左興盛，宋志玉，賈海盼，付中華，王振基，馬培志

（1.河南省人民醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州450003；2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，鄭州450000）

胃癌作為最常見的惡性腫瘤之一，是全球癌癥死亡的第二大主要原因[1]。盡管目前在胃癌化療和靶向治療方面卓有成效，但胃癌的預(yù)后仍不容樂觀，原發(fā)或繼發(fā)性耐藥是胃癌化療失敗的主要原因[2]。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）作為臨床常用的化療藥物，因其對多種癌癥的抗腫瘤作用而聞名，包括胃癌。然而，臨床上胃癌患者對5-FU也產(chǎn)生了不同程度的耐藥，導(dǎo)致臨床療效不佳[3]。5-FU耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制目前尚未明確。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類缺少5′和3′末端，由共價鍵形成閉合環(huán)狀的非編碼RNA。circRNAs在真核生物內(nèi)的含量豐富，已被證明能夠參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移及耐藥性[4-5]。環(huán)狀RNA PVT1（circPVT1）來源于致癌基因PVT1基因的外顯子2，位于染色體8q24。研究表明，circPVT1與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)，circPVT1在胃癌患者腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)，可作為胃癌的一種新型增殖因子和預(yù)后標(biāo)志物。近來研究顯示，circPVT1參與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[9]。然而，circPVT1是否參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞對5-FU的化學(xué)敏感性尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建5-FU耐藥的胃癌細(xì)胞，探討circPVT1對胃癌5-FU耐藥細(xì)胞株的增殖和凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制，為尋找耐藥逆轉(zhuǎn)劑的研究提供一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2017—2018年在河南省人民醫(yī)院進(jìn)行外科手術(shù)切除且經(jīng)病理確認(rèn)為胃癌患者29例，年齡28～64歲（中位年齡為51歲；平均年齡為48.6歲）。所有患者術(shù)前接受以5-FU為基礎(chǔ)的化學(xué)治療，根據(jù)患者對化療藥物5-FU的敏感性，將其分為5-FU敏感組（n=22）和5-FU耐藥組（n=7）?；颊咴诮邮苄g(shù)前化療前未接受過任何放療或免疫治療且均在接受治療前簽署知情同意書。胃癌組織切除后立即使用液氮處理，后置于-80℃冰箱中保存。本研究已取得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要材料 胃癌細(xì)胞BGC823購自上海中科院細(xì)胞庫，si-NC、si-circPVT1-1和si-circPVT1-2購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，Bcl-2、Bax、caspase-3抗體購自美國Novus公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒-POD（20T）購自武漢博士德生物工程有限公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 BGC823細(xì)胞的培養(yǎng)與BGC823/5的構(gòu)建BGC823細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用濃度梯度法建立5-FU耐藥胃癌細(xì)胞株BGC823/5-FU。取對數(shù)生長期的BGC823細(xì)胞置于含有0.1μmol/L 5-FU的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，隨后轉(zhuǎn)移至不含5-FU的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至70%融合。取對數(shù)生長期的細(xì)胞分瓶傳代，并給予2倍濃度的5-FU繼續(xù)培養(yǎng)。以這種方式逐漸增加5-FU的劑量，直至BGC823細(xì)胞可以在含有1.0μmol/L 5-FU的RPMI-1640培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。經(jīng)過長達(dá)12個月的培養(yǎng)，獲得可以在含有1.0μmol/L 5-FU的RPMI-1640培養(yǎng)基中良好生長的BGC823/5-FU細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按照Lipofectmine2000使用說明書，分別將si-NC、si-circPVT1-1和si-circPVT1-2轉(zhuǎn)染至BGC823/5-FU細(xì)胞中，將BGC823/5-FU細(xì)胞置于含有16μmol/L 5-FU的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48、72 h。將細(xì)胞分為4組，分別為Control組、5-FU組、5-FU+si-NC組、5-FU+si-circPVT1組。收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.5 RT-PCR檢測目的基因的表達(dá) 使用TRIzon提取試劑提取總RNA，使用One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Tim）試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的表達(dá)量，引物序列：circPVT1上游5′-GGTTCCACCAGCGTTATTC-3′，下游5′-CAACTTCCTTTGGGTCTCC-3′；Bcl-2上游5′-CTACAGTGATGTCTCCATCC-3′，下游5′-AAAGCCTCAATGCCTGTCTC-3′；Bax上游5′-TGAACCCTAAGGCCAACCGTG-3′，下游5′-GCTCATAGCTCTTCTCCAGGG-3′；caspase-3上游5′-GAACTGGACTGTGGCATTGA-3′，下游5′-TGTCGGCATACTGTTTCAGC-3′；GAPDH上游5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′，下游5′-TGAAGGGGTCATTGATGGCA-3′。反應(yīng)體系10μL，反應(yīng)條件：95℃變性5 s，60℃退火30 s，擴(kuò)增40個循環(huán)。

1.6 CCK-8檢測細(xì)胞增殖 稀釋BGC823/5-FU細(xì)胞設(shè)置6個細(xì)胞濃度梯度（0.625×103/孔、1.25×103/孔、2.5×103/孔、5.0×103/孔、1.0×104/孔、2.0×104/孔），每組4個復(fù)孔；接種于96孔板中，并加入CCK-8試劑10μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，在450 nm處測OD值并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定BGC823/5-FU細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8試劑后所需的孵育時間。將BGC823/5-FU細(xì)胞置于含有不同濃度（0、1、2、4、8、16和32μmol/L）5-FU的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，按照CCK-8試劑盒操作說明檢測各組的細(xì)胞活性。

1.7 克隆形成實驗測定細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期的細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，制作混懸液后梯度倍數(shù)稀釋，并分別接種于含有10 mL培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，37℃下培養(yǎng)。多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色，計算克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 收集BGC823/5-FU細(xì)胞，PBS溶液漂洗1次，使用多聚賴氨酸處理玻片，多聚甲醛固定細(xì)胞后，向玻片上加入準(zhǔn)備好的標(biāo)記緩沖液，37℃條件下標(biāo)記2 h，封閉液及地高辛抗體稀釋以后DAB染色，顯色20 min后，蘇木素復(fù)染后脫水，透明，封片，在熒光顯微鏡下觀察染色的細(xì)胞，拍照并計數(shù)。

1.9 Western印跡檢測目的蛋白的表達(dá) 使用哺乳動物蛋白抽提試劑盒（CW0889M）提取BGC823/5-FU細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白定量試劑盒（CW0014）檢測從BGC823/5-FU細(xì)胞中提取的總蛋白質(zhì)的濃度。SDS-PAGE分離總蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉2.5 h后，加入相應(yīng)的一抗于4℃下孵育過夜。次日，經(jīng)TVST洗滌后，將膜與二抗于37℃下孵育60 min。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影液于暗室中進(jìn)行顯影。以β-actin作為內(nèi)參分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.10 Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡 收集BGC823/5-FU細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成細(xì)胞懸浮液，離心后加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5μLAnnexin V-FITC，再加入10μL碘化丙啶染色液，室溫條件下避光孵育20 min，使用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞。

1.11 裸鼠移植瘤模型 雌性BALB/c裸鼠12只（5周齡，18～20 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗動物在鄭州大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，實驗動物的處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。將裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組，每組4只：5-FU組、5-FU+si-NC組、5-FU+si-circPVT1組。根據(jù)對應(yīng)的分組，分別將轉(zhuǎn)染si-NC或si-circPVT1的BGC823/5-FU細(xì)胞于裸鼠右側(cè)背部皮下移植。每只小鼠通過尾靜脈注射5-FU（10 mg/kg）進(jìn)行治療，每周注射1次，共進(jìn)行4次注射[10]。觀察注射5-FU后測量裸鼠瘤體的長（a）和短（b）直徑，并根據(jù)公式：V（mm3）=ab2/2計算移植瘤體積。給藥4周后處死裸鼠，剝離移植瘤組織并稱重。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理 利用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析比較分析組間差異，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circPVT1在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá) RTPCR結(jié)果顯示，circPVT1在5-FU耐藥患者胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于5-FU敏感患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，圖1A）。此外，circPVT1表達(dá)水平在BGC823/5-FU細(xì)胞中顯著高于BGC823細(xì)胞（P<0.001，圖1B）。

圖1 circPVT1在胃癌組織和癌細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig 1 Expression of circPVT1in gastric cancer tissuesand cancer cells

2.2 沉默circPVT1促進(jìn)5-FU對BGC823/5-FU細(xì)胞的增殖抑制作用 si-circPVT1-1和si-circPVT1-2轉(zhuǎn)染BGC823/5-FU細(xì)胞48 h后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，BGC823/5-FU細(xì)胞中circPVT1的表達(dá)水平顯著降低（P<0.001），且si-circPVT1-1組中circPVT1的表達(dá)水平低于si-circPVT1-2組（P<0.001），因此，在后續(xù)實驗中使用si-circPVT1-1沉默circPVT1的表達(dá)（圖2A）。使用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2B所示。將BGC823/5-FU細(xì)胞置于含有不同濃度（0、1、2、4、8、16和32μmol/L）5-FU的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，利用CCK-8試劑盒分析各組的細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，BGC823/5-FU細(xì)胞活性隨5-FU濃度的升高而降低（P<0.001，圖2C）。而沉默circPVT1后，CCK-8實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-FU+si-circPVT1組BGC823/5-FU細(xì)胞的活性明顯低于5-FU+si-NC組（P<0.05，圖2D）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-FU處理可以抑制細(xì)胞的克隆形成能力。與5-FU+si-NC組相比，5-FU+si-circPVT1組BGC823/5-FU細(xì)胞的克隆形成能力明顯降低（P<0.05，圖2E）。

圖2 沉默circPVT1促進(jìn)5-FU對BGC823/5-FU細(xì)胞的增殖抑制作用Fig 2 Silencing circPVT1 promotestheinhibition roleof 5-FUon theproliferation of BGC823/5-FUcells

2.3 沉默circPVT1增強(qiáng)5-FU對BGC823/5-FU細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用 TUNEL實驗結(jié)果表明，與對照組相比，5-FU組BGC823/5-FU細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯上升（P<0.001）。5-FU+si-circPVT1組BGC823/5-FU細(xì)胞的凋亡數(shù)目明顯高于5-FU+si-NC組（P<0.01，圖3A）。5-FU組BGC823/5-FU細(xì)胞的凋亡率明顯高于對照組（P<0.001）。與5-FU+si-NC組相比，5-FU+si-circPVT1組BGC823/5-FU細(xì)胞的凋亡率明顯升高（P<0.01，圖3B）。

圖3 沉默circPVT1增強(qiáng)5-FU對BGC823/5-FU細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用Fig 3 Silencing circPVT1 enhances the promotion effect of 5-FU on theapoptosisof BGC823/5-FU cells

2.4 沉默circPVT1對Bcl-2、Bax和 caspase-3 mRNA表達(dá)水平的影響 RT-PCR結(jié)果表明5-FU處理可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax和caspase-3的表達(dá)。與5-FU+si-NC組相比，5-FU+si-circPVT1組BGC823/5-FU細(xì)胞中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平明顯降低（P<0.01，圖4A），Bax和caspase-3的mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.01，圖4B、4C）。

圖4 沉默circPVT1對Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA表達(dá)水平的影響Fig 4 Theeffect of silencing circPVT1 on theexpression levelsof Bcl-2，Bax，and caspase-3 mRNAs

2.5 沉默circPVT1對Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響 Western印跡結(jié)果表明，5-FU處理可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax和caspase-3的表達(dá)。與5-FU+si-NC組相比，5-FU+si-circPVT1組BGC823/5-FU細(xì)胞中Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bax和caspase-3的蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01，圖5）。

圖5 沉默circPVT1對Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響Fig 5 Theeffect of silencing circPVT1 on theexpression levelsof Bcl-2，Bax，and caspase-3 proteins

2.6 沉默circPVT1抑制裸鼠BGC823/5-FU移植瘤生長裸鼠移植瘤實驗 結(jié)果顯示，5-FU+sicircPVT1組移植瘤體積（圖6A）和質(zhì)量（圖6B）均小于5-FU+si-NC組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。

圖6 沉默circPVT1抑制裸鼠BGC823/5-FU移植瘤的生長Fig 6 Silencing circPVT1 inhibitsgrowth of BGC823/5-FU xenograftsin nudemice

3 討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，以5-FU為基礎(chǔ)的化療是胃癌患者手術(shù)后輔助化療以及中晚期胃癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[11]。然而，由于對5-FU產(chǎn)生原發(fā)性或獲得性耐藥性，部分胃癌患者在化療后仍會發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后不良。探尋與5-FU化療敏感性相關(guān)的分子機(jī)制對改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)沉默circPVT1可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對5-FU的化療敏感性，其機(jī)制可能是通過調(diào)控Bcl-2、Bax和caspase-3的表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

circRNA是一類參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)節(jié)的非編碼RNA。多項研究表明，circRNA的異常表達(dá)在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[12-13]。目前研究認(rèn)為，circRNA有望成為腫瘤診斷的生物標(biāo)志物和治療的新靶點[14-15]。此外，circRNA在腫瘤耐藥中的作用也受到廣泛關(guān)注[16]。Zhou等[7]發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004015可以通過調(diào)控miR-1183/PDPD1軸來影響埃克替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對化療藥物的敏感程度。徐飛等[17]研究也證實，抑制circ_MIHFD2的表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞對培美曲塞的敏感性。circPVT1也稱之為circ6，是新近被證實與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和耐藥性相關(guān)的基因[9，18]。Chen等[8]通過分析胃癌組織和癌旁正常組織發(fā)現(xiàn)5 500個circRNAs在胃癌組織中差異表達(dá)，其中circPVT1在胃癌組織中的表達(dá)顯著升高，并提出circPVT1可以獨立作為預(yù)測胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。此外，他們還發(fā)現(xiàn)circPVT1序列上包含多個miR-125b的結(jié)合位點，可以作為miR-125b的“海綿”，促進(jìn)MGC-803和AGS細(xì)胞的增殖。此外，有研究發(fā)現(xiàn)circPVT1在腫瘤細(xì)胞化療耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[9，19]。沉默circPVT1可以增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素和順鉑的敏感性[9]。Chen等[20]發(fā)現(xiàn)，circPVT1敲低能夠增強(qiáng)順鉑對非小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞A549/DDR活力的抑制作用和凋亡的誘導(dǎo)作用。然而，circPVT1對5-FU耐藥胃癌細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，circPVT1在5-FU耐藥患者胃癌組織中的表達(dá)水平明顯高于circPVT1在5-FU敏感患者胃癌組織中的表達(dá)水平。與此一致，在胃癌5-FU耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU中，circPVT1的表達(dá)明顯增加。這些結(jié)果提示circPVT1表達(dá)的上調(diào)可能與胃癌患者對5-FU的耐藥性有關(guān)。為進(jìn)一步觀察circPVT1在胃癌細(xì)胞對5-FU耐藥中的可能作用，本研究將靶向circPVT1的siRNA轉(zhuǎn)染至胃癌耐藥細(xì)胞株BGC823/5-FU中，并通過CCK-8和克隆形成實驗分析circPVT1沉默對耐藥細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circPVT1沉默可以增強(qiáng)5-FU對BGC823/5-FU細(xì)胞增殖的抑制作用。此外，TUNEL和流式細(xì)胞術(shù)實驗顯示，circPVT1沉默能夠增強(qiáng)5-FU對BGC823/5-FU細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。提示circPVT1沉默能夠增加BGC823/5-FU細(xì)胞對5-FU的敏感性，達(dá)到更好的抗腫瘤效應(yīng)。另外，本研究通過構(gòu)建BGC823/5-FU細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，在體內(nèi)也證實沉默circPVT1可以增強(qiáng)BGC823/5-FU細(xì)胞對5-FU的敏感性。因此，circPVT1有望成為克服胃癌細(xì)胞5-FU耐藥的治療靶點。

鑒于大部分化療藥物主要通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗癌效應(yīng)，細(xì)胞凋亡通路被認(rèn)為是與耐藥性相關(guān)的重要機(jī)制[21]。因此，為進(jìn)一步分析circPVT1對5-FU耐藥性影響的相關(guān)機(jī)制，本研究分析了凋亡相關(guān)因子的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5-FU處理導(dǎo)致胃癌耐藥細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，以及Bax和caspase-3的表達(dá)上調(diào)，而沉默circPVT1可以在一定程度上增強(qiáng)5-FU對細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax和caspase-3表達(dá)的影響。因此推測，沉默circPVT1可能通過調(diào)控凋亡信號通路以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對5-FU的耐藥性。

綜上所述，沉默circPVT1能夠在體內(nèi)和體外增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對5-FU的敏感性，這可能與其對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)控作用有關(guān)。然而，circPVT1在胃癌細(xì)胞對5-FU耐藥中的調(diào)控作用還有待進(jìn)一步研究。