蔣曉萌，楊代剛，高永耀，鄒庭峰，施存元，江 宏，段亞君，楊瀟瀟*

愈風寧心滴丸預防性治療血管痙攣性偏頭痛的作用及機制研究

蔣曉萌1，楊代剛2，高永耀2，鄒庭峰2，施存元1，江 宏1，段亞君2，楊瀟瀟2*

1.浙江尖峰藥業(yè)有限公司，浙江 金華 321000 2.合肥工業(yè)大學，安徽 合肥 230001

觀察愈風寧心滴丸對硝酸甘油誘導的偏頭痛小鼠的影響，探索愈風寧心滴丸預防性治療血管痙攣性偏頭痛的作用及機制。采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激BV2神經小膠質細胞，以愈風寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）及葛根素（50 μmol/L）進行干預，收集細胞。將野生型C57BL/6J小鼠隨機分成照組、模型組以及愈風寧心滴丸低、中、高劑量（200、360、600 mg/kg）組和葛根素組（37.8 mg/kg），給予藥物進行干預，于第3、5、7、9、11天ip硝酸甘油溶液（10 mg/kg）建立小鼠偏頭痛模型，第3天開始進行痛覺敏感（機械壓痛和熱敏耐受）行為學實驗；實驗結束后，取小鼠血清和腦組織。檢測各組BV2細胞活性氧含量；采用Western blotting法檢測各組細胞超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）、SOD2蛋白表達以及各組小鼠三叉神經脊束尾核（trigeminal nucleus caudalis，TNC）區(qū)降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）、c-Fos、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK）及促炎細胞因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）蛋白表達；采用qRT-PCR法檢測各組細胞、、、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，）mRNA表達以及小鼠TNC區(qū)、mRNA表達；采用免疫熒光檢測各組小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos表達；采用生化分析儀檢測各組小鼠血清中丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。愈風寧心滴丸顯著上調BV2細胞抗氧化酶、mRNA和蛋白表達水平（＜0.05、0.01、0.001），降低活性氧水平（＜0.01、0.001），抑制炎癥因子和mRNA表達（＜0.001）。與對照組相比，模型組小鼠基礎痛閾值顯著降低（＜0.05、0.001），TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達水平顯著升高（＜0.01、0.001），TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組相比，各給藥組小鼠基礎痛閾值顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性；愈風寧心滴丸對偏頭痛小鼠血清中ALT、AST和ALP活性無顯著性影響。愈風寧心滴丸可能通過抑制血管擴張、抑制炎癥反應、促進抗氧化酶表達等多重途徑發(fā)揮預防性治療血管痙攣性偏頭痛的作用。

愈風寧心滴丸；偏頭痛；神經小膠質細胞；血管擴張；神經炎癥

腦血管的舒縮功能受阻會導致偏頭痛[1]。當顱內血管收縮時，引起偏頭痛先兆癥狀的產生，隨后出現顱內外血管擴張。這一過程使得血管周圍組織持續(xù)產生血管活性多肽，進一步造成顱內外血管過度擴張，引起搏動性的頭痛[2]。具有收縮血管作用的藥物麥角胺能夠緩解偏頭痛為此提供了有力證明[3]。此外，有臨床研究報道，發(fā)作性神經-血管功能障礙引起的陣發(fā)性血管痙攣是偏頭痛發(fā)生的主要機制[4]。目前較多研究表明中樞敏化增加了偏頭痛患者的發(fā)病頻率，即逐漸演變?yōu)槁云^痛，表現出患者頭面部、肢體或其他皮膚部位的痛覺過敏[5]。偏頭痛中樞敏化的主要區(qū)域為痛覺通路中三叉神經脊束尾核部位（trigeminal nucleus caudalis，TNC），該區(qū)域異常神經元信號調控引起中樞敏化[6]。隨著人們對小膠質細胞研究的深入，發(fā)現小膠質細胞及其分泌的炎癥因子參與了慢性偏頭痛中樞敏化的調節(jié)[7-8]。

愈風寧心滴丸是根據中醫(yī)傳統理論，采用現代醫(yī)學新技術，以葛根為原料研制而成的一種高效、速效的純中藥滴丸劑。大量實驗證明，葛根及其提取物葛根素能改善微循環(huán)，增加腦和冠狀動脈血流量，改善缺鐵新機代謝，對高血壓、頭痛、項強癥狀、冠心病、心絞痛等均有顯著療效[9]。此外，相關研究表明葛根素具有治療慢性神經性疼痛的作用，但其具體機制尚不清晰[10]。葛根素作為愈風寧心滴丸的重要成分，表明愈風寧心滴丸具有治療血管痙攣性偏頭痛的潛在作用。本研究旨在通過動物和細胞水平的研究，確定愈風寧心滴丸對血管痙攣性偏頭痛的作用，并闡明可能的作用機制，為其臨床推廣提供理論依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性野生型C57BL/6J小鼠，8周齡，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（蘇）2018-0008。小鼠分籠飼養(yǎng)于合肥工業(yè)大學實驗動物中心，自然光照，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，自由進食飲水。在開始動物實驗之前，小鼠于實驗中心適應1周。動物實驗操作均嚴格按照實驗動物倫理學相關規(guī)定進行（動物實驗倫理批準號HFUT20200901005）。在治療期間，每日記錄小鼠體質量，沒有觀察到因實驗操作產生的不良影響。

1.2 細胞

BV2神經小膠質細胞購自美國ATCC。

1.3 藥品與試劑

愈風寧心滴丸（批號200303）由浙江尖峰藥業(yè)有限公司提供，每丸含葛根素6.3 mg；葛根素（質量分數≥99%）購自中國食品藥品檢定研究院；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基（批號2114090）購自美國Corning公司；降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）單克隆抗體（批號A5328）、c-Fos單克隆抗體（批號A0236)、細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）單克隆抗體（批號A4782）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）單克隆抗體（批號A17361）、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）單克隆抗體（批號A0274）、SOD2單克隆抗體（批號A1340）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；磷酸化ERK（p-ERK）單克隆抗體（批號A80031-1-RR）、熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）單克隆抗體（批號13171-1-AP）、HRP標記的α-Tubulin抗體（批號HRP-66031）購自美國Proteintech公司；HRP標記的山羊抗兔二抗（批號LK2001）購自天津三箭生物技術有限公司；ECL化學發(fā)光液（批號RL241930）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（批號KFS344）購自北京百奧萊博科技有限公司；總RNA提取試劑（批號70087434）購自Biosharp公司；逆轉錄試劑盒（批號R123-01）購自南京維諾贊生物科技有限公司；丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒（批號200722103）、天冬氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）檢測試劑盒（批號200818101）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（批號201120101）購自美康生物科技股份有限公司。

1.4 儀器

電泳儀（美國Bio-Rad公司）；微量高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）；超純水系統（德國Millipore公司）；超微量檢測儀（美國Pultton公司）；qRT-PCR儀（瑞士Roche公司）；冰凍切片機、激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）；全自動生化分析儀（日本Hitachi公司）；YLS-12S型鼠尾光照測痛儀、YLS-3E型電子壓痛儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法檢測細胞活性

基于文獻中葛根素對神經膠質細胞的相關研究報道[11]，確定體外實驗中葛根素濃度為10～100 μmol/L。將BV2細胞的培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，分別加入葛根素（50 μmol/L）以及愈風寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）預處理1 h，隨后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，最后加入MTT溶液（0.5 mg/mL），孵育4 h，加入DMSO溶解后，采用酶標儀測定550 nm處的吸光度（）值。

2.2 細胞ROS檢測

用不同濃度的愈風寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）及葛根素（50 μmol/L）處理BV2細胞1 h，然后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，最后加入10mmol/L DCFH-DA探針進行反應，并于激發(fā)波長488 nm及發(fā)射波長525 nm處檢測熒光強度。

2.3 動物造模、分組與給藥

根據愈風寧心滴丸說明書的指導，基于成人1 d內用藥劑量，利用體表面積法換算成小鼠1 d用藥劑量約為360 mg/kg（以此劑量作為中劑量組）；在整體動物實驗中小鼠給藥劑量一般按照2倍左右劑量差（約200 mg/kg）進行遞增/減，因此選擇200 mg/kg作為低劑量組給藥劑量；在此基礎上，為避免給藥劑量過大，以200 mg/kg劑量差設計了高劑量組給藥劑量（600 mg/kg）；本研究所用愈風寧心滴丸中葛根素質量分數為10.5%，因此設計了與中劑量組劑量相應的葛根素組給藥劑量為37.8 mg/kg。

綜上，將小鼠隨機分成對照組、模型組以及愈風寧心滴丸低、中、高劑量（200、360、600 mg/kg）組和葛根素（37.8 mg/kg）組，每組8只。造模組及給藥組于第3、5、7、9、11天ip硝酸甘油溶液（10 mg/kg）建立小鼠偏頭痛模型[12]，ip硝酸甘油溶液幾分鐘后，可觀察到小鼠耳朵發(fā)紅、鎮(zhèn)靜、不定時有撓頭現象；對照組ip等體積0.9%氯化鈉溶液。各給藥組小鼠每日喂食含相應劑量藥物的食物，對照組和模型組正常飲食。

2.4 痛覺敏感行為學實驗

頭痛是偏頭痛的一個特征，異常皮膚疼痛是超敏反應的一種表現。對小鼠進行痛覺敏感性實驗（機械壓痛實驗和熱敏耐受實驗），能夠初步判斷愈風寧心滴丸是否具有治療偏頭疼的作用。在實驗的第3、5、7、9、11天進行痛覺敏感行為學測定，即在每次ip硝酸甘油溶液當天測試小鼠痛閾值，作為基線痛閾值，以此反映出隨著硝酸甘油溶液注射次數以及給藥次數的增加，各給藥組小鼠基礎超敏反應的差異。

2.4.1 機械壓痛實驗 采用電子壓痛儀對小鼠尾根部1～2 cm處施加逐漸增大的壓力，待小鼠因為壓痛而尖叫或者掙扎時，記錄此時的壓力值，每次記錄3次取平均值，以此數值作為小鼠的壓痛閾值。

2.4.2 熱敏耐受實驗 采用鼠尾光照測痛儀對小鼠尾根部1～2 cm處給予一定的光照，待小鼠因為熱痛而彈開尾巴時，儀器自動記錄小鼠開始接近光源至尾巴彈開時的時間，每次記錄3次取平均值，以此數值作為小鼠的熱痛閾值。

2.5 Western blotting檢測BV2細胞和偏頭痛小鼠TNC區(qū)組織蛋白表達

用不同濃度的愈風寧心滴丸（10、50、100 μmol/L）及葛根素（50 μmol/L）處理BV2細胞1 h，然后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，收集細胞，加入裂解液提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h，分別加入SOD1、SOD2、HSP90和α-Tubulin抗體，4 ℃孵育過夜；加入相應二抗，常溫孵育1 h，加入ECL化學發(fā)光試劑，采用成像設備顯影。

最后1次ip硝酸甘油溶液24 h后，小鼠安樂死，取小鼠腦TNC區(qū)組織，同裂解液研磨后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h，分別加入CGRP、c-Fos、p-ERK、ERK、IL-6、HSP90抗體，4 ℃孵育過夜；加入相應二抗，常溫孵育1 h，加入ECL化學發(fā)光試劑，采用成像設備顯影。

2.6 qRT-PCR檢測BV2細胞和偏頭痛小鼠TNC區(qū)組織相關基因表達

用不同濃度的愈風寧心滴丸（10、50、100mmol/L）及葛根素（50 μmol/L）處理BV2細胞1 h，然后加入LPS（1 μg/mL）共同處理18 h，收集細胞。按照試劑盒說明書分別提取細胞和偏頭痛小鼠TNC區(qū)組織總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 免疫熒光染色檢測偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP和c-Fos蛋白表達

麻醉小鼠后，依次用PBS溶液和多聚甲醛對小鼠經心灌流處理，分離腦組織，干冰速凍，于多聚甲醛固定24 h，再依次用20%、30%的蔗糖溶液充分脫水，直至組織沉陷。OCT包埋組織后，切取10mm組織切片，于?40 ℃凍存。染色時，取出組織片于室溫放置30 min揮發(fā)OCT，經破膜、2%BSA封閉、抗體孵育、DAPI染核、封片等步驟后使用激光共聚焦顯微鏡拍照。

2.8 生化分析儀檢測偏頭痛小鼠血清中AST、ALT和ALP活性

實驗結束后，獲取小鼠全血，靜止2 h后，于2000×條件下離心20 min，得血清。采用PBS稀釋3倍后，按照試劑盒說明書指示，通過生化分析儀檢測血清中AST、ALT和ALP活性。

2.9 統計學分析

3 結果

3.1 愈風寧心滴丸抑制BV2細胞中炎癥因子和活性氧水平

TNC區(qū)小膠質細胞的氧化應激反應可激活小膠質細胞，從而引發(fā)炎癥，導致神經元細胞激活，增加痛覺敏感。如圖1-A所示，各組細胞存活率均無顯著差異，表明本研究所用該藥物濃度對BV2細胞細胞活性沒有影響。如圖1-B所示，與對照組比較，模型組細胞ROS水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組ROS水平顯著降低（＜0.01、0.001）。

與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，圖2～5、7、8同

如圖2所示，與對照組比較，模型組細胞、mRNA和蛋白表達水平顯著降低（＜0.01、0.001）；與模型組比較，各給藥組、mRNA和蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）。表明愈風寧心滴丸能夠通過調控抗氧化物酶的表達發(fā)揮抑制ROS的作用。

此外，炎癥也是誘導神經元激活的另一個重要因素。如圖3所示，與對照組比較，模型組細胞、mRNA表達水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組、mRNA表達水平顯著降低（＜0.001）。上述結果表明，愈風寧心滴丸對BV2細胞具有很好的抗氧化、抗炎作用，提示其在體內可能也具有較好的保護作用。

3.2 愈風寧心滴丸改善偏頭痛小鼠的痛覺敏感

通過電子壓痛儀及光照測痛儀對小鼠尾部進行痛覺耐受檢測，即痛覺敏感性實驗（機械壓痛實驗和熱敏耐受實驗）。痛覺敏感性實驗能夠初步判斷愈風寧心滴丸是否具有治療偏頭疼的作用。如圖4所示，各組小鼠給藥前的基礎痛閾值無顯著差異，第1次ip硝酸甘油溶液后，與對照組對比，模型組的基礎痛閾值開始降低，并且在反復ip硝酸甘油溶液后小鼠基礎熱痛閾值以及壓痛閾值顯著降低（＜0.05、0.001），提示痛覺過敏的產生。給予愈風寧心滴丸及葛根素治療后，小鼠的熱痛閾值以及壓痛閾值顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），表明愈風寧心滴丸可以改善偏頭痛小鼠表現出的痛覺敏感。

圖2 愈風寧心滴丸上調BV2細胞抗氧化酶SOD1和SOD2的表達(, n = 3)

圖3 愈風寧心滴丸抑制BV2細胞IL-1β和TNF-αmRNA表達(, n = 3)

圖4 愈風寧心滴丸改善偏頭痛小鼠的熱痛閾值(A) 及壓痛閾值(B)(, n = 6)

3.3 愈風寧心滴丸通過降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達改善中樞敏化

血管舒張肽CGRP是神經源性炎癥發(fā)生的主要因素之一，與c-Fos及p-ERK蛋白一樣，被認為是中樞敏化的分子標記物。如圖5所示，與對照組比較，模型組TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達水平顯著升高（＜0.01、0.001）；與模型組相比，各給藥組TNC區(qū)中CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

圖5 愈風寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos和p-ERK蛋白表達 (, n = 6)

如圖6所示，與對照組相比，模型組TNC區(qū)中CGRP、c-Fos免疫反應的細胞數量增加，給予愈風寧心滴丸及葛根素干預后，CGRP、c-Fos陽性細胞數量減少。以上結果表明，愈風寧心滴丸可能通過降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP、c-Fos、p-ERK蛋白表達改善小鼠中樞敏化，降低偏頭痛模型小鼠的痛覺敏感。

3.4 愈風寧心滴丸降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)炎癥因子的表達

如圖7、8所示，與對照組比較，模型組小鼠TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠TNC區(qū)、mRNA和IL-6蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。表明愈風寧心滴丸可能通過降低偏頭痛小鼠TNC區(qū)炎癥因子的表達改善偏頭痛。

3.5 愈風寧心滴丸對偏頭痛小鼠血清中AST、ALT和ALP活性的影響

如圖9所示，各組小鼠血清AST、ALT、APL活性均無顯著差異，且均處于正常水平，表明愈風寧心滴丸不會對小鼠造成肝毒性，提示其使用具有安全性。

圖6 愈風寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)CGRP和c-Fos蛋白表達(, n = 6)

圖7 愈風寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)IL-1β和TNF-αmRNA的表達(, n = 6)

圖8 愈風寧心滴丸抑制偏頭痛小鼠TNC區(qū)IL-6蛋白表達(, n = 6)

4 討論

偏頭痛作為臨床常見的原發(fā)性疾病，表現出反復發(fā)作、搏動樣頭痛，并可伴有惡心、嘔吐、畏光、畏聲等癥狀[12]。因其發(fā)作原因復雜多樣且發(fā)病機制不明確，大多數偏頭痛患者都不滿于現有接受的治療方案[13]。在對偏頭痛發(fā)病機制的研究過程中，產生了神經源、血管源以及三叉神經血管反射等多種學說[14]。研究表明，腦部TNC區(qū)異常神經元信號調控引起中樞敏化，反復的中樞敏化促使偏頭痛向慢性偏頭痛的轉換[6]。CGRP作為強大的血管舒張肽，主要表達于三叉神經的無髓神經纖維，當三叉神經興奮時會釋放大量的CGRP，促使硬腦膜血管擴張，進而引起神經源性炎癥的發(fā)生，導致偏頭痛的產生[14]。原癌基因的激活和ERK的磷酸化已被用作神經元激活和中樞敏化的可靠分子標志物[15]。研究發(fā)現，小膠質細胞-神經元細胞信號交互通路參與了偏頭痛的病理生理機制，促炎因子IL-1β也參與偏頭痛病理過程，提示小膠質細胞可通過其釋放的促炎細胞因子影響中樞神經系統神經元的興奮，參與偏頭痛的發(fā)生與維持[16-17]。

圖9 愈風寧心滴丸對偏頭痛小鼠血清中AST、ALT和ALP活性的影響(, n = 6)

愈風寧心滴丸是由結合中醫(yī)傳統理論和現代醫(yī)學新技術由葛根提取加工而成的中藥滴丸，臨床上治療心絞痛、冠心病等心血管疾病效果顯著。其主要成分葛根素具有解痙升陽、增強腦及冠脈血流量、祛除患者頭痛之功效[18]。葛根素可能通過抑制瞬時受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）、CGRP和P物質預防紫杉醇誘導的大鼠周圍神經病理性疼痛[19]。以上研究為愈風寧心滴丸防治偏頭痛提供了一定的科學依據。本研究考察了愈風寧心滴丸對LPS誘導的BV2細胞炎癥及氧化應激狀態(tài)的影響，發(fā)現愈風寧心滴丸及葛根素能夠上調BV2細胞抗氧化酶、的mRNA及蛋白表達水平，抑制LPS引起的ROS水平異常升高，改善細胞中的高氧化壓力狀態(tài)，同時通過下調IL-1β、TNF-α等炎癥因子的表達抑制炎癥反應，提示愈風寧心滴丸具有改善偏頭痛的潛力。

一氧化氮是偏頭痛病理生理過程中的重要神經遞質[20]。研究證明，硝酸甘油作為一氧化氮供體給藥會導致健康受試者頭痛，而偏頭痛患者則會出現更嚴重的遲發(fā)性頭痛[21]。本研究通過對小鼠進行反復ip硝酸甘油溶液誘導慢性偏頭痛的產生，模擬臨床慢性偏頭痛癥狀，結果顯示，模型組小鼠的痛閾值顯著降低，表現出明顯的痛覺敏感。與對照組比較，模型組小鼠腦部TNC區(qū)促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6以及疼痛相關蛋白CGRP、c-Fos、p-ERK的表達明顯升高；與模型組比較，各給藥組小鼠基礎痛閾值明顯升高，表現出對痛覺敏感的顯著抑制；各給藥組小鼠TNC區(qū)促炎細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6以及疼痛相關蛋白CGRP、c-Fos、p-ERK的表達顯著降低，呈劑量相關性。

綜上所述，愈風寧心滴丸可以降低偏頭痛小鼠腦部TNC區(qū)疼痛相關蛋白CGRP、c-Fos、p-ERK以及促炎細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表達，進而降低痛覺敏感，緩解偏頭痛。其機制可能為通過抑制血管擴張及炎癥反應，進而起到防治血管痙攣性偏頭痛的作用。本研究為愈風寧心滴丸防治偏頭痛的研究提供了理論及實驗基礎，為中藥在偏頭痛的應用提供了重要依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Yufeng Ningxin Dropping Pills on preventive treatment of vasospasm migraine

JIANG Xiao-meng1, YANG Dai-gang2, GAO Yong-yao2, ZOU Ting-feng2, SHI Cun-yuan1, JIANG Hong1, DUAN Ya-jun2, YANG Xiao-xiao2

1.Zhejiang Jianfeng Pharmaceutical Co., Ltd., Jinhua 321000, China 2.Hefei University of Technology, Hefei 230001, China

To observe the effect of Yufeng Ningxin Dropping Pills (愈風寧心滴丸) on nitroglycerin-induced migraine mice, and explore the effect and mechanism of Yufeng Ningxin Dropping Pills on preventive treatment of vasospasm migraine.Lipopolysaccharide (LPS) was used to stimulate BV2 neuroglial cells, Yufeng Ningxin Dripping Pills (10, 50, 100 μmol/L) and puerarin (50 μmol/L) were used for intervention, and cells were collected.Wild-type C57BL/6J mice were randomly divided into control group, model group, low-, medium-, and high-dose (200, 360, 600 mg/kg) Yufeng Ningxin Dripping Pill group and puerarin (37.8 mg/kg) group, drugs were given for intervention, migraine model of mice was established with ip nitroglycerin solution (10 mg/kg) on 3rd, 5th, 7th, 9th and 11th day, hyperalgesia tolerance behavioral experiment (mechanical tenderness and heat sensitivity) were started on 3rd day; After experiment, the serum and brain tissue of mice were taken.The content of reactive oxygen species in BV2 cells of each group was detected; Western blotting was used to detect the expressions of superoxide dismutase 1 (SOD1) and SOD2 protein in BV2 cells and calcitonin gene-related peptide (CGRP), c-Fos, phosphorylated extracellular regulated protein kinases (p-ERK) and pro-inflammatory cytokine interleukin-6 (IL-6) protein expressions in trigeminal nucleus caudalis (TNC) region in mice of each group; qRT-PCR method was used to detect,,, tumor necrosis factor-α () mRNA expressions in BV2 cells andandmRNA expressions in TNC of mice; Immunofluorescence was used to detect the expressions of CGRP and c-Fos in TNC area of mice?? in each group; Automatic biochemical analyzer was used to detect the alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP) activities in serum of mice.Yufeng Ningxin Dripping Pills significantly increased antioxidant enzymeandmRNA and protein expression levels in BV2 cells (< 0.05, 0.01, 0.001), reduced reactive oxygen species levels (< 0.01, 0.001), inhibited the inflammatory factorandmRNA expression (< 0.001).Compared with control group, basic pain threshold of mice in model group was significantly reduced (< 0.05, 0.001), expressions of CGRP, c-Fos and p-ERK proteins in TNC area were significantly increased (< 0.01, 0.001).The expressions of,mRNA and IL-6 protein in TNC area were significantly increased (< 0.01); Compared with model group, basic pain threshold of mice in each administration group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), expressions of CGRP, c-Fos and p-ERK proteins in TNC area were significantly reduced (< 0.05, 0.01, 0.001), expressions of,mRNA and IL-6 proteins in TNC area were significantly reduced (< 0.05, 0.01, 0.001), and showed a dose-related relationship; Yufeng Ningxin Dripping Pills had no significant effect on activities of ALT, AST and ALP in serum of migraine mice.Yufeng Ningxin Dripping Pills may play a preventive effect on vasospasm migraine by inhibiting vasodilation, inhibiting inflammation and promoting the expression of antioxidant enzymes.

Yufeng Ningxin Dropping Pills; migraine; microglia; vasodilation; neuroinflammation

R285.5

A

0253 - 2670(2021)22 - 6881 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.22.013

2021-05-20

安徽省重點研究和開發(fā)計劃項目（201904a07020007）；中國博士后科學基金資助項目（2020M681914）

蔣曉萌（1964—），男，碩士，浙江省有突出貢獻中青年專家，主要從事新藥研發(fā)。Tel: 17855867735 E-mail: Jxm@vip.163.com

通信作者：楊瀟瀟（1990—），女，副教授，碩士生導師，從事重大疾?。ㄐ哪X血管疾病、腫瘤等）藥理學研究。Tel: 13920087912 E-mail: yangxiaoxiao@hfut.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]