伍鑫 張琰君 國濱 徐振華 肖靜麗

廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院 510000

通信作者：伍鑫，Email：8035192@qq.com

m6A甲基化修飾是RNA修飾中普遍存在的一種方式，其對維持mRNA的功能方面具有重要作用。m6A甲基化修飾具有可逆性，其發(fā)生三種調(diào)節(jié)因子如甲基轉(zhuǎn)移酶14/3（METTL14/METTL3）、去甲基化酶（FTO/alkbh5）和閱讀蛋白（YTHDF1/YTHDF2）等進(jìn)行調(diào)節(jié)［1］。目前大量研究發(fā)現(xiàn)，m6A不僅參與正常細(xì)胞的生長調(diào)控，同時(shí)還參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展，m6A甲基化紊亂容易增加腫瘤細(xì)胞的癌變［2-3］。肝癌是危害性較大的惡性腫瘤疾病，有研究發(fā)現(xiàn)FTO通過調(diào)控m6A修飾從而影響肝癌的發(fā)生，肝癌組織中FTO水平上調(diào)可有效抑制肝癌的生長，METT14表達(dá)水平降低可引起肝癌細(xì)胞中m6A修飾水平下降［4］。基于m6A修飾及調(diào)控因子與腫瘤細(xì)胞發(fā)生相關(guān)性，許多腫瘤治療藥物的藥效評定中多以m6A修飾及調(diào)控因子變化為參照，如三氧化二砷（ATO）是目前治療肝癌的常用藥物，但其抗肝癌的機(jī)理目前尚不清楚，有少量研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化修飾參與ATO抑制肝癌治療過程，但這些信號分子調(diào)控m6A抑制肝癌細(xì)胞生長的還需進(jìn)一步研究［5］。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，11054001）、FBS（美國Gibco公司，12483020）、ATO（美國Sigma公司，CAS#1327-53-3）、噻唑藍(lán)（MTT）（碧云天，C0009）、二甲基亞砜（DMSO）（碧云天，ST1276）、CCK-8檢測試劑盒（英國Abcam公司，ab228554），總RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，74204）、m6A RNA甲基化定量檢測試劑盒（美國Epigentek公司，P-9010）、RIPA細(xì)胞裂解液（碧云天，P0013B），人肝癌細(xì)胞株HepG2（中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）；METTL3兔抗（英國Abcam公司，ab195352）、METTL14兔抗（英國Abcam公司，ab252562）、FTO兔抗（英國Abcam公司，ab126605）、YTHDF1兔抗（英國Abcam公司，ab252346）及CDC42兔抗（英國Abcam公司，ab187643），GAPDH鼠抗（英國Abcam公司，ab8245）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號MK3）、核酸定量檢測儀Nano Drop（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號Nanodrop one/Nanodrop onec）、CO2培養(yǎng)箱（日本三洋，型號MCO-15AC）。

1.2 細(xì)胞四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）活力檢測 將人肝癌細(xì)胞株HepG2體外擴(kuò)增后稀釋至1×105個(gè)/ml接種于6孔板中4 ml/孔，繼續(xù)培養(yǎng)至覆蓋孔底70%左右，棄細(xì)胞上清，依據(jù)相關(guān)報(bào)道加入含有終濃度為20μM ATO的DMEM完全培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立只加DMEM完全培養(yǎng)基的空白對照孔，2 ml/孔。ATO處理的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至0 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別隨機(jī)選取3個(gè)孔，去掉細(xì)胞上清加入終濃度為0.5 mg/ml的MTT溶液2 ml/孔，繼續(xù)孵育4 h后棄掉MTT，加入2 ml/孔DMSO于搖床震蕩5 min后，以空白對照孔調(diào)零，于酶標(biāo)儀上檢測OD570值，根據(jù)公式細(xì)胞存活率（%）＝（處理組OD570/空白組OD570）×100%進(jìn)行計(jì)算。

1.3 m6A甲基化定量檢測 將經(jīng)20μM ATO處理不同時(shí)間段的HepG2細(xì)胞用0.25%胰酶消化離心去上清后，使用總RNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取并于NanoDrop測量A230、A260及A280值，選取A260/280比值在1.8～2.2范圍的樣品孔，留取部分于-80℃?zhèn)溆?。同時(shí)剩余部分依據(jù)m6A甲基化定量檢測說明書將提取的總RNA進(jìn)行處理，試劑盒中含有陰性及陽性對照組，經(jīng)stop solution終止后的不同時(shí)間段樣本置于酶標(biāo)儀上進(jìn)行OD450檢測，根據(jù)公式m6A（%）＝［（OD處理組－OD陰性對照組）/200］/［（OD陽性對照組－OD陰性對照組）/2］×100%。

1.4 Western blot檢 測METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白水平 將經(jīng)20μMATO處理不同時(shí)間點(diǎn)的HepG2細(xì)胞消化離心后置于冰上加入終濃度均為1 mM蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，然后加入5×RIPA細(xì)胞裂解液輕彈管壁，充分裂解10 min后，經(jīng)15 000 rpm離心10 min后棄上清（離心機(jī)型號：pico 17/21 176 mm），加入1 ml PBS沉淀重懸并轉(zhuǎn)入1.5 ml ep管中，進(jìn)行BCA法蛋白濃度測定，之后于15 000 rpm離心10 min后棄上清（離心機(jī)型號：pico 17/21 176 mm），加入1 ml loading buffer于電熱浴槽98℃煮5 min使其變性。取6份等量的變性蛋白液（25μg）加入濃縮膠加樣孔中，170 V電泳1～2 h，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將膠取下轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，經(jīng)5%BSA室溫封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗METTL3、兔抗METTL14、兔抗FTO、兔抗YTHDF1、兔抗Cdc42及鼠抗GAPDH，4℃過夜孵育，PBST洗膜4次約10 min，加入羊抗兔-HRP二抗和羊抗鼠-HRP二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜4次約10 min，加入AB顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照及統(tǒng)計(jì)蛋白相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ATO處理不同時(shí)間段細(xì)胞存活率和m6A甲基化水平變化比較 由表1可知，經(jīng)ATO處理后的0～24 h內(nèi)，隨著處理時(shí)間延長，HepG2的細(xì)胞存活率呈顯著下降趨勢（P＜0.05），而HepG2細(xì)胞的RNA m6A甲基化水平呈顯著上升趨勢（P＜0.05）；在ATO處理后的24～48 h內(nèi)，HepG2細(xì)胞存活率呈下降趨勢，RNA m6A甲基化水平呈上升趨勢，但兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的變化不顯著（均P＞0.05）。

表1 ATO處理不同時(shí)間段HepG2細(xì)胞存活率變化（%±s，n＝3）

表1 ATO處理不同時(shí)間段HepG2細(xì)胞存活率變化（%±s，n＝3）

注：ATO為三氧化二砷；a代表與0 h比較P＜0.05，b代表與6 h比較P＜0.05，c代表與12 h比較P＜0.05

指標(biāo)細(xì)胞存活率m6A水平0 h 93.32±4.12 0.27±0.04 6 h 85.01±5.03a 0.58±0.09 a 12 h 49.14±5.23ab 0.96±0.10ab 24 h 24.00±4.74abc 1.21±0.11abc 48 h 18.34±3.33abc 1.43±0.24abc

2.2 ATO處理后HepG2細(xì)胞METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42表達(dá)水平變化比較 由表2可知，隨著ATO處理時(shí)間增加，HepG2細(xì)胞中METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1的相對表達(dá)量呈上升趨勢，而Cdc42呈下降趨勢；METTL3和FTO在ATO處理的12～48 h的相對表達(dá)量均顯著高于0 h（均P＜0.05），METTL14和YTHDF1在ATO處理的6～48 h的相對表達(dá)量均顯著高于0 h（均P＜0.05），Cdc42在ATO處理的6～48 h的相對表達(dá)量均顯著低于0 h（均P＜0.05）。

表2 ATO處理不同時(shí)間段HepG2細(xì)胞的METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白表達(dá)量（±s，n＝3）

表2 ATO處理不同時(shí)間段HepG2細(xì)胞的METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白表達(dá)量（±s，n＝3）

注：ATO為三氧化二砷；a代表與0 h比較P＜0.05，b代表與6 h比較P＜0.05

蛋白表達(dá)量METTL3 METTL14 FTO YTHDF1 Cdc42 0 h 0.43±0.07 0.44±0.08 0.38±0.06 0.44±0.07 0.76±0.08 6 h 0.56±0.10 0.63±0.09a 0.48±0.07 0.61±0.07a 0.61±0.09a 12 h 0.67±0.10a 0.79±0.09ab 0.60±0.10a 0.75±0.08ab 0.58±0.09a 24 h 0.71±0.11a 0.83±0.11ab 0.68±0.09a 0.79±0.09ab 0.51±0.09a 48 h 0.76±0.13a 0.94±0.11ab 0.73±0.11a 0.82±0.12ab 0.47±0.08a

3 討 論

RNA m6A修飾是腺嘌呤的第6位氮原子受甲基轉(zhuǎn)移酶催化發(fā)生的甲基化，此過程受3種蛋白酶參與調(diào)控，即甲基轉(zhuǎn)移酶（METTL3/METTL14）、去甲基酶（FTO）和閱讀蛋白（YTHDF）［6］。有研究發(fā)現(xiàn)剔除Hla細(xì)胞中METTL14后m6A甲基化水平顯著降低，但是去甲基化是否對細(xì)胞的生長有影響仍需深入研究［7］。目前有少量研究證實(shí)m6A修飾的擦除基因FTO被剔除后，細(xì)胞中mRNA的m6A甲基化水平顯著下降，在肝癌細(xì)胞的m6A研究中，抑制YTHDF1的表達(dá)更有利于提升肝癌患者的生存率，但是當(dāng)METTL14過表達(dá)會(huì)抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲［8］?；谏鲜稣{(diào)控蛋白表達(dá)水平與細(xì)胞生物學(xué)功能變化的相關(guān)性報(bào)道，近年來有少量研究開始將癌癥療效判定與上述指標(biāo)的變化進(jìn)行深入分析，如代黃梅等［9］使用不同濃度的ATO作用于對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)METTL14表達(dá)水平與肝癌細(xì)胞的m6A甲基化修飾水平呈正相關(guān)，同時(shí)ATO濃度在10～20μmol/L時(shí)的HepG2細(xì)胞存活率下降幅度最大。何佳等［10］利用CCK-8法證明ATO對HepG2的半抑制濃度（IC50）為8.0μmol/L，并證明此濃度下作用時(shí)間越長細(xì)胞的凋亡越多且HepG2細(xì)胞的遷移蛋白表達(dá)量限制下降。

本研究基于相關(guān)報(bào)道，對20μmol/L ATO作用于肝癌HepG2細(xì)胞株后不同時(shí)間段的RNA m6A的甲基化水平及調(diào)控蛋白水平綜合比較，結(jié)果隨著處理時(shí)間延長，HepG2的細(xì)胞存活率呈顯著下降趨勢（P＜0.05），而HepG2細(xì)胞的RNA m6A甲基化水平呈顯著上升趨勢（P＜0.05），但是在ATO處理后24 h和48 h的HepG2細(xì)胞存活率及RNA m6A甲基化水平變化不顯著，此結(jié)果初步證實(shí)20μmol/L ATO處理后6～24 h可顯著降低HepG2細(xì)胞存活率及RNA m6A甲基化水平，但是當(dāng)處理時(shí)間影響不顯著。在20μmol/L ATO水平下，隨著處理時(shí)間增加，HepG2細(xì)胞中METTL3、METTL14、FTO及YTHDF1的相對表達(dá)量呈上升趨勢，而Cdc42的相對表達(dá)量呈下降趨勢，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HepG2甲基化水平與HepG2的凋亡呈對立走勢；METTL3和FTO在ATO處理的12～48 h的相對表達(dá)量均顯著高于0 h（均P＜0.05），METTL14和YTHDF1在ATO處理的6～48 h的相對表達(dá)量均顯著高于0 h（均P＜0.05），Cdc42在ATO處理的6～48 h的相對表達(dá)量均顯著低于0 h（均P＜0.05），此結(jié)果證實(shí)METTL14、YTHDF1及Cdc42表達(dá)水平變化對ATO抑制HepG2細(xì)胞增殖療效的判定中起到早期參考價(jià)值。

綜上所述，ATO可顯著影響肝癌HepG2細(xì)胞RNAm6A的甲基化水平。在20μmol/LATO水平下，隨著ATO作用時(shí)間增加，HepG2細(xì)胞存活率顯著下降，其中m6A調(diào)控酶METTL14、YTHDF1及遷移蛋白Cdc42的早期表達(dá)水平變化顯著，這些指標(biāo)對ATO抑制肝癌早期療效評定具有指導(dǎo)意義。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。