申 杰，張司璽，曹志威，張春陽(yáng)，趙志軍

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014010;2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;3.內(nèi)蒙古自治區(qū)骨組織再生與損傷修復(fù)工程技術(shù)中心)

脂肪干細(xì)胞(Adipose Derived Stem Cells,ADSCs)是近年來(lái)被廣泛研究具有自我復(fù)制和多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞。具有明確的定向成骨分化能力、自身儲(chǔ)存量巨大且易于提取與分離、體外培養(yǎng)能夠穩(wěn)定增殖傳代，且較低的免疫原性可用于自體移植等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各類與骨組織相關(guān)的科學(xué)研究領(lǐng)域中[1-2]。隨著材料制造技術(shù)的進(jìn)步，重建天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)細(xì)胞成骨礦化、更好的骨力學(xué)性能成為羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)及其相關(guān)材料新的發(fā)展方向。本文從HA及其多種新型材料的成分組成及結(jié)構(gòu)特性以及對(duì)ADSCs增殖活性及成骨分化的不同影響入手，通過(guò)對(duì)近年來(lái)出現(xiàn)的多種新型HA支架材料進(jìn)行總結(jié)，旨在為HA及ADSCs所構(gòu)成的生物組織工程骨的基礎(chǔ)研究與應(yīng)用發(fā)展提供更多的借鑒和指導(dǎo)。

1 單純HA及其納米材料

ADSCs成骨特性主要受誘導(dǎo)環(huán)境及成骨誘導(dǎo)因子影響，HA具有良好的骨傳導(dǎo)性及化學(xué)穩(wěn)定性，且人工合成的HA與正常人體骨組織中無(wú)機(jī)成分高度相似，可塑的孔隙結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)ADSCs成骨分化的特點(diǎn)使HA成為ADSCs在骨組織工程中最常應(yīng)用的支架材料之一。程勝承等[3]將ADSCs與HA共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，HA的存在可以提升ADSCs成骨標(biāo)志物—堿性磷酸酶(ALP)活性及相關(guān)成骨基因COL1A1、OPN、Runx2的表達(dá)水平，且梯度培養(yǎng)證明，濃度為20 mg/L的HA成骨誘導(dǎo)能力最佳，但隨著HA濃度提升，反而會(huì)抑制ADSCs增殖。

隨著納米科技的發(fā)展，納米羥基磷灰石(Nano-Hydroxyapatite，nHA)以其較小粒徑，能夠釋放Ca2+和PO43-促進(jìn)ADSCs成骨分化[4]。與ADSCs混合制成基質(zhì)膠注射入骨髓腔中，治療I型成骨不全[5]。通過(guò)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，nHA納米微環(huán)境擁有相互連通的孔隙類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)結(jié)構(gòu)，可提高相關(guān)分子的傳輸效率，并為ADSCs的附著提供充足接觸面積，而這種特殊的納米結(jié)構(gòu)很可能與細(xì)胞黏著斑(Focaladhesion)之間存在一定的相互作用[6]。因此nHA可在缺乏成骨誘導(dǎo)環(huán)境的情況下促進(jìn)ADSCs定向分化為成熟骨細(xì)胞。

2 共聚復(fù)合材料

盡管單純HA具有良好的可塑性，但其如陶瓷般的脆性及較差的延展性等缺點(diǎn)，很大程度上限制其在骨組織工程中的應(yīng)用前景。增加適度的柔韌性，提升其斷裂伸長(zhǎng)率并改善HA的力學(xué)性能,甚至通過(guò)重塑微環(huán)境結(jié)構(gòu)使其更有利于ADSCs的貼附生長(zhǎng)及成骨礦化，與其他生物材料進(jìn)行共聚復(fù)合成為HA改性的重要方法。Wang等[7]將聚癸二酸甘油酯(PGS)中的氫氧根替換馬來(lái)酸酐(gM)并與HA復(fù)合制成新型nHA/PGS-M復(fù)合支架，擁有良好回彈力的同時(shí)，150～300 μm大小的孔隙結(jié)構(gòu)在接種ADSCs之后可以促進(jìn)其成骨分化，Runx2、骨鈣素、Col1A1等成骨相關(guān)因子表達(dá)也增高。

膠原蛋白(Collagen)及其水解產(chǎn)物明膠(Gelatin)均具有良好的生物活性及結(jié)構(gòu)彈性，成為改善HA固有脆性的復(fù)合選擇。Weiss-Bilka等[8]將HA與膠原蛋白復(fù)合，制成擁有較高孔隙率、適宜手術(shù)固定的圓孔結(jié)構(gòu)、良好彈性及延展性的支架材料，這種新型的膠原蛋白/HA復(fù)合支架不僅能夠促進(jìn)ADSCs向成骨細(xì)胞分化，還能促進(jìn)血管生成以及鈣質(zhì)沉積。Mazzoni等[9]也研發(fā)制備名為Coll/Pro Osteon 200的新型HA/膠原蛋白共聚支架，復(fù)合ADSCs用于治療頜面部骨缺損病人并取得良好療效，ALP、OGN和CLEC3B等基因的表達(dá)增高，臨床評(píng)估顯示該新型支架材料有促進(jìn)ADSCs成骨分化及骨骼再生的作用。而在明膠與HA共聚應(yīng)用方面，Sattary等[10]使用電紡絲技術(shù)成功制備聚己內(nèi)酯/明膠/nHA/Vit D3新型復(fù)合支架，兼具柔韌性的同時(shí)nHA與Vit D3協(xié)同作用使ADSCs的成骨分化能力大大提升，ALP和Runx2的成骨表達(dá)期提前21 d。Wenz等[11]將甲基丙烯?；揎椇蟮拿髂z與nHA復(fù)合而成三維支架，將ADSCs與人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)共同封裝進(jìn)行培養(yǎng)14 d后，ADSCs成骨分化能力增強(qiáng)，同時(shí)微血管的穩(wěn)定增殖也有利于ADSCs分化和增殖。Amjadian等[12]將左旋聚乳酸(PLLA)與明膠采用靜電紡絲技術(shù)合成納米纖維，再將nHA嵌入其中制成新型支架材料，將常用的成骨誘導(dǎo)成分—地塞米松滲入支架孔隙之中，用以誘導(dǎo)ADSCs的成骨分化并取得明確效果。ALP活性、鈣鹽沉積和相關(guān)成骨基因表達(dá)均增加，而這種新型支架優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度和拉伸性使其成為骨組織工程中支架材料的優(yōu)秀選擇。Lee等[13]也做過(guò)類似研究，其在PLLA/明膠/HA支架材料中，利用PLLA的藥物控釋特性將辛伐他丁(Simvastatin，SIM)包封其中，同時(shí)用β-環(huán)糊精(β-CD)作為連接劑穩(wěn)定支架的力學(xué)性能(如圖1)，ALP及茜素紅染色顯示這種支架材料不僅能夠促進(jìn)ADSCs礦化，同時(shí)相較于無(wú)SIM的對(duì)照組，Runx2等成骨基因表達(dá)上調(diào),說(shuō)明SIM修飾的新型支架對(duì)ADSCs的成骨分化能力也具有促進(jìn)作用。

圖1 β-環(huán)糊精修飾并控釋辛伐他丁的PLLA/明膠/HA支架

絲素蛋白(Silk Fibroin，SF)是通過(guò)去除蠶絲中的絲膠，避免免疫排斥反應(yīng)而獲得的一種天然可降解的高分子纖維蛋白，具有良好的降解性、可塑性、生物相容性和力學(xué)性能等，優(yōu)點(diǎn)使其在外科領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用歷史。利用SF的優(yōu)良韌性和可降解性，改變HA降解緩慢且脆性較高的缺點(diǎn)。施詠毅[14]將復(fù)合ADSCs的SF/HA支架植入兔股骨遠(yuǎn)端骨缺損取得了較好的修復(fù)效果。劉浩等[15]利用3 mL濃度為1 %的絲素蛋白與480 mg的nHA干粉混合干燥后，制備SF/HA支架，在接種ADSCs后通過(guò)MTT法和堿性磷酸酶分別檢測(cè)其細(xì)胞活性和成骨能力后發(fā)現(xiàn)，相較于兩種單純材料，復(fù)合后的新型材料不僅在力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度上有更好的表現(xiàn)，其促成骨能力也更強(qiáng)。丁曉明等[16]采用相分離/瀝濾技術(shù)制備的SF/HA多孔性支架擁有更好的結(jié)構(gòu)性能，其均勻且相互連通的多孔結(jié)構(gòu)更適宜ADSCs的貼附和生長(zhǎng)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，相關(guān)成骨基因OPN及Osteonectin的表達(dá)量也隨之增加。Eunkyung等[17]也利用靜電紡絲技術(shù),將HA顆粒混合于絲素蛋白納米材料中,通過(guò)粘附性聚多巴胺(PDA)將另一部分HA顆粒固定于材料表面形成層功能化HA/SF納米支架材料(如圖2)，不僅其力學(xué)性能得到改善，且能夠?yàn)锳DSCs提供更為優(yōu)異的成骨礦化環(huán)境。通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)對(duì)ADSCs進(jìn)行基因修飾進(jìn)一步增強(qiáng)其成骨能力，并在動(dòng)物模型中實(shí)現(xiàn)較好的臨界大、小顱骨缺損修復(fù)效果[17]。丁濤等[18]更是在SF/HA支架的基礎(chǔ)上，復(fù)合經(jīng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-14(BMP-14)轉(zhuǎn)染的ADSCs修復(fù)大鼠尾椎缺損，這種支架材料不僅能夠促進(jìn)ADSCs的黏附和增殖，同時(shí)BMP-14促進(jìn)ADSCs成骨分化并與SF/HA融合形成新骨，術(shù)后8周可見(jiàn)修復(fù)部位骨密度增高，并有大量骨痂形成。

圖2 雙層功能化HA/SF納米支架結(jié)構(gòu)示意圖

β-磷酸三鈣(β-Calcium Phosphate Tribasic，β-TCP)由鈣和磷構(gòu)成，是磷酸三鈣的高溫相，具有良好的生物相容性、能與骨組織直接融合、無(wú)炎癥等不良反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，使其成為骨組織工程領(lǐng)域的常用材料。其鈣磷原子比為1.5，相比HA更易在體內(nèi)降解吸收，同時(shí)與HA復(fù)合而成的HA/β-TCP支架，可根據(jù)其不同的表面構(gòu)造、結(jié)晶構(gòu)型決定其支架材料的強(qiáng)度和體內(nèi)降解速率，適宜的孔隙大小能夠更好的引導(dǎo)ADSCs遷移和增殖，促進(jìn)ADSCs向成骨細(xì)胞分化。王騰飛等[19]利用成分比為6∶4的HA/β-TCP支架材料搭載ADSCs后修復(fù)兔腰椎缺損，修補(bǔ)區(qū)的新型材料基本降解吸收，實(shí)現(xiàn)材料與正常骨組織的骨性結(jié)合。Hashemibeni等[20]將ADSCs復(fù)合于HA/β-TCP后，用以修補(bǔ)犬脛骨圓柱形骨缺損后發(fā)現(xiàn)，相較于單純使用HA/β-TCP在修補(bǔ)部位形成更加厚實(shí)的骨小梁和礦化基質(zhì)，修復(fù)后的骨質(zhì)硬度較好。吳洪亮[21]也利用HA/β-TCP作為人工骨支架載體，復(fù)合經(jīng)低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)轉(zhuǎn)染的ADSCs后對(duì)兔股骨頭壞死進(jìn)行移植修復(fù)，利用HIF-1α的高表達(dá)促進(jìn)血管生成以改善缺血現(xiàn)象，同時(shí)礦化的ADSCs復(fù)合HA/β-TCP實(shí)現(xiàn)較好的股骨頭再生，這不僅為骨組織工程學(xué)應(yīng)用于臨床復(fù)雜結(jié)構(gòu)的骨修復(fù)建立了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為骨替代治療中血管生成這一難題提供了新的思路和方向。

聚乳酸(Polylactic Acid，PLA)是一種可由淀粉原料提煉制成的新型生物可降解材料，其良好的可塑性，降解無(wú)毒及藥物控釋等特性在材料及藥物領(lǐng)域被廣泛研究。在上述HA與明膠共聚物的骨修復(fù)研究中，聚乳酸多次出現(xiàn)。Smieszek等[22]更是發(fā)現(xiàn)左旋聚乳酸(PLLA)與nHA最適配比，當(dāng)nHA在聚合材料中占比10 %時(shí)ADSCs的黏附力及其增殖活性最好。與此同時(shí)，聚乳酸還有另外一種與HA合作的特別方式，Ma等[23]采用流動(dòng)蒸發(fā)法在nHA的表面形成一層PLA納米膜，其nHA側(cè)可以有效促進(jìn)ADSCs成骨分化，PLA膜的隔絕效果可以有效防止ADSCs與其他組織細(xì)胞共同黏附于HA材料表面造成的組織粘連，達(dá)到更好的骨缺損修復(fù)效果。

3 元素修飾材料

通過(guò)復(fù)合其他生物材料達(dá)到HA改性之外，一些元素的修飾和摻雜也可以發(fā)揮類似作用。鍶元素(Sr)是一種類似鈣生物學(xué)功能的人體所需微量元素之一，可以取代骨基質(zhì)中HA的鈣而提升骨質(zhì)強(qiáng)度，因此臨床中常用雷奈酸鍶治療骨質(zhì)疏松。鍶對(duì)ADSCs的成骨分化具有明確作用，因此陳龍[24]將鍶修飾于HA支架，不僅能提升HA支架的力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，還能有效提高ALP活性，加速ADSCs的礦化成骨。硼元素(P)也是人體所需微量元素之一，雖然還未闡明其在胚胎或人體發(fā)育中的具體機(jī)制，但硼對(duì)人體骨骼再生作用已經(jīng)充分得到證實(shí)[25]。Akdere等[26]將硼元素添加至HA相關(guān)支架材料中，在不同的2D和3D培養(yǎng)環(huán)境中均較無(wú)硼材料更能促進(jìn)ADSCs的黏附、增殖及成骨分化，骨傳導(dǎo)性也更好。硅(Si)是自然界極為常見(jiàn)的一種元素，在骨組織工程中也得到廣泛應(yīng)用。Eatemad等[27]為改善HA降解速率慢的缺點(diǎn)，將硅元素加入到HA的支架材料中，復(fù)合ADSCs后發(fā)現(xiàn)硅元素的存在不會(huì)對(duì)ADSCs產(chǎn)生毒性作用，HA經(jīng)硅修飾后形成的Si-HA微粒有較高的降解速率，能夠釋放出更多的離子并促進(jìn)ADSCs成骨及基質(zhì)礦化，這些元素的摻雜和修飾不僅能夠在HA基礎(chǔ)上對(duì)ADSCs的生物活性和成骨礦化起到一定的促進(jìn)作用，同時(shí)也為相關(guān)特殊骨組織疾病的修復(fù)治療提供更多的生物支架和涂層材料的個(gè)性化選擇與應(yīng)用。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

HA作為最常用的骨替代材料被廣泛應(yīng)用，但隨著骨組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，與其他學(xué)科諸如材料化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)的不斷交融，單一材料的使用缺陷被逐漸放大，因此擁有更優(yōu)性能的多種復(fù)合材料為HA相關(guān)材料在骨組織工程中的應(yīng)用開(kāi)辟了新道路。與此同時(shí)，HA對(duì)ADSCs成骨特性的改變也在HA相關(guān)材料的不斷發(fā)展中得到更好表現(xiàn)，但制約其真正應(yīng)用于臨床還有許多問(wèn)題有待解決。如調(diào)配HA相關(guān)骨組織工程材料內(nèi)部各成分的比例，以適應(yīng)修補(bǔ)缺損部位所需的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度和ADSCs生長(zhǎng)﹑吸附的孔徑大小；其降解控釋速率如何匹配新骨生成而不至于過(guò)快導(dǎo)致支架塌陷或過(guò)慢限制骨細(xì)胞增殖；血管生成這一關(guān)鍵問(wèn)題在HA相關(guān)材料臨床應(yīng)用中如何有效解決等。HA相關(guān)支架材料的不斷研究與發(fā)展，提升ADSCs成骨和礦化能力，優(yōu)化其結(jié)構(gòu)與力學(xué)特性，實(shí)現(xiàn)更好的骨缺損修復(fù)效果，對(duì)骨組織工程的應(yīng)用和前景有著十分重要的意義。