陳 麗，蔡惠鈴，李影雄，孟泳錚，李敏霞

（1.佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510102）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種全身性慢性疾病，是冠心病、缺血性腦卒中等多種心腦血管疾病最重要的病理基礎(chǔ)，最終致死率和致殘率非常高[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，冠心病、腦卒中等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病是我國(guó)居民致死的首要原因，嚴(yán)重威脅我國(guó)居民的健康，降低生活質(zhì)量[2]。而且隨著生活方式的改變和老齡人口的劇增，AS的發(fā)病率明顯上升并且趨于年輕化。脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化損傷、細(xì)胞外基質(zhì)降解等均是導(dǎo)致AS發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制[3]。AS屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“脈痹”“中風(fēng)”等范疇，其核心病機(jī)為瘀血痹阻。注射用丹參多酚酸鹽由丹參提取而成，具有活血、化瘀、通脈等功效，本課題組臨床研究發(fā)現(xiàn)注射用丹參多酚酸鹽可以降低冠心病、腦卒中患者頸動(dòng)脈斑塊厚度，縮小斑塊面積，但其機(jī)制仍未闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了AS大鼠模型，并給予注射用丹參多酚酸鹽干預(yù)，觀察其對(duì)AS大鼠斑塊、血脂、炎癥、氧化損傷、細(xì)胞外基質(zhì)等的影響，初步探討其防治AS的作用和可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠43只，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2019-0035；飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（22±2）℃，濕度50%~60%，12 h明暗交替。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用過(guò)量麻醉法處死。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料81.3%、豬油10%、蔗糖5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、膽酸鈉0.5%、膽固醇3%；基礎(chǔ)飼料和高脂飼料委托廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行加工。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)佛山市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 注射用丹參多酚酸鹽（上海綠谷制藥有限公司，批號(hào)：20190113，規(guī)格：100 mg/瓶）；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：20181215，規(guī)格：10 mg/片）；血脂試劑盒[總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（貨號(hào)：HL20142）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒（貨號(hào)：HL20195）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒（貨號(hào)：HL20197）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒（貨號(hào)：HL20196）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）試劑盒（貨號(hào)：HL10046）]（上海哈靈生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（貨號(hào)：ER1393）、白介素-1β（IL-1β）試劑盒（貨號(hào)：ER1094）、白介素-6（IL-6）試劑盒（貨號(hào)：ER1105）、白介素-10（IL-10）試劑盒（貨號(hào)：ER0033）（武漢菲恩生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號(hào)：GD-AW1922）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（貨號(hào)：GD-JG0454-E）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號(hào)：GD-S1921-A）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）試劑盒（貨號(hào)：GD-DS1710）、血管細(xì)胞黏附分子-1（Vascular Cell Adhesion Molecule-1，VCAM-1）試劑盒（貨號(hào)：GD-DX1591）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases-9，MMP-9）試劑盒（上海古朵生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器TGL-15M臺(tái)式微量高速冷凍離心機(jī)（湖南平凡科技有限公司）；AU5800全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)中國(guó)有限公司）；HBS-1096C酶標(biāo)分析儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Tissuelyser-24冷凍液氮低溫研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.4 造模與分組43只大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)取10只作為對(duì)照組。其余33只大鼠參照文獻(xiàn)[4]建立AS大鼠模型，造模第1天一次性腹腔注射維生素D3 60萬(wàn)U/kg，并且給予高脂飼料喂養(yǎng)（20 g/d）；對(duì)照組大鼠一次性腹腔注射等體積的生理鹽水，并且給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)（20 g/d），造模時(shí)間為8周。AS模型成功的標(biāo)準(zhǔn)[5]：主動(dòng)脈見斑塊形成。8周后，27只大鼠造模成功，造模成功率為81.82%（27/33）。隨后將成模27只大鼠隨機(jī)分為模型組、丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組，每組9只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 按照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”，丹參多酚酸鹽組大鼠予以注射用丹參多酚酸鹽腹腔注射，20 mg/（kg·d）；阿托伐他汀組大鼠灌胃給予阿托伐他汀鈣片溶液，2 mg/（kg·d），對(duì)照組和模型組大鼠予以等體積的生理鹽水腹腔注射，連續(xù)給藥4周。4周后處死大鼠，取材并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 血清指標(biāo) 腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，剖開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，離心后取血清，采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C，ELISA法檢測(cè)血清ox-LDL、TNF-α、IL-1β、IL-6含量，光度法測(cè)定血清SOD、GSH-Px、MDA含量。

1.6.2 主動(dòng)脈病理變化 處死大鼠，取主動(dòng)脈，生理鹽水沖洗后4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色。光鏡下觀察主動(dòng)脈病理變化。

1.6.3 主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量 取適量大鼠主動(dòng)脈組織，PBS反復(fù)清洗去除血液，稱重，將主動(dòng)脈和PBS加入勻漿器后充分研磨，再利用超聲破碎。勻漿液經(jīng)5 000 g離心5 min后取上清液，采用ELISA法檢測(cè)MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠主動(dòng)脈病理變化 對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜、外膜均未見增生、肥厚；模型組大鼠主動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞明顯增生，血管壁明顯增厚，大量泡沫細(xì)胞聚集，形成一動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠主動(dòng)脈中膜輕微增生，無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。（見圖1）

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈病理變化（HE，×200，標(biāo)尺=100μm）

2.2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox-LDL含量比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯升高（P<0.05），HDL-C含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯降低（P<0.05），HDL-C含量明顯升高（P<0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox-LDL含量比較（±s，n=9）

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯升高（P<0.05），IL-10含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯降低（P<0.05），IL-10含量明顯升高（P<0.05）。（見圖3）

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖3各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量比較（±s，n=9）

2.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA含量比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MDA含量明顯升高（P<0.05），SOD、GSH-Px含量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠血清MDA含量明顯降低（P<0.05），SOD、GSH-Px含量明顯升高（P<0.05）。（見圖4）

圖4 各組大鼠SOD、GSH-Px、MDA含量比較（±s，n=9）

2.5 各組大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，丹參多酚酸鹽組和阿托伐他汀組大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯降低（P<0.05）。（見圖5）

圖5 各組大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量比較（±s，n=9）

3 討 論

中醫(yī)學(xué)無(wú)AS之病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“脈痹”“中風(fēng)”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其核心病機(jī)為瘀血痹阻，氣為血之帥，血為氣之母，氣血失和，或氣虛而滯，或氣郁而滯，均可引起血流不暢，瘀血內(nèi)生，痹阻血脈，化生斑塊[6-8]。痰濁、寒凝、水濕等均可以導(dǎo)致血運(yùn)不暢，滯而成瘀，痹阻血脈，化生斑塊。因此，治療上應(yīng)以活血化瘀為大法。注射用丹參多酚酸鹽是由丹參經(jīng)提取的多酚酸鹽化合物組成，丹參味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛等功效。注射用丹參多酚酸鹽具有活血、祛瘀、通絡(luò)功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，注射用丹參多酚酸鹽具有抗氧化損傷、抑制炎癥等作用[9]。

動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制尚未完全闡明，脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化損傷、細(xì)胞外基質(zhì)降解等在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中均起到重要的作用。脂質(zhì)代謝紊亂是導(dǎo)致AS的最重要病理基礎(chǔ)，血液中TG、TC、LDL-C含量升高可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，引發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙，單核細(xì)胞通過(guò)破損的血管內(nèi)皮進(jìn)入內(nèi)膜間隙，并吞噬ox-LDL形成泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞可以刺激生長(zhǎng)因子釋放，進(jìn)而促進(jìn)血管平滑肌增殖，血管壁肥厚，形成脂質(zhì)條紋并進(jìn)展為動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[10-11]。HDL-C可以通過(guò)促進(jìn)膽固醇運(yùn)載至外周組織細(xì)胞，從而減少脂質(zhì)沉積于血管內(nèi)膜[12]。因此，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝是防治AS的關(guān)鍵。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS模型組大鼠主動(dòng)脈斑塊形成，血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯升高，HDL-C含量明顯降低；而丹參多酚酸鹽組大鼠主動(dòng)脈無(wú)斑塊形成，血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL含量明顯降低，HDL-C含量明顯升高。因此，注射用丹參多酚酸鹽具有抑制和減緩動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝途徑實(shí)現(xiàn)。

有學(xué)者提出動(dòng)脈粥樣硬化屬于一種慢性低度炎癥性反應(yīng)。在AS形成過(guò)程中，平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子，導(dǎo)致機(jī)體處于一種慢性低度炎癥反應(yīng)狀態(tài)。TNF-α可以增加血管內(nèi)皮的通透性，從而促使LDL-C進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞[13-14]。而且TNF-α還可以刺激IL-1β、IL-6釋放，加重血管炎癥反應(yīng)[15]。IL-1β可以通過(guò)促進(jìn)黏附因子表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞增殖介導(dǎo)AS形成[16]。IL-6可以加強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)，促進(jìn)黏附因子的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管內(nèi)皮平滑肌細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致斑塊形成，并可以導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定[17]。IL-10是一種強(qiáng)效抑炎因子，可以抑制炎癥因子的生成和釋放，抑制平滑肌細(xì)胞增殖，減緩動(dòng)脈粥樣硬化。因此，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子的表達(dá)和促進(jìn)IL-10的表達(dá)可以改善動(dòng)脈粥樣硬化。氧自由基可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)脂質(zhì)和單核細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)膜下，導(dǎo)致斑塊形成[18-19]。而機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶可以清除氧自由基，減輕氧化損傷。SOD、GSH-Px是機(jī)體內(nèi)的主要抗氧化酶，可以清除氧自由基。MDA是機(jī)體內(nèi)的氧化代謝產(chǎn)物，反映機(jī)體氧化損傷的嚴(yán)重程度。SOD、GSH-Px、MDA是反映機(jī)體氧化損傷的重要標(biāo)志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量明顯升高，IL-10、SOD、GSH-Px含量明顯降低；而丹參多酚酸鹽組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量明顯降低，IL-10、SOD、GSH-Px含量明顯升高。說(shuō)明注射用丹參多酚酸鹽可以通過(guò)下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA的表達(dá)，上調(diào)IL-10、SOD、GSH-Px的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化損傷從而抑制和減緩AS的形成。

VCAM-1是一種由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的糖蛋白，可以促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等黏附在破損血管內(nèi)壁，遷移至血管內(nèi)膜后形成泡沫細(xì)胞，介導(dǎo)AS進(jìn)展[20]。MCP-1可以趨化單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞遷移至血管內(nèi)膜下，趨化炎性細(xì)胞聚集，介導(dǎo)斑塊形成。細(xì)胞外基質(zhì)是血管壁的重要組成部分，其降解和重塑參與了AS的發(fā)生發(fā)展[21]。MMP-9可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定和斑塊形成。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS模型組大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯升高；而丹參多酚酸鹽組大鼠主動(dòng)脈MCP-1、VCAM-1、MMP-9含量明顯降低。說(shuō)明注射用丹參多酚酸鹽可以通過(guò)抑制MCP-1、VCAM-1、MMP-9的表達(dá)而抑制AS的形成。

綜上所述，注射用丹參多酚酸鹽可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂代謝，抑制炎癥和抗氧化損傷改善動(dòng)脈粥樣硬化。