張 婕，倪 爽，李 佶

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)發(fā)生兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)，近年有逐漸上升趨勢(shì)，發(fā)生率為1%~5%，是婦產(chǎn)科中較難處理的疾病，直接影響患者的生殖健康[1]。RSA的發(fā)病原因復(fù)雜，與偶發(fā)性流產(chǎn)基本一致，但各種原因所占的比例有所不同，包括染色體異常、解剖結(jié)構(gòu)因素、感染因素、內(nèi)分泌因素、免疫因素、血栓前狀態(tài)等其他因素，其確切機(jī)制尚不明確[2]。RSA屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”“屢孕屢墮”或“數(shù)墮胎”范疇，具有反復(fù)發(fā)作、胚胎應(yīng)期而墮的特點(diǎn)?；ザ酁樘撟C，但可兼夾瘀、熱，辨證著重于臟腑、氣血之辨。李佶經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，從“腎”“瘀”論治，病證結(jié)合，中西貫通，自擬補(bǔ)腎活血方治療RSA，臨床收效頗佳[3]。在妊娠早期，胎盤(pán)絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（extravillous trophoblast，EVT）向子宮蛻膜層和肌層血管侵入和分化，重塑螺旋動(dòng)脈，建立母—胎循環(huán)。RSA多發(fā)生在妊娠早期，人類早期的胚胎發(fā)育處在一個(gè)相對(duì)低氧的微環(huán)境中，維持正常情況下妊娠早期胎盤(pán)中這種生理性低氧環(huán)境對(duì)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層功能和胎盤(pán)早期發(fā)育至關(guān)重要[4]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是缺氧誘導(dǎo)因子家族中受到氧濃度調(diào)節(jié)的主要因子，血管生成是影響胎兒和胎盤(pán)發(fā)育的重要因素，依賴于多種生長(zhǎng)因子（包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體）和多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑[5]。本實(shí)驗(yàn)基于臨床療效及前期研究基礎(chǔ)，通過(guò)使用化學(xué)低氧誘導(dǎo)劑氯化鈷（CoCl2）建立滋養(yǎng)細(xì)胞低氧模型，探索補(bǔ)腎活血方凍干粉對(duì)HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞小管形成、HIF-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞株HTR-8/SVneo由上海交通大學(xué)附屬國(guó)際和平婦幼保健院惠贈(zèng)。

1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎活血方藥物組成：菟絲子15 g，杜仲15 g，續(xù)斷15 g，桑寄生15 g，當(dāng)歸6 g，川芎9 g等，所有藥材由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院提供。將中藥復(fù)方放入煎藥壺中，加入1 000 mL的純凈水，浸泡后加熱煎藥，共煎2次后將水煎液混合，4層紗布過(guò)濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮；后將藥液倒于器皿中放置于冷凍干燥機(jī)的物料托盤(pán)中，-50℃預(yù)凍5 h，再抽真空干燥；干燥機(jī)升溫，最后固定到-40℃凍干72 h，制成含生藥量145 g/L的凍干粉，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。補(bǔ)腎活血方凍干粉溶液母液用一級(jí)純水配制，濃度為0.1 g/mL，以0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。臨用時(shí)以含10%胎牛血清的培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

DMEM/F12培養(yǎng)基（批號(hào)：11320033）、胎牛血清（批號(hào)：1997802C）、胰酶（批號(hào)：25200072）（美國(guó)Gibco公司）；氯化鈷（Sigma公司，批號(hào)：1002965958）；二甲基亞砜（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司，批號(hào)：DH105-10）；一抗HIF-1α（批號(hào)：ab1）、VEGFA（批號(hào)：ab52917）（Abcam公司）；GAPDH（CST公司，批號(hào)：14C10）；二抗Anti-rabbit IgG（批號(hào)：A0208）、Anti-mouse IgG（批號(hào)：A0216）、Beyo ECL Plus（批號(hào)：P0018S）（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)Corning公司，批號(hào)：356234）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR037A）、Real-time PCR試劑盒（批號(hào)：RR420A）（TaKaRa公司）。PCR引物序列由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物序列

1.3 主要儀器BSA124S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Ti-E型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；YZB/USA1802-2009型恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；5424R型低溫臺(tái)式離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Synergy H1MF型酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司）；Cemiscope6300型凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；XSP-3C型顯微鏡（上海民怡儀器儀表有限公司）；MINI Protein V3型電泳儀、Mini Trans Blot型轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；ProFlex PCR型基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Life teconology）；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Life teconology）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在含有5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，每2 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞分組與干預(yù)HTR-8/SVneo細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、低氧模型組、補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組、補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組、補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組。根據(jù)前期MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選補(bǔ)腎活血方安全有效劑量即補(bǔ)腎活血方凍干粉終濃度5、10、25 mg/L。除空白組外，其余各組均給予CoCl2（100μmol/L）誘導(dǎo)低氧造模[6]，中藥組分別再同時(shí)給予不同濃度的補(bǔ)腎活血方凍干粉溶液。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 Tube formation法檢測(cè)血管生成 將細(xì)胞外基質(zhì)膠Matrigel充分溶解，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基1∶2稀釋后以150μL/孔鋪于24孔板中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h使其凝固成膠。分別收集空白組、低氧模型組和補(bǔ)腎活血方凍干粉低、中、高劑量組的細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，用含1%FBS的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。向鋪好膠的24孔板中每孔加入上述細(xì)胞懸液500μL，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。倒置顯微鏡下觀察各組小管形成情況并拍照，100倍下每組隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)形成小管的分支點(diǎn)數(shù)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6.2 Real time-PCR檢測(cè)HTR-8/SVneo細(xì)胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA的表達(dá) 按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行細(xì)胞分組與干預(yù)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，采用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA并測(cè)定其濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，進(jìn)行Real time PCR，應(yīng)用2－ΔΔCt對(duì)基因進(jìn)行相對(duì)定量計(jì)算。反應(yīng)條件：95℃1 min預(yù)變性；95℃5 s變性，58℃15 s退火，72℃30 s延伸，共40個(gè)循環(huán)。

1.6.3 Western Blotting檢 測(cè)HTR-8/SVneo細(xì) 胞HIF-1α、VEGFA蛋白的表達(dá) 按“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行細(xì)胞分組與干預(yù)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后分別加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，離心提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，各組等量上樣，10%SDSPAGE電泳，350 mA轉(zhuǎn)膜60 min，5%的BSA室溫封閉1 h，孵育HIF-1α、VEGFA（稀釋倍數(shù)1∶200）和GAPDH（稀釋倍數(shù)1∶400）一抗工作液4℃過(guò)夜，TBST洗膜8 min×5次，室溫?fù)u動(dòng)孵育二抗工作液1 h，TBST洗膜8 min×5次，ECL發(fā)光顯影，用Image J分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行定位和分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞血管形成能力比較 與空白組比較，低氧模型組、補(bǔ)腎活血方凍干粉各劑量組小管形成能力明顯升高（P＜0.05）；與低氧模型組比較，補(bǔ)腎活血方凍干粉低、中、高劑量組小管形成能力升高（P＜0.05）；補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組小管形成能力高于補(bǔ)腎活血方凍干粉中、低劑量組（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組小管形成能力與補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖1、表2）

圖1 各組細(xì)胞小管形成能力

表2 各組細(xì)胞小管形成能力比較（±s）

表2 各組細(xì)胞小管形成能力比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低氧模型組比較，bP＜0.05；與補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組比較，cP＜0.05；與補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組比較，dP＜0.05

組別 n 給藥劑量(mg/L)小管分支點(diǎn)數(shù)空白組 3 - 12.35±1.25低氧模型組 3 - 27.76±1.79a補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組 3 5 31.61±0.82a b補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組 3 10 33.24±1.22a b補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組 3 25 38.84±1.68a b c d

2.2 各組細(xì)胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表達(dá)情況 與空白組比較，補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1αmRNA的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），低氧模型組和補(bǔ)腎活血方凍干粉低、中、高劑量組VEGFA mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；與低氧模型組比較，補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1αmRNA的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），補(bǔ)腎活血方凍干粉中、高劑量組VEGFA mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組比較，補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA的相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 各組細(xì)胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組細(xì)胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與低氧模型組比較，bP＜0.05；與補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組比較，cP＜0.05

組別 n給藥劑量（mg/L）HIF-1αmRNA VEGFA mRNA空白組 3 - 1.01±0.18 1.03±0.28低氧模型組 3 - 1.11±0.12 1.93±0.13a補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組3 5 1.20±0.14 2.43±0.24a補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組3 10 1.22±0.10 2.79±0.29ab補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組3 25 1.50±0.15abc 3.01±0.47abc

2.3 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGFA蛋白表達(dá)情況 與空白組比較，低氧模型組及補(bǔ)腎活血方凍干粉低、中、高劑量組HIF-1α、VEGFA蛋白的相對(duì)表達(dá)量均升高（P<0.05）；與低氧模型組比較，補(bǔ)腎活血方凍干粉低、中、高劑量組HIF-1α、VEGFA蛋白的相對(duì)表達(dá)量均升高（P<0.05）。與補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組比較，補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1α、VEGFA蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05）；與補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組比較，補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組HIF-1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高（P<0.05），而VEGFA蛋白相對(duì)表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見(jiàn)圖2、表4）

圖2 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGFA蛋白表達(dá)情況

表4 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGFA蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組細(xì)胞HIF-1α、VEGFA蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05；與低氧模型組比較，bP<0.05；與補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組，cP<0.05；與補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組比較，dP<0.05

組別 n給藥劑量（mg/L）VEGFA HIF-1α空白組 3 - 0.25±0.05 0.03±0.01低氧模型組 3 - 0.51±0.01a 0.20±0.07a補(bǔ)腎活血方凍干粉低劑量組3 5 0.70±0.11ab 0.43±0.08ab補(bǔ)腎活血方凍干粉中劑量組3 10 0.81±0.09ab 0.40±0.09ab補(bǔ)腎活血方凍干粉高劑量組3 25 0.84±0.12abc 0.66±0.07abcd

3 討 論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的不良生育現(xiàn)狀是育齡期及高齡產(chǎn)婦所面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題，由于其難治性，給患者及家庭造成極大的身體和精神痛苦。中醫(yī)學(xué)對(duì)RSA的診治有著豐富的理論及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。隋代巢元方在《諸病源候論·婦人妊娠病諸候上》中首先提出了：“妊娠數(shù)墮胎候”[7]。古代多數(shù)醫(yī)家將數(shù)墮胎、滑胎的病因歸結(jié)為腎虛、氣血虛弱及血瘀?！端貑?wèn)·奇病論篇》中提到包絡(luò)系于腎，認(rèn)為胚胎發(fā)育與腎臟關(guān)系密切。腎為先天之本，主藏精、主生殖，胞胎所養(yǎng)，胚胎的著床發(fā)育均依靠先天腎精的滋養(yǎng)和腎氣的固護(hù)[8]。清代張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》創(chuàng)制的壽胎丸防治滑胎流傳至今[9]。王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中提出滑胎與血瘀相關(guān)的觀點(diǎn)：“不知子宮內(nèi)，先有瘀血占其地，胎至三月再長(zhǎng)，其內(nèi)無(wú)容身之地，胎病靠擠血不能入胎胞，從傍流而下，故先見(jiàn)血。血既不入胎胞，胎無(wú)血養(yǎng)，故小產(chǎn)?！逼鋭?chuàng)立的“少腹逐瘀湯”成為治療血瘀型滑胎的代表方劑[10]?；钛愃幬镫m屬妊娠禁忌藥，但是遵循《素問(wèn)·六元正紀(jì)大論篇》“有故無(wú)殞，亦無(wú)隕，衰其大半而止”的治療原則，醫(yī)者不拘于成見(jiàn)，可取得良好療效[11]。根據(jù)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)“腎虛血瘀”的病機(jī)特點(diǎn)，李佶提出的補(bǔ)腎活血方具有補(bǔ)腎活血安胎之效，在治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的12周妊娠通過(guò)率及妊娠結(jié)局療效滿意[3]，但現(xiàn)代藥理機(jī)制尚不明確。

胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程極其精細(xì)而復(fù)雜。在妊娠早期，胚胎和胎盤(pán)發(fā)育都在特定的氧濃度下進(jìn)行，氧被認(rèn)為是滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和分化的主要調(diào)節(jié)因素，胎盤(pán)發(fā)育是在相對(duì)缺氧的環(huán)境中發(fā)生。1996年GENBACEV O等[12]首先提出低濃度氧可提升人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，而大氣中氧濃度（21% O2，海平面水平）則刺激分化。妊娠10周前，EVT在螺旋動(dòng)脈內(nèi)形成“滋養(yǎng)細(xì)胞栓”，成功地防止母體血液進(jìn)入絨毛間隙，從而創(chuàng)建了早期妊娠生理性低氧環(huán)境（2%~3% O2）[13]。早孕期，滋養(yǎng)細(xì)胞在低氧條件下增殖，孕12周以后，胎盤(pán)絨毛經(jīng)歷著缺血再灌注，隨之滋養(yǎng)細(xì)胞周圍氧濃度逐漸增加（8% O2），在高氧條件下分化成具有侵襲表型的滋養(yǎng)細(xì)胞，逐步浸潤(rùn)到子宮膜、子宮肌層的淺1/3及相關(guān)的螺旋小動(dòng)脈，確保廣泛的螺旋動(dòng)脈重鑄[14]。

機(jī)體通過(guò)調(diào)節(jié)一系列基因表達(dá)的變化來(lái)適應(yīng)慢性低氧環(huán)境，其中缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）受缺氧的誘導(dǎo)，在低氧狀態(tài)的調(diào)控中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β構(gòu)成的2個(gè)亞基的異源二聚體，其中HIF-1α亞基表達(dá)受低氧誘導(dǎo)，HIF-1β亞基屬構(gòu)建型表達(dá)，不受低氧的調(diào)節(jié)和影響。人類胎盤(pán)在氧合方面提供了一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境，經(jīng)歷了一個(gè)從缺氧環(huán)境到更高氧合環(huán)境的過(guò)渡，這種氧張力和動(dòng)態(tài)HIF-α信號(hào)的生理開(kāi)關(guān)是胎盤(pán)發(fā)育所必需的[15]。在缺氧情況下，HIF-1α的泛素-蛋白酶體降解途徑被阻斷導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)蓄積，從而啟動(dòng)下游因子的轉(zhuǎn)錄與翻譯。HIF-1α在妊娠早期調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)缺氧條件的適應(yīng)，穩(wěn)定的HIF-1α轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，與血管生成調(diào)節(jié)的靶基因缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)胚胎新生血管生成，增加血管通透性，減輕組織缺氧情況[16]。血管表皮生長(zhǎng)因子（VEGF）屬于一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，是受HIF-1α調(diào)控的下游因子之一，HIF-1α與VEGF的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合后啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄與翻譯，使其相關(guān)產(chǎn)物表達(dá)增加，VEGF在低氧條件下表達(dá)也被上調(diào)[17]。VEGFA是VEGF生長(zhǎng)因子家族的重要成員之一，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管形成等作用。研究證實(shí)VEGF的表達(dá)減弱與早孕丟失有關(guān)[18]。ZHU L J等[19]通過(guò)對(duì)稽留流產(chǎn)患者及健康早孕女性孕7~10周的絨毛組織進(jìn)行比較，顯示稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中活性氧簇（ROS）水平明顯增高，而HIF-1α濃度明顯降低。這提示高氧狀態(tài)可引起HIF-1α低表達(dá)，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖力下降，血管生成障礙導(dǎo)致SPA重鑄不足。NüSKEN E等[20]報(bào)道了缺氧條件下（0.1%、1%、3% O2）培養(yǎng)正常足月胎盤(pán)原代滋養(yǎng)層細(xì)胞中HIF-1α蛋白和HIF-1α mRNA表達(dá)的增加。WANG K等[21]在低氧處理的人滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo中也取得了同樣的結(jié)果。研究顯示活血化瘀中藥可以增加血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF的敏感性，進(jìn)而促進(jìn)血管出芽、生長(zhǎng)，形成新的血管新枝，促進(jìn)血管的生成與重建[22]。郝樂(lè)樂(lè)等[23]研究證實(shí)補(bǔ)腎安胎沖劑能改善復(fù)發(fā)性流產(chǎn)小鼠母胎界面血管生成，提高血清和蛻膜組織中HIF-1α蛋白水平和HIF-1αmRNA表達(dá)水平，因此，HIF-1α適度表達(dá)與維持正常妊娠的表達(dá)相關(guān)。

CoCl2是比較常用的低氧模型誘導(dǎo)劑，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬低氧環(huán)境發(fā)現(xiàn)了HIF-1α/VEGFA信號(hào)通路在胚胎發(fā)育過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果顯示低氧環(huán)境可以促進(jìn)絨毛血管生成，在補(bǔ)腎活血方凍干粉的作用下可以使體外培養(yǎng)的HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞小管形成進(jìn)一步增加，同時(shí)提高滋養(yǎng)細(xì)胞HIF-1αmRNA、VEGFA mRNA和蛋白的表達(dá)。妊娠早期HIF-1αmRNA活性的上調(diào)提高了組織細(xì)胞在缺血缺氧情況下的存活能力，增加組織在缺氧環(huán)境中的血管生成；但組織若長(zhǎng)期處于缺氧環(huán)境下HIF-1α的表達(dá)可能降低。此外，隨著妊娠進(jìn)程胚胎發(fā)育氧含量向正常轉(zhuǎn)變，為了防止胚胎受到再灌注過(guò)程中氧自由基的損害，HIF-1α可以改善胚胎組織細(xì)胞低氧環(huán)境下的能量代謝[24]。因此，補(bǔ)腎活血方對(duì)RSA作用機(jī)理還有待進(jìn)行更加深入的探討。綜上所述，本研究探討了絨毛血管生成與HIF-1α/VEGFA信號(hào)通路之間的關(guān)系及補(bǔ)腎活血方的調(diào)控作用，為臨床應(yīng)用補(bǔ)腎活血方治療RSA提供了一定的理論依據(jù)。