李美雎，劉 葉，尚 軍，陳海娟

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008)

羌活為傘形科植物羌活(Notopterygiumincisum)或?qū)捜~羌活(Notopterygiumforbesii)的干燥根莖和根。性味與歸經(jīng)：辛、苦，溫，歸膀胱、腎經(jīng)。功能與主治：散寒、驅(qū)風(fēng)除濕、止痛。用于風(fēng)寒感冒，頭痛項(xiàng)強(qiáng)，風(fēng)濕痹痛，肩背酸痛[1]。羌活化學(xué)成分復(fù)雜，主要含有香豆素、揮發(fā)油、甾醇、氨基酸、有機(jī)酸等[2～7]。其中羌活含有2個(gè)活性成分falcarindiol(鐮葉芹二醇)和phenethyl ferulate(苯乙基阿魏酸酯)，對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抗菌活性[8，9]。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)天然藥物體外抗菌活性篩選方法，篩選出羌活抗菌活性部位，并以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產(chǎn)氣桿菌(Enterobacteraerogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、變形桿菌(Proteusvulgaris)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地羌活抗菌活性，以期為羌活抗菌活性藥物開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 研究方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 隔水恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)微量移液器(1 000 μL、200 μL、50 μL)、超聲波清洗器 (SB-5200TDT)、立式壓力蒸汽滅菌鍋(LS-35HD)、無(wú)菌操作臺(tái)、臺(tái)式低速離心機(jī)(TD5A)。

1.1.2 藥品與藥材 取采挖于青海省紅軍溝、松多、久治、大通、互助等地的羌活藥材，將其粉碎后過(guò)60目篩，密閉保存，備用。陽(yáng)性藥物青霉素鈉購(gòu)買于中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌這7株用于羌活活性部位篩選和抗菌活性比較的指示菌均來(lái)自于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，于-20 ℃低溫冰箱凍存，實(shí)驗(yàn)前3～4 h復(fù)活使用。

1.2 方法

1.2.1 羌活抑菌活性部位制備 將羌活藥材粉碎，過(guò)60目篩，以料液比1∶8，用無(wú)水乙醇超聲提取2 h，共3次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，得羌活粗提取物浸膏。加水將其制成混懸液，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮，干燥，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定各羌活提取物，加入1 mLDMSO超聲溶解，搖勻，精密量取0.2 mL樣品液于10 mL容量瓶中，加25%的DMSO定容至刻度，即供試品溶液。

1.2.3 陽(yáng)性藥溶液的制備 將青霉素鈉(80萬(wàn)單位)用25%DMSO稀釋至5萬(wàn)單位；空白組設(shè)為25%DMSO溶液。

1.2.4 菌懸液的配置 將實(shí)驗(yàn)菌活化后，加入無(wú)菌水輕輕刮下菌苔并按1∶9的比率稀釋成1×104倍，即菌懸液，備用。

1.2.5 抑菌活性考察

1.2.5.1 給藥方案及分組 空白組加入240 μL25%DMSO溶液；陽(yáng)性組加入240 μL5萬(wàn)單位青霉素鈉；實(shí)驗(yàn)組加入240 μL羌活不同部位供試品溶液，每組設(shè)3個(gè)平行組，重復(fù)3次。

1.2.5.2 抑菌活性部位篩選及比較 在無(wú)菌條件下，用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基制備不同產(chǎn)地的羌活抑菌活性部位，運(yùn)用牛津杯法考察羌活不同提取部位的抗菌活性，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)以x±s(此公式表示數(shù)值偏差平均數(shù)的變動(dòng)范圍，其中x表示平均數(shù)，s表示方差)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 羌活不同部位的抑菌作用

由表1可知，羌活5個(gè)活性部位對(duì)糞腸球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌效應(yīng)，與空白對(duì)照組相比除了水層對(duì)糞腸球菌和大腸桿菌抗菌效應(yīng)差異不顯著外，其它部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且不同部位間的抗菌效應(yīng)強(qiáng)弱不同，其中石油醚、水層及正丁醇3個(gè)部位對(duì)糞球菌抑菌效應(yīng)差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；水層部位對(duì)大腸桿菌抑菌效應(yīng)差異不顯著，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；氯仿部位與其它4個(gè)部位相比，對(duì)兩種菌的抑菌效應(yīng)均較強(qiáng)，差異極顯著(P<0.01)，故選取氯仿部位作為寬葉羌活抑菌活性部位。

表1 羌活不同部位間的抑菌作用

2.2 不同產(chǎn)地羌活的抑菌作用

由表2可知，不同產(chǎn)地羌活對(duì)受試菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性。與空白組相比紅軍溝、互助、大通產(chǎn)地羌活均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；松多、久治產(chǎn)地羌活除對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效應(yīng)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外，對(duì)其它菌的抑菌效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。其中，對(duì)陰溝腸桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是紅軍溝產(chǎn)地的羌活，顯著高于其它產(chǎn)地羌活，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；對(duì)大腸桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是松多產(chǎn)的羌活，顯著高于其它產(chǎn)地羌活，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；對(duì)產(chǎn)氣桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是松多產(chǎn)的羌活，顯著高于久治產(chǎn)的羌活，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)，與其它產(chǎn)地羌活差別不顯著；對(duì)變形桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是紅軍溝產(chǎn)地的羌活，與其它產(chǎn)地羌活差別不顯著；對(duì)糞腸球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是紅軍溝產(chǎn)地的羌活，顯著高于其它產(chǎn)地羌活，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；對(duì)銅綠假單胞菌抗菌效應(yīng)較弱，整體效果不佳；對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是久治產(chǎn)的羌活，與互助產(chǎn)羌活相比差異顯著(P<0.05或0.01)，與其它地區(qū)產(chǎn)羌活差異不顯著。

表2 不同產(chǎn)地羌活抑菌作用比較

3 討論

自從磺胺類藥物和青霉素應(yīng)用于臨床上，抗菌藥物得到廣泛使用，但是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的問(wèn)題也日益突出，嚴(yán)重威脅人類健康，中藥發(fā)展幾千年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明不少中藥具有抗菌活性、副作用小、很少產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，現(xiàn)在人們更傾向于選擇中藥進(jìn)行抗菌研究[10]。有研究報(bào)道，復(fù)方川紫方具有抗菌消炎、通絡(luò)止痛、行氣活血散瘀等功能，由川芎、紫草、羌活等十余味藥組成[11]。

不同產(chǎn)地羌活對(duì)受試菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，但對(duì)每一種菌的抗菌活性表現(xiàn)出一定的選擇性，提示羌活氯仿活性部位具有廣譜抗菌效應(yīng)，可作為羌活抗菌藥物開(kāi)發(fā)物質(zhì)基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)體外抗菌活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羌活的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水層、正丁醇5個(gè)活性部位，具有不同的抗菌效應(yīng)，其中氯仿部位較其它部位抗菌效應(yīng)更強(qiáng)(P<0.05)；不同產(chǎn)地羌活抗菌活性體現(xiàn)不一樣，對(duì)7個(gè)膽囊炎相關(guān)菌的作用不同，與空白組相比，紅軍溝、互助、大通產(chǎn)地的羌活抗菌活性顯著高于對(duì)照(P<0.05或0.01)，松多、久治產(chǎn)地的羌活除對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效應(yīng)無(wú)差異，對(duì)其它菌的抑菌效應(yīng)顯著增加(P<0.05或0.01)。由于本實(shí)驗(yàn)將人體給藥最大劑量換算為體外給藥劑量，所以關(guān)于羌活氯仿活性部位量效關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。