mass in each group

表2 各組終末平均體長(zhǎng)和體長(zhǎng)增長(zhǎng)量、平均體質(zhì)量和質(zhì)量增加量及顯著性檢驗(yàn)

2.3 體長(zhǎng)和體質(zhì)量的關(guān)系

2.3.1 體長(zhǎng)與體質(zhì)量關(guān)系式

體長(zhǎng)與體質(zhì)量關(guān)系式一般用冪函數(shù)m=aLb表示。將各組克氏原螯蝦幼苗體長(zhǎng)和體質(zhì)量關(guān)系進(jìn)行擬合，得出各組體長(zhǎng)—體質(zhì)量?jī)绾瘮?shù)關(guān)系式如下：

清水組：m=5.8361×L1.5222(r2=0.8439)

泥土組：m=4.7033×L1.5834(r2=0.7506)

草泥組：m=1.3536×L1.9796(r2=0.8681)

EM組：m=1.0555×L2.0473(r2=0.7541)

Paulyt-檢驗(yàn)法檢驗(yàn)結(jié)果表明，各組b值均小于3，均與3存在顯著差異，說明各組體長(zhǎng)和體質(zhì)量的生長(zhǎng)不對(duì)等，均為異速生長(zhǎng)類型。

2.3.2 肥滿度比較

肥滿度計(jì)算結(jié)果見圖3，肥滿度為清水組>草泥組>泥土組>EM組。EM組肥滿度顯著低于清水組，與其他2組差異顯著；草泥組與其他3組均差異不顯著(表3)。

圖3 各組肥滿度分布Fig.3 The distribution of condition factor in each group

表3 各組肥滿度及顯著性檢驗(yàn)

2.4 底泥土壤性質(zhì)比較

2.4.1 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較

選擇物種豐度>1%的優(yōu)勢(shì)門，作相對(duì)豐度分布柱狀圖(圖4)。各組土壤基質(zhì)中細(xì)菌主要包括變形菌門、浮霉菌門、放線菌門、擬桿菌門及厚壁菌門，各組主要優(yōu)勢(shì)門占比略有差異。屬水平上的細(xì)菌類群比較及卡方檢驗(yàn)見表4，結(jié)果表明，在已命名的10個(gè)屬中，相較于泥土組，互花米草組有3個(gè)屬的菌群與其差異顯著，EM菌組有4個(gè)屬與其差異顯著，而互花米草和EM菌組之間也有1個(gè)屬的菌群差異顯著。結(jié)合門水平物種分布及屬水平顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，在土壤中加入互花米草和加入添加EM菌的互花米草均會(huì)改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2.4.2 EM組與草泥組的有機(jī)碳及總氮的比較

土壤有機(jī)碳和總氮結(jié)果見表5，EM組有機(jī)碳和總氮含量顯著低于草泥組。該結(jié)果表明，草泥組因互花米草腐解導(dǎo)致元素富集，從而積累了更多碳和氮。而EM組各指標(biāo)含量較低，證明EM菌能加快互花米草的分解速度，釋放出更多的碳源和氮源供克氏原螯蝦幼苗生長(zhǎng)所需。

圖4 各組土壤樣品在門分類水平上細(xì)菌類群比較Fig.4 Comparison of bacterial communities in soil samples in different groups at phylum level

3 討 論

3.1 互花米草凋落物腐解對(duì)克氏原螯蝦幼苗生存的影響

互花米草直接混入底泥的草泥組克氏原螯蝦存活率顯著低于其他3組，說明隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，互花米草枯落物在底泥中慢慢腐解，造成土壤基質(zhì)中缺氧，土壤生存環(huán)境嚴(yán)重惡化，導(dǎo)致克氏原螯蝦無法存活。這與葉春等[10]的研究結(jié)果植物腐爛分解會(huì)營(yíng)造厭氧環(huán)境，引發(fā)缺氧，及陳婷等[11]克氏原螯蝦不喜歡污水的環(huán)境，幼蝦甚至能被毒死的結(jié)論一致。本試驗(yàn)結(jié)果表明，底泥中混入互花米草凋落物不利于克氏原螯蝦幼苗的存活，需要適當(dāng)干預(yù)來改善其適應(yīng)能力。

表5 草泥組和EM組土壤總有機(jī)碳、總氮的比較及顯著性檢驗(yàn)

Moriarty[12]發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)的養(yǎng)殖池中施用芽孢桿菌(Bacillus)后，斑節(jié)對(duì)蝦成活率提高。本試驗(yàn)嘗試添加EM菌來改善土壤環(huán)境，EM菌能加快植物秸稈的發(fā)酵，改良土壤[13]，還能凈化養(yǎng)殖水體[14]。添加EM菌后克氏原螯蝦幼苗存活率顯著高于草泥組，與清水組和泥土組無顯著差異，證明EM菌改善了互花米草在底泥中腐解造成的生境惡化現(xiàn)象，提高了蝦苗存活率。

3.2 互花米草的流入對(duì)克氏原螯蝦幼苗生長(zhǎng)的影響

3.2.1 添加EM菌后對(duì)克氏原螯蝦幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)

Wang[15]發(fā)現(xiàn)，在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)飼料中添加光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)能促進(jìn)其生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中，嘗試添加EM菌，結(jié)果表明，添加EM菌后的互花米草組克氏原螯蝦終末體長(zhǎng)和體質(zhì)量均高于其他3組，體長(zhǎng)增長(zhǎng)量顯著高于其他3組，體質(zhì)量增加量顯著高于清水組和泥土組，與草泥組無顯著差異。該結(jié)果表明，EM菌組克氏原螯蝦的生長(zhǎng)速度快于其他3組。這說明添加EM菌后不僅改善了惡化的環(huán)境，還加快了互花米草的分解過程，釋放出更多養(yǎng)分到土壤系統(tǒng)中，再經(jīng)食物鏈傳遞給消費(fèi)者，克氏原螯蝦幼苗通過攝食提高了自身的體質(zhì)量。

3.2.2 單一互花米草底泥對(duì)克氏原螯蝦幼苗生長(zhǎng)的影響

由各組體長(zhǎng)和體質(zhì)量比較結(jié)果可知，單一互花米草底泥中的克氏原螯蝦幼苗體長(zhǎng)和體質(zhì)量均高于清水組和泥土組，與EM組無顯著差異，而EM組的克氏原螯蝦幼苗已有顯著的增長(zhǎng)，所以一定程度上證明了互花米草底泥中存活者體質(zhì)量的增長(zhǎng)速度快于清水組和泥土組。這說明互花米草凋落物提供的高生產(chǎn)力直接增加了食物來源，進(jìn)而通過營(yíng)養(yǎng)級(jí)聯(lián)作用在次級(jí)代謝過程中支撐了底棲動(dòng)物。雖然互花米草凋落物在底泥中因腐解自身流失了部分養(yǎng)分，但依然能為克氏原螯蝦幼苗提供營(yíng)養(yǎng)支持?；セ撞輰俣嗄晟鶦4草本植物，其凋落物作為食物鏈中基礎(chǔ)食物資源，能夠提升底泥對(duì)克氏原螯蝦幼苗的支持能力，這也側(cè)面證明了它的生態(tài)利用價(jià)值。

克氏原螯蝦幼苗的體長(zhǎng)和體質(zhì)量關(guān)系符合m=aLb規(guī)律，且相關(guān)性較高[16]。而本試驗(yàn)4組間生長(zhǎng)模式均為異速生長(zhǎng)，不符合等速生長(zhǎng)模式；肥滿度比較中，EM組顯著最低，其次為草泥組。以上結(jié)果均反映EM組體長(zhǎng)發(fā)育較快。而克氏原螯蝦幼苗在生長(zhǎng)階段會(huì)優(yōu)先體長(zhǎng)的生長(zhǎng)，是其逃避捕食的重要生態(tài)適應(yīng)[17]，這說明添加EM菌的底泥中的克氏原螯蝦幼苗生存能力更強(qiáng)。

3.3 互花米草的流入對(duì)底泥土壤的影響

Gunther等[18]發(fā)現(xiàn)，在羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)飼料中添加芽孢桿菌不僅可促進(jìn)其生長(zhǎng)，還可降低其死亡率。由各組微生物菌群比較結(jié)果可見，泥土組與草泥組、EM組之間菌群結(jié)構(gòu)存在差異，草泥組和EM組有更豐富的微生物菌群，能促進(jìn)克氏原螯蝦幼苗的生長(zhǎng)。而草泥組和EM組之間也有1個(gè)屬的菌群占比差異顯著，通過進(jìn)一步測(cè)量草泥組和EM組中底泥的土壤有機(jī)碳和總氮含量發(fā)現(xiàn)，EM組土壤有機(jī)碳、總氮含量顯著偏低。土壤有機(jī)碳主要來源于植物凋落物、土壤腐殖質(zhì)等，且受總氮等多種環(huán)境因素的影響[19]。高建華等[20]認(rèn)為，互花米草群落地上生物量和植被蓋度最高，生成凋落物較多，植物凋落物分解緩慢，土壤有機(jī)碳大量積累使土壤有機(jī)碳含量最高。通常認(rèn)為凋落物的分解速率與氮含量呈正相關(guān)。這也證明了在底泥中加入EM菌后能加快互花米草的分解速度，釋放更多的碳源和氮源。土壤氮元素和碳元素作為生態(tài)系統(tǒng)中最主要的生源要素[21]，能為克氏原螯蝦提供更多生物支撐，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。EM菌的加入進(jìn)一步改變了底泥中微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)，而且EM菌能加快互花米草在底泥中的分解，改善了腐解造成的生境惡化現(xiàn)象。說明EM菌作為功能性菌群能保持各種菌間的協(xié)同作用，效果顯著。

朱麗葉等[22]研究發(fā)現(xiàn)，微生物菌劑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可以從多個(gè)方面進(jìn)行探究，如細(xì)菌的代謝產(chǎn)物富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)入消化道后生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)動(dòng)物胃腸道消化酶分泌，同時(shí)自身分泌消化酶促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等。鑒于本試驗(yàn)中互花米草凋落物及其腐解產(chǎn)生的累積效應(yīng)，未來筆者將探索更加有效的微生物制劑，使其既能促進(jìn)底棲動(dòng)物的生長(zhǎng)情況，又能改善互花米草生長(zhǎng)區(qū)底棲動(dòng)物的生存環(huán)境，從而進(jìn)一步提高生境土壤的競(jìng)爭(zhēng)力，增加互花米草的生態(tài)利用價(jià)值，以用代治。

4 結(jié) 論

互花米草有較高的生產(chǎn)力，而且入侵面積廣，與其治理，不如利用?；セ撞莸蚵湮镒鳛槭澄镦湹幕A(chǔ)食物提供者，它的流入提升了土壤底泥對(duì)克氏原螯蝦的支持能力，而EM菌也能改善底泥中互花米草快速腐解累積所造成的生境惡化現(xiàn)象，并促進(jìn)其分解。本試驗(yàn)方法效果顯著，豐富了EM菌協(xié)助克氏原螯蝦對(duì)凋落物與土壤混合基質(zhì)的響應(yīng)和適應(yīng)，不僅可以為其在沿海灘涂養(yǎng)殖的推廣提供技術(shù)支持，還可提高互花米草的生態(tài)利用價(jià)值，為灘涂濕地生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)與恢復(fù)提供參考。