樊炳君 姚麗 段嬌 羅昆艷 楊雪剛 焦鈺 朱國興 魏薇 曹艷茹

摘要：為了獲得具有抑制鐮刀菌根腐病的生防菌，從研究較少的蘭坪鉛鋅尾礦極端環(huán)境中采集樣品分離菌株，運(yùn)用平板對峙法從中進(jìn)行4種鐮刀菌根腐病拮抗菌的初篩，共獲得10株有抑制效果的菌株。通過平板對峙法和發(fā)酵液涂布法進(jìn)行復(fù)篩，獲得1株抑菌活性較強(qiáng)的拮抗菌株KC 121。根據(jù)生理生化特性和16S rDNA測序結(jié)果分析，將KC 121菌株鑒定為特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）。抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，KC 121對根腐病的4個(gè)病原菌（腐皮鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮孢菌）均有不同程度的抑制效果。同發(fā)酵液相比，菌體的抑菌效果較好。KC 121對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果達(dá)82.66%，對腐皮鐮刀菌的抑菌率達(dá)76.91%。KC 121的發(fā)酵液對擬枝孢鐮孢菌和腐皮鐮刀菌的抑菌率分別為84.76%和60.85%。本試驗(yàn)結(jié)果可以為根腐病的生物防治提供菌種資源，具有進(jìn)一步的研究和開發(fā)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：鐮刀菌屬;根腐病;生防菌;鑒定;特基拉芽孢桿菌

中圖分類號： S432.4+4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）20-0132-06

收稿日期：2021-02-27

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31660002）;云南省教育廳科學(xué)研究基金（編號：2020Y0475）;云南省地方本科高校（部分）基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)資金（編號：2018FH001-003）;云南省“萬人計(jì)劃”青年拔尖人才資助項(xiàng)目（編號：YNWR-QNBJ-2018-011）;省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（編號：2019KF005）。

作者簡介：樊炳君（1996—），女，云南昆明人，碩士研究生，主要從事資源利用與植物保護(hù)研究。E-mail：fanbingjun928@sina.com。

通信作者：曹艷茹，博士，副教授，主要從事微生物多樣性及功能挖掘研究。E-mail：yanrucao3@aliyun.com。

鐮刀菌（Fusarium）隸屬于菌物界真菌門，有性型是子囊菌門肉座菌的赤霉屬（Gibberella）、叢赤殼屬（Nectria）、麗赤殼屬（Calonectria）和小赤殼屬（Micronectriella），無性型是半知菌亞門瘤座孢菌科[1]。由于該屬菌株著生于子座上且具有月牙形或船形的分生孢子，1908年Link首次將其命名為鐮刀菌，并以粉紅鐮刀菌為模式種建立了鐮刀菌屬[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，鐮刀菌屬的分類標(biāo)準(zhǔn)也逐步完善，目前被廣泛接受的種類約70余種[1]。作為重要的植物病原菌，鐮刀菌屬的菌株可危害眾多糧食作物、蔬菜、水果、中藥材和花卉等，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-6]。鐮刀菌不僅會使作物萎蔫、腐爛和壞死，產(chǎn)生的毒素被人畜食用后也會引發(fā)中毒[7]。因此，針對該屬的防治研究一直受到人們的關(guān)注和重視。

鐮刀菌是一種土壤習(xí)居菌，以菌絲和孢子的方式越冬，常分布在植株的病殘?bào)w、帶病的種子和條件適宜的土壤中，具有寄主種類多、致病能力強(qiáng)和危害嚴(yán)重等特點(diǎn)[8]。目前對于鐮刀菌的防治措施主要是化學(xué)防治，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的生物防治研究還相對較少。劉利佳等通過篩選發(fā)現(xiàn)，62.5 g/L的精甲·咯菌腈懸浮種衣劑對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporium）的抑菌率達(dá)97.27%，是防治煙草鐮刀菌根腐病效果最佳的化學(xué)藥劑[9]。王國榮等研究發(fā)現(xiàn)甲基硫菌靈和戊唑醇及其復(fù)配制劑對芹菜莖基腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑制效果最好;在田間藥效試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，75%肟菌·戊唑水分散粒劑（WDG）和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（WP）的田間防效較好[10]。肖榮鳳等通過篩選發(fā)現(xiàn)2 000倍液的6.6%嘧菌酯·1.1%咯菌腈·3.3%精甲霜靈懸浮種衣劑和25%吡唑醚菌酯乳油對太子參根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌率均高于75%[11]。許樂等從丹參植株中分離獲得一株內(nèi)生細(xì)菌多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）能夠有效抑制丹參根腐病病原菌腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）的生長[12]。牛世全等從鹽堿土壤中分離獲得一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）對黃芪根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑制效果較好[13]。

運(yùn)用生態(tài)環(huán)保的生物菌劑防治鐮刀菌屬菌株引起的病害，在綠色可持續(xù)防治病害的同時(shí)，還能保護(hù)人畜的健康。本研究從蘭坪鉛鋅尾礦極端環(huán)境中分離原核微生物，從中篩選鐮刀菌根腐病的拮抗菌，為生物菌劑的研發(fā)提供更多菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 分離自筆者所在課題組于2019年9月采集的蘭坪鉛鋅尾礦樣品，采樣地的海拔范圍在 2 208～2 825 m，經(jīng)緯度范圍為26°22′～26°24′N、99°23′～99°28′E，年平均氣溫為10.4～11.8 ℃，屬溫帶山地主體型季風(fēng)氣候[14]。將重復(fù)菌株去除后，共從24個(gè)樣品中分離得到83個(gè)種的菌株，隸屬于4個(gè)門6個(gè)綱16個(gè)目22個(gè)科30個(gè)屬，具體信息見表1。

1.1.2 病原菌 腐皮鐮刀菌Fusarium solani（編號B6）、禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum（編號B7）和尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum（編號B8）購買自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心;擬枝孢鐮刀菌Fusarium sporotrichioides（編號B9）購買自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 菌株培養(yǎng)

1.2.1 供試菌株培養(yǎng) 從保藏試管中挑取供試菌株接種在ISP 2培養(yǎng)基上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 3～7 d[15]。

1.2.2 病原菌培養(yǎng) 從保藏試管中挑取病原菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，置于 25 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)7 d[16]。

1.3 拮抗菌的初篩

運(yùn)用平板對峙法[17]將供試菌株接種于ISP 2平板上（10株/皿），于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5～7 d后，在平板中央接種直徑為8 mm的病原菌菌塊，在 25 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)7 d后觀察抑菌效果，對有抑菌活性的陽性菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.4 拮抗菌的復(fù)篩

1.4.1 供試菌體對病原菌生長的影響 運(yùn)用平板對峙法把篩選出的陽性菌株按4點(diǎn)法接種于PDA平板上，方法同“1.3”節(jié)，每個(gè)處理重復(fù)3組，以不接供試菌株為空白對照。

1.4.2 供試菌株發(fā)酵液對病原菌生長的影響 把篩選出的陽性菌株接種于ISP 2液體培養(yǎng)基，置于200 r/min 28 ℃的搖床培養(yǎng)5 d后，離心收集上清液，得到菌株的發(fā)酵液，再將其用0.22 μm的細(xì)菌過濾器進(jìn)行過濾。將200 μL過濾發(fā)酵液涂布于PDA平板，待培養(yǎng)基表面將液體吸收后將直徑為 8 mm 的病原菌菌塊接種于其上[18]，在25 ℃恒溫箱培養(yǎng) 7 d 后觀察抑制效果并計(jì)算抑菌率[19]，每個(gè)處理重復(fù)3組，以清水涂板為空白對照。所獲數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

抑菌率=對照組菌落直徑-處理組菌落直徑對照組菌落直徑-0.8 cm×100%。

1.5 拮抗菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察 在ISP 2培養(yǎng)基上將“1.4”節(jié)中篩選出的陽性菌株進(jìn)行劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長情況及形態(tài)特征。

1.5.2 生理生化特性檢驗(yàn)[20] 測定菌株產(chǎn)生接觸酶、脲酶和酯酶的能力，檢測菌株水解淀粉、明膠液化、牛奶胨化、分解纖維素、還原硝酸鹽和產(chǎn)生硫化氫的能力，同時(shí)進(jìn)行甲基紅（MR）試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)。

1.5.3 分子鑒定 采用酶法小量DNA提取法提取菌體的基因組DNA[15]，運(yùn)用16S rRNA基因的通用引物（PA：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′和PB：5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）[21]進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，隨后送到生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將獲得的16S rRNA基因序列提交到EzBioCloud（https：//www.ezbiocloud.net/identify）進(jìn)行比對，用MEGA 7軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的初篩

從前期分離獲得的83株菌株中，篩選得到10株具有不同程度抑制根腐病病原菌的菌株（表2）。其中，拮抗腐皮鐮孢菌的生防菌最少，僅有1株;而拮抗擬枝孢鐮孢菌和禾谷鐮刀菌的生防菌相對較多，分別有7株和5株。KC 94和KC 112對2種病原菌的生長有拮抗作用，其余的7株供試菌株僅對1種病原菌有抑制效果。僅有KC 121對4種病原菌都具有拮抗活性，因此選擇KC 121進(jìn)行后續(xù)的復(fù)篩工作。

2.2 拮抗菌的復(fù)篩

2.2.1 拮抗菌KC 121對病原菌生長的影響

如圖1所示，KC 121對根腐病的4種病原菌都有不同程度的抑制作用。其中，除對尖孢鐮刀菌的抑制率較低外，對腐皮鐮孢菌、禾谷鐮刀菌和擬枝孢鐮孢菌的抑菌率均高于50%，抑制效果最為明顯的是擬枝孢鐮孢菌，高達(dá)82.66%（表3）。

2.2.2 拮抗菌KC 121發(fā)酵液對病原菌生長的影響

病原菌在涂有發(fā)酵液的平板上培養(yǎng)7 d后觀察發(fā)現(xiàn)（表4），KC 121發(fā)酵液對腐皮鐮孢菌和擬枝孢鐮孢菌的抑制作用較好，抑菌率分別為60.85%和8476%;而對禾谷鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的抑制作用則相對較差，均不到50%，抑菌率最低的為9.20%。

2.3 拮抗菌KC 121的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 KC 121在ISP 2培養(yǎng)基中 28 ℃、培養(yǎng)16 h后觀察發(fā)現(xiàn)，菌落呈淺肉色，邊緣不規(guī)則且顏色淺于中央，表面褶皺、干燥（圖2）。

2.3.2 生理生化特性 如表5所示，KC 121是一株具有接觸酶和脲酶活性的菌株，能夠消化的脂肪酸鏈長度為60，具有液化明膠、胨化牛奶、水解淀粉和還原硝酸鹽的功能，不具備分解纖維素和產(chǎn)生硫化氫的能力。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株KC 121經(jīng)16S rRNA基因測序后得到大小為1371bp的序列片段，將其提交到GenBank獲得16S rDNA序列登錄號為MW652665，同時(shí)在EzBioCloud （https：//www.ezbiocloud.net/identify）進(jìn)行比對， 用 MEGA 7軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[22]。KC 121的16S rRNA基因序列與Bacillus tequilensis（KF036187和MG004174）在系統(tǒng)發(fā)育樹上同屬一個(gè)分支，證明KC 121與特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）的親緣關(guān)系最近（圖3）。

3 結(jié)論與討論

利用筆者所在課題組前期從蘭坪鉛鋅尾礦樣品中分離得到的83株菌進(jìn)行根腐病病原菌的生防菌篩選研究，初篩獲得10株對不同病原菌具有不同抑制效果的生防菌，從中選擇了1株能同時(shí)抑制腐皮鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌4種病原菌的菌株KC 121進(jìn)行后續(xù)的復(fù)篩試驗(yàn)。本試驗(yàn)借鑒醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)等研究中的平板涂布法[18，23]，首次將菌株的發(fā)酵液涂布于平板上進(jìn)行農(nóng)業(yè)病害拮抗菌的篩選。通過平板對峙法和發(fā)酵液涂布法2種方法進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)KC 121和其發(fā)酵液對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果均較好，抑菌率均達(dá)80%以上;但對尖孢鐮刀菌的抑制效果相對較差，抑菌率均低于50%。在針對禾谷鐮刀菌時(shí)，KC 121的菌體本身對病原菌菌絲生長的抑菌率為65.31%，但發(fā)酵液對其的抑菌率僅有9.20%，出現(xiàn)該情況的原因可能是由于抑菌物質(zhì)為胞內(nèi)產(chǎn)物，或是發(fā)酵條件（溫度、培養(yǎng)基、時(shí)間和pH值等）不適宜所導(dǎo)致的。

結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)檢測及分子生物學(xué)測定，鑒定KC 121菌株為特基拉芽孢桿菌。多項(xiàng)研究報(bào)道表明，特基拉芽孢桿菌在諸多方面都有十分重要的作用與應(yīng)用價(jià)值。在農(nóng)業(yè)上，Cuellar等發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽能夠顯著降低香蕉葉斑病發(fā)生的嚴(yán)重性[24];周瑚等研究發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌對多種植物病原菌有抑制作用，例如稻瘟病菌、辣椒膠孢炭疽菌、煙草赤星病菌、黃瓜疫病菌和卵菌具有一定的抑制作用[22]。在工業(yè)上，Angural等將特基拉芽孢桿菌應(yīng)用在紙漿漂白中[25];Singh等研究發(fā)現(xiàn)特基拉芽孢桿菌能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，該活性劑可作為一種消毒劑或類似消毒劑的成分，對浮游細(xì)菌和生物膜中滯留的細(xì)菌均有殺菌作用[26]。在食品加工過程中，具有果膠酶活性的特基拉芽孢桿菌具備去除咖啡種子漿層的能力，部分純化的果膠酶具有澄清果汁的作用[27]。而本研究首次發(fā)現(xiàn)了特基拉芽孢桿菌能夠同時(shí)對鐮刀菌屬的腐皮鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和擬枝孢鐮刀菌4種病原菌生長起拮抗作用，其中對擬枝孢鐮孢菌的抑制效果最好，抑菌率達(dá)80%以上，為后期運(yùn)用生物手段防治該病害提供了菌種資源。

菌株KC 121來源于重金屬含量較高的尾礦極端環(huán)境。目前已有大量研究證明極端環(huán)境中存在豐富的防治農(nóng)業(yè)病蟲害的微生物資源。王彥等在河西走廊敦煌地區(qū)的鹽堿土壤中分離篩選出1株鏈霉菌屬菌株對黃瓜枯萎病病菌有良好的拮抗效果[28];閆建芳等在連黃海海域海底沉積物樣品中獲得1株密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum）對番茄潰瘍病菌（Clavibacter michiganensis）有較好的抑制作用[29];鄭梅霞等從高海拔的可可西里和西藏樣品中篩選得到2株能抑制番茄根腐病病原菌的枯草芽孢桿菌[30];羅曼等在南極沉積物樣品中獲得1株具有廣譜抑菌作用的枯草芽孢桿菌斯氏亞種（Bacillus subtilis subsp. spizizenii），對絲瓜和辣椒的枯萎病病菌均有較強(qiáng)的抑制效果，對長豆褐腐病也有較明顯的拮抗作用[31]。針對尾礦地區(qū)微生物的研究主要集中在多樣性分析及重金屬的污染生態(tài)修復(fù)等方面[32-36]，尚未發(fā)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生防菌的相關(guān)研究和報(bào)道。本研究首次從含有大量重金屬的蘭坪鉛鋅尾礦極端環(huán)境中篩選生防菌，獲得了活性較好的菌株，但抑菌物質(zhì)、抑菌機(jī)理等方面還尚未明確，后續(xù)還需要進(jìn)行更為深入的試驗(yàn)及研究。

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