岳慧慧 張鳳芹 賀健晗 張惠蘭 王從義

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 生物醫(yī)學(xué)研究中心國(guó)家衛(wèi)生健康委呼吸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430030

特發(fā)性肺纖維化 (idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病,其臨床特征表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難、低氧血癥,伴或不伴干咳,最終進(jìn)展為呼吸衰竭而導(dǎo)致死亡[1]。IPF的病理特征主要表現(xiàn)為普通型間質(zhì)性肺炎,其組織學(xué)特征是病變呈斑片狀分布,主要累及胸膜下肺組織,顯微鏡下可見(jiàn)正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺組織呈現(xiàn)纖維化、蜂窩狀改變,致密的纖維化瘢痕區(qū)伴隨著散在分布的成纖維細(xì)胞灶[2]。IPF的發(fā)病機(jī)制尚不明確,目前研究認(rèn)為IPF是由多基因遺傳(如SFTPC、TOLLIP等的基因突變)和環(huán)境危險(xiǎn)因素(如吸煙和感染)之間復(fù)雜的相互作用所致[3]。值得注意的是,近年來(lái)人們關(guān)注到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與纖維化疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4],因此研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在IPF中的作用機(jī)制具有重要意義。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞中最大的細(xì)胞器,參與多種細(xì)胞活動(dòng),包括負(fù)責(zé)新合成蛋白的修飾和折疊、糖原的產(chǎn)生和儲(chǔ)存、脂質(zhì)生物合成及維持鈣穩(wěn)態(tài)[5]。當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境和遺傳因素交互作用時(shí),可導(dǎo)致內(nèi)腔中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)累積,進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和激活未折疊蛋白反應(yīng)。未折疊蛋白反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑,主要通過(guò)3種未折疊蛋白反應(yīng)壓力傳感器的激活而啟動(dòng):蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、轉(zhuǎn)錄激活因子6 和肌醇需要酶1α[6-7]。研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路可通過(guò)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡、成纖維細(xì)胞分化、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化和巨噬細(xì)胞極化等參與肺纖維化形成[4,8]。ERp57,也稱為PDIA3、ERp60或GRP58,是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因家族中的一員,其包含4個(gè)硫氧還原蛋白樣結(jié)構(gòu)域折疊[9]。研究已揭示ERp57具有氧化還原和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過(guò)與分子伴侶鈣網(wǎng)蛋白和鈣連接蛋白協(xié)同作用參與新合成蛋白質(zhì)的折疊和修飾[10]。ERp57 在器官組織中廣泛表達(dá),其表達(dá)失調(diào)與多種疾病的發(fā)生相關(guān),包括神經(jīng)退行性疾病、肌肉骨骼系統(tǒng)狀況、腎纖維化、氣道炎癥和癌癥等[11]。然而,ERp57對(duì)成纖維細(xì)胞活化的影響以及在IPF 中的作用尚待闡明。因此,本研究將從臨床標(biāo)本和動(dòng)物模型出發(fā),探究ERp57的表達(dá)特征,繼而通過(guò)人肺原代成纖維細(xì)胞探究ERp57對(duì)成纖維細(xì)胞活化的影響,以期為IPF 的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本

1.1.1 實(shí)驗(yàn)小鼠 實(shí)驗(yàn)性研究。所有實(shí)驗(yàn)小鼠均采用野生型C57BL/6 背景小鼠,8～10 周齡,雄性,統(tǒng)一從湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買,且動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院科研大樓無(wú)特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均嚴(yán)格遵循美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所規(guī)定的相關(guān)原則,并已通過(guò)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物研究委員會(huì)的批準(zhǔn)(TJH-201901012)。

1.1.2 人體肺組織 根據(jù)ATS/ERS提供的IPF診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)患者及其家屬同意后,收集在華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院行肺移植或心肺聯(lián)合移植的IPF 患者的肺組織以及肺組織手術(shù)切除患者(臨床診斷為肺部腫塊性質(zhì)待查,影像學(xué)上無(wú)纖維化,術(shù)后病理診斷為良性病變,留取病變部位遠(yuǎn)端大于5 cm 的正常肺組織)標(biāo)本作為對(duì)照組。本研究經(jīng)同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn) (TJIRB20210919),并獲取患者知情同意。

1.2 動(dòng)物模型 8～10周齡野生型小鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉 (5 μl/g)麻醉后氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素(bleomycin,BLM) (2.5 mg/kg,生理鹽水溶解),對(duì)照組小鼠給予相同劑量的生理鹽水,21 d后取肺組織。

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 將人體肺組織標(biāo)本置于無(wú)菌EP管,用剪刀、鑷子將氣管剝離,并剪碎,鋪于10 cm皿中,使其貼附于培養(yǎng)皿,采用含10%Gibco血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。成纖維細(xì)胞作為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞,在肺組織塊貼壁后的第3～4天,可見(jiàn)成纖維細(xì)胞爬出,呈梭形。之后進(jìn)行傳代,取3～6代的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Opti培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胰酶購(gòu)自武漢科瑞有限公司;Trizol,逆轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自日本Takara公司;RIPA裂解液購(gòu)自上海Beyotime公司;PVDF 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;ECL發(fā)光液購(gòu)自谷歌生物有限公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司;恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司;生物顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;Nano Drop微量分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司。BLM 購(gòu)自輝瑞制藥公司;重組人TGF-β1購(gòu)自美國(guó)Pepro Tech公司。

1.5 免疫組織化學(xué)分析 用4%多聚甲醛經(jīng)氣管內(nèi)灌注左肺24 h 后行石蠟包埋,切至5μm切片。脫蠟至水后,使用已經(jīng)建立的技術(shù)對(duì)切片進(jìn)行HE染色和Masson染色[12]。對(duì)于免疫熒光染色,脫蠟至水后,使用ERp57 抗體 (1∶100)和FSP1 抗體(1∶100)共孵育切片組織,之后孵育熒光二抗,使用奧林巴斯熒光顯微鏡進(jìn)行拍照。

1.6 蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析[13]。一抗包括膠原蛋白Ⅰ、纖連蛋白、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (alpha smooth muscle actin,α-SMA) (Proteintech,武漢,1∶1 000)、GAPDH(美國(guó)Santa Cruz公司,1∶1 000)、ERp57 (美國(guó)Abcam 公司,1∶1 000)。使用化學(xué)發(fā)光底物系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),灰度值用ImageJ軟件分析。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將人肺成纖維細(xì)胞接種在12孔板中 并 分 為4 組:對(duì) 照 組、TGF-β1組、ERp57 siRNA 組、ERp57 siRNA+TGF-β1組,待細(xì)胞密度為60% 左右開(kāi)始轉(zhuǎn)染。將ERp57 siRNA 和Lipofectamine 3000 充分混勻后,常溫孵育15 min,棄上清,將siRNA 和Lipofectamine 3000混合液加至12孔板內(nèi)。將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4～6 h,換液至正常含10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后,分別添加重組TGF-β1(10μg/L)刺激細(xì)胞24 h 后,收取細(xì)胞蛋白。本研究所用的ERp57 siRNA 序列為5′-AGACCCAAATATCGTCATA-3′ (銳 博 生物科技有限公司)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究中所有的實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示,采用GraphPad Prism (7.0版)軟 件 進(jìn) 行Student′st檢 驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERp57在IPF患者中的表達(dá)水平 收集IPF患者和對(duì)照組的臨床特征 (表1),蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明IPF患者中的ERp57蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(t=6.314,P＜0.01);同時(shí)IPF組成纖維細(xì)胞活化標(biāo)記α-SMA 蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(t=4.226,P＜0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)IPF患者和對(duì)照組ERp57、α-SMA 蛋白表達(dá)水平 A:電泳圖;B:ERp57蛋白相對(duì)表達(dá);C:α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)

表1 人體標(biāo)本的臨床特征

2.2 小鼠肺纖維化肺組織中ERp57表達(dá)特征 為進(jìn)一步檢測(cè)ERp57 在小鼠肺組織中的表達(dá)情況,利用經(jīng)氣道注射BLM 建立小鼠肺纖維化模型,HE和Masson染色顯示經(jīng)BLM 處理21 d后,小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡壁增厚,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);Masson染色示大量膠原纖維聚集,以上結(jié)果均為纖維化的典型表現(xiàn) (圖2)。蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光染色結(jié)果顯示,ERp57在BLM 小鼠纖維化肺組織中表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)。同時(shí),免疫熒光結(jié)果表明,ERp57 主要在纖維化小鼠的肺成纖維細(xì)胞中表達(dá),且與對(duì)照組相比,BLM 誘導(dǎo)小鼠的纖維化肺組織中,雙染陽(yáng)性數(shù)量顯著增加(t=7.443,P＜0.01)。見(jiàn)圖3～5。

圖2 對(duì)照組 (A、C)和博來(lái)霉素處理21 d后小鼠 (B、D)肺組織病理表現(xiàn) (每組3只小鼠) HE (A、B) Masson (C、D)×100

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)各組小鼠肺組織中ERp57、collagen Ⅰ的表達(dá) (每組3只小鼠) A:電泳圖;B:ERp57蛋白相對(duì)表達(dá);C:collagen Ⅰ相對(duì)表達(dá)

圖4 ERp57 (綠色)與FSP1 (紅色)的免疫熒光共染 ×400

圖5 雙染陽(yáng)性數(shù)目分析

2.3 成纖維細(xì)胞中ERp57的表達(dá) 提取正常對(duì)照人體肺原代成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),在鏡下可觀察到呈梭形的細(xì)胞,成纖維細(xì)胞特異性蛋白FSP1染色陽(yáng)性,以上表明該細(xì)胞為成纖維細(xì)胞 (圖6)。之后利用TGF-β1 刺激成纖維細(xì)胞0、12、24、48 h后收取蛋白,蛋白質(zhì)印跡 (圖7)結(jié)果顯示經(jīng)TGF-β1 刺 激 后,纖 連 蛋 白、α-SMA 和ERp57 的表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性增加 (P值均＜0.05)。同時(shí),細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光共染結(jié)果顯示經(jīng)TGF-β1刺激后,人原代成纖維細(xì)胞活化后ERp57的表達(dá)顯著升高(圖8)。綜上表明,ERp5 7表達(dá)水平的升高可能與成纖維細(xì)胞的活化密切相關(guān)。

圖6 成纖維細(xì)胞的鑒定分析 A:普通顯微鏡下的成纖維細(xì)胞 ×50;B:成纖維細(xì)胞的FSP1染色 ×200

圖7 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)經(jīng)TGF-β1 刺激后人肺原代成纖維細(xì)胞中fibronectin、ERp57 和α-SMA 的表達(dá)水平 A:電泳圖;B:fibronectin蛋白相對(duì)表達(dá);C:ERp57蛋白相對(duì)表達(dá);D:α-SMA 蛋白相對(duì)表達(dá)

圖8 免疫熒光染色檢測(cè)成纖維細(xì)胞活化后ERp57的表達(dá)水平 ×400

2.4 干擾ERp57 的表達(dá)對(duì)成纖維細(xì)胞活化的影響 為進(jìn)一步探究ERp57表達(dá)水平對(duì)成纖維細(xì)胞功能的影響,應(yīng)用siRNA敲減ERp5 7的表達(dá),蛋白質(zhì)印跡結(jié)果 (圖9)顯示,經(jīng)TGF-β1刺激后,抑制ERp57可顯著降低纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)水平 (P值均＜0.05)。這些結(jié)果提示抑制ERp57的表達(dá)能抑制成纖維細(xì)胞的活化及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。

圖9 蛋白質(zhì)印跡分析抑制ERP57表達(dá)水平后纖維化相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平 A:電泳圖;B:fibronectin相對(duì)表達(dá);C:collagenⅠ相對(duì)表達(dá)

3 討論

IPF作為一種發(fā)病機(jī)制不明,不可逆且致死率較高的難治性間質(zhì)性肺疾病,常以肺泡結(jié)構(gòu)破壞和肺間質(zhì)纖維化為特征[1]。隨著社會(huì)老齡化的快速進(jìn)展,IPF的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。盡管近年來(lái)人們?yōu)殛U述IPF的發(fā)病機(jī)制投入大量精力研究,但對(duì)于其確切致病機(jī)制的了解仍非常不足,這嚴(yán)重阻礙了針對(duì)這種難治性疾病的新型有效療法的發(fā)展。肺纖維化形成是由肺泡上皮細(xì)胞損傷所驅(qū)動(dòng),其反復(fù)損傷導(dǎo)致上皮細(xì)胞死亡和基底膜嚴(yán)重破壞,上皮修復(fù)難以完成,繼而啟動(dòng)肺泡上皮細(xì)胞 “重編程”,呈現(xiàn)多種促纖維化表型,并分泌大量促纖維化因子,形成促纖維化微環(huán)境[14]。作為纖維化形成的主要效應(yīng)細(xì)胞,成纖維細(xì)胞受到促纖維化微環(huán)境刺激后遷移聚集至損傷部位,并分化為肌成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白進(jìn)行組織重塑修復(fù),導(dǎo)致肺組織正常結(jié)構(gòu)的破壞和永久性瘢痕形成[15]。由此可見(jiàn),成纖維細(xì)胞的活化、增殖和遷移對(duì)纖維化形成起著決定性作用。故研究其生物學(xué)特性和相關(guān)功能的調(diào)控機(jī)制是發(fā)現(xiàn)治療IPF 疾病有效靶點(diǎn)的關(guān)鍵所在。本研究旨在進(jìn)一步揭示成纖維細(xì)胞活化的調(diào)控機(jī)制,為IPF 的治療提供潛在性藥物治療靶點(diǎn)。

既往研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)影響多種細(xì)胞類型來(lái)參與肺纖維化發(fā)生發(fā)展。Borok 等[16]的研究揭示上皮祖細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白GRP78的缺失誘導(dǎo)上皮細(xì)胞衰老凋亡而促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展。此外,Lee等[17]研究揭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白二硫化物異構(gòu)酶家族ERp46通過(guò)增強(qiáng)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)肺纖維化,而目前對(duì)于ERp57在肺纖維化中的作用仍缺乏研究。本研究從臨床水平和動(dòng)物模型出發(fā)證實(shí)ERp57在IPF患者和BLM 誘導(dǎo)的小鼠肺組織中高表達(dá),這與Kumar等[18]新近發(fā)表的結(jié)果一致,不同的是本研究關(guān)注到ERp57在肺成纖維細(xì)胞中處于高表達(dá)水平,提示ERp57影響肺纖維化的進(jìn)展不僅僅依賴于Club細(xì)胞,也可能通過(guò)影響成纖維細(xì)胞的功能進(jìn)而發(fā)揮作用。

鑒于成纖維細(xì)胞活化在纖維化的形成中起關(guān)鍵性作用,而TGF-β1已證實(shí)是影響成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素[19],促使我們進(jìn)一步探究ERp57與成纖維細(xì)胞活化的相關(guān)性。結(jié)果表明,在人肺原代成纖維細(xì)胞中,隨著TGF-β1刺激時(shí)間的延長(zhǎng),ERp57和纖維化指標(biāo)的表達(dá)水平呈逐漸升高。與此同時(shí),經(jīng)TGF-β1刺激后,敲減ERp57 可顯著抑制纖維化相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平。以上結(jié)果揭示ERp57功能缺失可抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,這可能與ERp57作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激伴侶蛋白,參與新合成蛋白的二硫鍵修飾有關(guān)[9]。

綜上所述,本研究證實(shí)了IPF患者和BLM 誘導(dǎo)的小鼠纖維化肺組織均存在ERp57 的高表達(dá),且在成纖維細(xì)胞中高表達(dá);體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),敲減ERp57可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞活化。因此,本研究數(shù)據(jù)揭示ERp57 的表達(dá)水平可能與IPF疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),靶向抑制ERp57基因可能有助于治療肺纖維化疾病。本研究的不足之處在于尚未進(jìn)一步揭示ERp57影響成纖維細(xì)胞活化的分子機(jī)制以及ERp57缺失對(duì)BLM 誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的影響?？傊?本研究工作為了解IPF的發(fā)病機(jī)制提供了新的啟示與切入點(diǎn),為開(kāi)發(fā)IPF疾病治療方案提供了潛在的靶點(diǎn)和堅(jiān)實(shí)的科學(xué)理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突