張海麗，畢 珂，陳長坤，趙樂為，朱 陶

(菏澤學院農(nóng)業(yè)與生物工程學院，山東 菏澤 274015)

引言

黑色素(Melanin)是廣泛存在于生物體中的一種棕黑或黑色色素，它是一類多酚聚合體或吲哚生物大分子，是頭發(fā)、皮膚、植物組織等表現(xiàn)黑色的本源，按植物黑色素的結(jié)構(gòu)可以將植物黑色素分為兩大類：一類為酪氨酸、多酚及其相關(guān)化合物代謝的最終產(chǎn)物；另一類為花色昔類.植物黑色素具有廣泛的生物活性，包括延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫力、抗紫外、抗氧化、清除自由基、保護心血管等，富含人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)和對人體有益的微量元素，如Fe、Mn、Cu等，同時，相對于合成黑色素而言，植物黑色素副作用小、安全性高，所以在食品加工、化妝品開發(fā)等方面都具有廣闊的應用前景.植物黑色素應用范圍很廣，它不僅是一類光保護劑、抗輻射劑、螯合劑、生物抗氧化劑和免疫促進劑，而且還可用作生物半導體材料和光電傳遞材料，具有抗蛇毒、抗癌、抑制艾滋病毒復制、治療帕金森癥等作用，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等方面有著廣泛的應用前景[1].

白亮[2]等探討了黑芝麻黑色素的自由基清除活性，結(jié)果表明黑芝麻黑色素對DPPH·有很強的清除能力.姚增玉等[3]分別測定了山杏種皮黑色素、抗氧化劑BHT和抗壞血酸(Vc)的清除自由基能力，結(jié)果表明，山杏種皮黑色素具有較強的清除羥自由基能力，其效果接近BHT而高于Vc，清除超氧陰離子的能力高于BHT和Vc.山杏種皮黑色素既可作為氫供體，清除DPPH·，但清除能力低于BHT和Vc；也可作為電子供體，還原能力高于BHT和Vc.還有研究表明，靈芝黑色素[4]具有較強的OH自由基和O2-自由基清除活性，是一種非常有潛力的天然黑色素.上述研究為從天然植物中尋找消除自由基劑和抗氧化資源提供了依據(jù).

壓榨法制備牡丹籽油的過程中會產(chǎn)生大量的牡丹籽殼等副產(chǎn)物，本研究以牡丹籽殼為原料，研究了牡丹籽殼中黑色素提取和純化的工藝條件，黑色素的理化性質(zhì)，作為美妝著色劑的穩(wěn)定性、抗氧化活性，提高了油用牡丹深加工產(chǎn)品的附加值，同時為進一步的工業(yè)化開發(fā)利用提供理論和技術(shù)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

牡丹籽殼,成熟牡丹籽曬干去黑色硬殼，種仁用來榨油，籽殼作為附屬產(chǎn)物，無法直接被應用，大都被當作廢物丟棄.

1.2 方法

1.2.1 黑色素提取的方法

本文以生產(chǎn)牡丹籽油后的牡丹籽殼為原料，采用超聲波輔助萃取技術(shù)，將乙醇作為提取劑，提取牡丹籽殼中的黑色素，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的減壓蒸餾方法獲取黑色素的粗品，再通過熱堿溶解、用酸調(diào)pH析出沉淀，最后減壓、過濾、干燥得到牡丹籽殼黑色素的精品[5].

1.2.2 黑色素總抗氧化能力的測定方法

本文配制了36 mL FRAP工作液，先稱取0.027 8 g FeSO4溶于雙蒸水定容至100 mL，取8支試管編號，配制一組不同濃度的FeSO4溶液：0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L，方法如下：分別加入10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL、4 mL、3 mL的水，加入0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL的1 mmol/L FeSO4溶液，再取8支試管分別加入4 mL的工作液和0.6 mL各濃度的FeSO4溶液混勻，37 ℃水浴加熱10 min，并根據(jù)光密度值繪制標準曲線.

分別配制濃度為0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL的牡丹籽殼黑色素溶液，取5支試管分別加入4 mL的工作液和0.6 mL各濃度的牡丹籽殼黑色素溶液，混勻，37 ℃水浴加熱10 min后進行定量測定[6].

1.2.3 黑色素對DPPH自由基清除能力的測定

首先配制不同濃度的牡丹籽殼黑色素溶液，梯度為1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL，再稱取NaCl 8.5 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 2.85 g，KH2PO40.27 g，溶于蒸餾水，定容至100 mL制得0.01 mol/L PBS，最后配制0.2 mmol/L DPPH溶液，按要求加入各濃度色素溶液2 mL、DPPH 2 mL、PBS 100 μL，避光反應20 min，517 nm下測各樣品的光吸收值.

1.2.4 黑色素對OH自由基清除能力的測定

配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L H2O2溶液和9 mmol/L水楊酸溶液，再分別配制1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL的牡丹籽殼黑色素溶液，在10 mL的試管中依次加入9 mmol/L FeSO4的溶液1 mL，濃度分別為1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL的牡丹籽殼黑色素溶液1 mL，1 mL 9 mmol/L的H2O2溶液，搖勻，靜置10 min，再加入9 mmol/L的水楊酸溶液2 mL，搖勻，37 ℃反應30 min，以去離子水進行參比，在510 nm下測量各樣品的光密度值.

1.2.5 黑色素對O2-自由基清除能力的測定

配制50 mmol/L PH8.2 Tris-HCI緩沖液和50 mmol/L鄰苯三酚溶液，再分別配制0.001 mg/mL、0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL的牡丹籽殼黑色素溶液，在反應體系中依次加入pH8.2，50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液3.8 mL，25 ℃預熱50 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.2 mL，25 ℃保溫10 min，再依次分別加入各濃度樣品溶液2 mL，將混合物于25 ℃下反應20 min，在327 nm下測定光密度值A(chǔ)3；將鄰苯三酚溶液用等體積25 ℃預熱0.1 mol/L HCl溶液代替，其他操作相同，測定光密度值A(chǔ)2；將樣品溶液用等體積的蒸餾水代替，其他操作相同，測定光密度值A(chǔ)1.

1.2.6 黑色素產(chǎn)品的制作

眼線液筆的制作過程如下.聚乙烯吡咯烷酮∶氧化鐵黑∶氧化鐵藍∶聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯∶丙二醇∶防腐劑∶乙醇∶超純水=22∶5∶20∶1.5∶5∶0.5∶5∶41，按比例將各組分溶于水中并加入適量黑色素即得.

睫毛膏的制作過程如下.硬脂酸三異丙醇酰胺∶石蠟(60 ℃)∶川蠟∶蜂蠟∶巴西棕櫚蠟∶羊毛脂∶無機顏料∶抗氧劑=32∶26∶5∶9∶2∶12∶14∶適量，按比例將各原料混合并加入適量黑色素即得.

2 結(jié)果與分析

2.1 黑色素的提取

采用75%乙醇作為黑色素的提取劑，且提取劑可以循環(huán)使用，無污染、無毒、成本低；超聲波萃取與常規(guī)溶劑萃取相比，時間短(30 min)、產(chǎn)率高(>10%)、條件溫和(溫度僅需45 ℃)，因而節(jié)能.

2.2 黑色素總抗氧化能力的測定結(jié)果

2.2.1 標準曲線的繪制

FRAP工作液呈茶色，當遇到FeSO4時會發(fā)生一系列的化學變化.使其呈現(xiàn)藍色，根據(jù)加入的FeSO4的濃度的不同，會呈現(xiàn)一系列梯度的藍色，且顏色深淺程度與FeSO4呈線性關(guān)系進而繪出標準曲線，樣品的總抗氧化能力就通過FeSO4的數(shù)量關(guān)系表現(xiàn)出來.

對0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L、0.7 mmol/L FeSO4標準溶液依次在593 nm處測光密度值，結(jié)果如表1所示.以光密度值為縱坐標，F(xiàn)eSO4標準樣溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，如圖1所示，R2=0.993 4，標準曲線方程為y=1.181 5x-0.045 4，為下步測牡丹原花色素總抗氧化能力做準備.

表1 FeSO4標準溶液在不同濃度對應的光密度值

圖1 FeSO4標準曲線

2.2.2 牡丹籽殼黑色素總抗氧化能力的測定

對0.01 mg/mL、0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL牡丹籽殼黑色素溶液進行定量測定，結(jié)果如表2所示，可以看出其總抗氧化能力隨著色素溶液濃度的增大而增強.

表2 牡丹籽殼黑色素總抗氧化能力的測定結(jié)果

2.3 黑色素對DPPH自由基清除能力的測定結(jié)果

DPPH(二苯代苦味?；杂苫?的乙醇溶液呈紫色，其自由基有單個電子，在517 nm處有特征吸收峰，當有自由基去除劑存在時，由于單電子配對從而使高吸收峰逐漸消失，醇溶液也開始褪色，且褪色程度與接受配對的電子數(shù)量呈線性關(guān)系，因而可用分光光度法進行定量分析.

DPPH自由基清除率(%)=

[1-(As-Ab)/Ac] ×100%[7]

(1)

式(1)中，As為牡丹原花色素溶液樣品與DPPH自由基混合后的光密度值；Ab為樣品液不加DPPH自由基的光密度值；Ac為不加樣品液的DPPH自由基溶液的空白光密度值.

結(jié)果如表3所示，由表3可以看出其對DPPH自由基具有很高的清除能力，且清除能力隨著色素溶液濃度的增大而增強.

2.4 黑色素對OH自由基清除能力的測定結(jié)果

利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生OH自由基，OH自由基易攻擊芳環(huán)化合物產(chǎn)生羥基化合物，因此可在體系中加入水楊酸捕捉體系中的OH自由基并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收峰.當有自由基去除劑存在時，生成的OH自由基就會減少，從而使有色化合物的量相應減少.采用固定反應時間法，在510 nm處測量含被測物反應液的吸光度，并與空白液比較，以測定被測物對羥自由基的清除作用.

OH自由基清除率(%)=

[1-(A-A1)/A0] ×100%[8]

(2)

式(2)中，A為加入樣品和顯色劑H2O2的光密度值；A1為樣品液不加顯色劑H2O2色素溶液的光密度值；A0為不加樣品液的空白對照的光密度值.

結(jié)果如表4所示，由表4可以看出其對OH自由基清除能力非常強，且清除能力隨著色素溶液濃度的增大而增強.

表4 牡丹籽殼黑色素溶液對OH自由基清除率

2.5 黑色素對O2-自由基清除能力的測定結(jié)果

超氧陰離子自由基很難用一般方法產(chǎn)生和檢測，但是在弱堿性條件下，鄰苯三酚能發(fā)生自氧化反應，生成O2-自由基和有色中間物質(zhì)，該中間物質(zhì)在327 nm處有一特征吸收峰.在初始階段，中間產(chǎn)物的量與時間成線性關(guān)系.當加入O2-自由基清除劑時，其能迅速與O2-自由基反應，從而阻止中間產(chǎn)物的積累，致使溶液在327 nm處吸收減弱.故可以通過測定OD327來評價清除劑對O2-自由基的清除作用.

O2-自由基清除率(%)=

[1-(A3-A2)/A1] ×100%[9]

(3)

式(3)中，A1為不加入樣品的空白對照的光密度值；A3為加入樣品液和鄰苯三酚的色素溶液的光密度值；A2為不加鄰苯三酚的色素溶液的光密度值.

結(jié)果如表5所示，由表5可以看出其對O2-自由基清除能力非常強，且清除能力隨著色素溶液濃度的增大而增強.

表5 牡丹籽殼黑色素溶液對O2-自由基清除率

2.6 黑色素產(chǎn)品的制作結(jié)果

黑色素加工產(chǎn)品如圖2所示，A為眼線液筆，B為睫毛膏.從外觀上看，我們的黑色素加工產(chǎn)品相對于普通產(chǎn)品來說顏色更深，除此以外，我們的產(chǎn)品還具有防紫外線、抗氧化、清除自由基等多重功效.本實驗得到的眼線液筆順滑易涂、一筆成型，并且防水耐汗，沖洗摩擦不易掉色，全天持妝無懼暈染，溫和易卸潔凈無殘留.睫毛膏膏體不易結(jié)塊，無香精不刺激，輕松刷出纖長濃密卷翹睫毛，放大雙眼效果極佳.

圖2 黑色素產(chǎn)品圖

3 討論

植物黑色素安全性較高，應用范圍很廣，但生產(chǎn)中缺乏黑色素含量高具有開發(fā)利用價值的原料.從植物中尋找和開發(fā)天然黑色素，具有重要的理論意義和實際價值.

牡丹籽油是牡丹籽脫殼后得到的牡丹籽仁經(jīng)壓榨法得到的油，大量的牡丹籽殼作為榨油的副產(chǎn)物被丟棄[10].本文以副產(chǎn)物牡丹籽殼為材料提取了天然有機成分黑色素并對其進行實驗探究和驗證，繼而將其添加入美妝產(chǎn)品，形成具有牡丹特色的化妝產(chǎn)品，不僅實現(xiàn)了對牡丹籽殼的深度開發(fā)，減少了牡丹籽殼研究價值的流失，同時推出了牡丹特色產(chǎn)品，且產(chǎn)品不僅無任何毒副作用，并且具有極強的抗氧化、抗紫外線、抗輻射、調(diào)節(jié)免疫力的功能.這些特色產(chǎn)品對牡丹深加工產(chǎn)品市場的拓展及中國化妝品的新興市場的開發(fā)具有很好的推進作用，目前我們已將提取的黑色素添加到制作的美妝產(chǎn)品如眼線液筆、睫毛膏中，今后，我們還會繼續(xù)推出眉筆、眉粉等具有牡丹特色的美妝產(chǎn)品，更好地促進牡丹廢棄資源深度開發(fā)和中國彩妝市場的發(fā)展.