梅 勇，梁綺華，鄧載安，汪勁松

(1.湖北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435002；2.深圳技術(shù)大學(xué)健康與環(huán)境工程學(xué)院，深圳 坪山 518118)

0 引言

核糖體印跡測(cè)序(ribosome profiling, Ribo-seq)是由Ingolia等發(fā)明的一種對(duì)基因翻譯組學(xué)研究的手段[1]，可以對(duì)正在翻譯的RNA進(jìn)行選擇性測(cè)序，可用于揭示基因翻譯特征。其原理是利用翻譯抑制劑(放線菌酮)阻止核糖體翻譯，然后消化核酸，捕獲和富集核糖體內(nèi)被保護(hù)的免受核酸酶切割的短基因片段，這些小片段又被稱為核糖體足跡(ribosome footprints，RFs)[2]，通過對(duì)RFs的高通量測(cè)序獲得正在翻譯的基因信息和定量信息。此外，根據(jù)數(shù)據(jù)分析可以獲得核糖體在每個(gè)轉(zhuǎn)錄本上的分布和密度，推斷出起始密碼子位置(包括非ATG起始)、密碼子使用偏愛、上游ORFs (uORFs：開放閱讀框)和翻譯暫停景觀等信息。Ribo-seq還能觀察到單個(gè)轉(zhuǎn)錄物的全局3-nt周期性，可發(fā)現(xiàn)小ORFs[3].核酸序列生物信息學(xué)分析能選擇與核糖體足跡一致的讀數(shù)，將讀數(shù)的起點(diǎn)或終點(diǎn)重新校準(zhǔn)到核糖體的肽基位點(diǎn)(P位點(diǎn))，并對(duì)轉(zhuǎn)錄物、密碼子、多密碼子基序的讀數(shù)進(jìn)行定量[4]。

越來越多的實(shí)驗(yàn)和研究表明，低氧環(huán)境是實(shí)體瘤中心常常出現(xiàn)的現(xiàn)象，特別是結(jié)直腸癌[5]。低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1-α)是參與低氧轉(zhuǎn)錄激活的主要轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下，脯氨酰羥化酶和天冬酰胺酰羥化酶被抑制，從而抑制關(guān)鍵HIF1-α的羥基化，阻斷泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)HIF1-α的降解作用，使得HIF1-α的快速積累以適應(yīng)低氧環(huán)境[6]，HIF1-α通過激活下游靶基因來參與癌細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移以及放化療敏感性等生理病理過程[7]。有臨床數(shù)據(jù)證明，腫瘤內(nèi)低氧環(huán)境或基因突變引起的HIF1-α高表達(dá)與許多類型癌癥患者的死亡率增加有關(guān)[8]。然而，低氧條件下的細(xì)胞整體基因表達(dá)和翻譯特征仍不清楚[9]。

細(xì)胞中蛋白質(zhì)水平取決于基因轉(zhuǎn)錄水平、mRNA翻譯水平和蛋白質(zhì)降解水平及其他因素[10]。為了研究低氧條件下結(jié)直腸癌細(xì)胞基因表達(dá)特性和調(diào)控機(jī)制，我們利用CoCl2化學(xué)模擬低氧條件來處理SW620細(xì)胞，使用mRNA-seq和Ribo-seq方法檢測(cè)CoCl2處理前后轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化，并通過比較基因的翻譯效率來尋找低氧條件下調(diào)控的基因。本項(xiàng)目的研究為低氧調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的基因表達(dá)提供了一個(gè)新的角度。

1 材料和方法

1.1 試劑、細(xì)胞株和儀器

胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司(10099141C)；DMEM-高糖培養(yǎng)基(SH30022.01)、PBS(SH30256.01)、青霉素/鏈霉素(SV30010)、胰酶(SH30042.01)均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；HIF1-α抗體(3716S)購(gòu)自美國(guó)CST公司；GAPDH抗體(60004-1-Ig)、羊抗兔IgG(SA00001-2)、羊抗鼠IgG(SA00001-1)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；GLUT3抗體(bs-1207R)、AARE抗體(bs-5983R)購(gòu)買自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；RIPA細(xì)胞裂解液(R0278-500ML)、CoCl2(C8661-100G)購(gòu)自Sigma公司；RNA提取試劑盒(AG21017)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11706)均購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；引物均購(gòu)自華大基因；人結(jié)腸直腸腺癌SW620細(xì)胞系購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海天能公司；TAdvanced 96G PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自德國(guó)Biometra公司；QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) SW620細(xì)胞快速?gòu)囊旱奕〕觯湃?7℃恒溫水浴鍋中輕輕晃動(dòng)融化，細(xì)胞凍存液轉(zhuǎn)移到含5 mL(10%胎牛血清和1%雙抗)DMEM-高糖培養(yǎng)基的25 mm2培養(yǎng)瓶中，在37℃含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CoCl2化學(xué)模擬低氧處理 配制200 mM CoCl2母液，SW620細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好的情況下，分別加入終濃度為0、50、100、200 μM的CoCl2溶液，細(xì)胞培養(yǎng)2～3天。

1.2.3 Western blot 加入適量RIPA溶液提取細(xì)胞的總蛋白，利用BCA方法測(cè)定蛋白濃度；樣品加入上樣緩沖液(Loading Buffer(5×)，在100 ℃金屬浴煮樣5 min；每孔加入15 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳；再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，在5 %脫脂奶粉溶液中封閉1 h；一抗孵育(GAPDH 1∶20000；HIF1-α 1∶1000；SLC2A3 1∶1000；APEH 1∶1000)，4℃過夜；二抗孵育(羊抗兔IgG 1∶3000；羊抗鼠IgG 1∶5000)，室溫孵育45 min；ECL化學(xué)發(fā)光顯影并拍照。

1.2.4 mRNA-seq和Ribo-seq 實(shí)驗(yàn)的樣品準(zhǔn)備 mRNA-seq和Ribo-seq實(shí)驗(yàn)由廣州表觀生物科技有限公司完成。1)mRNA-seq文庫構(gòu)建：用Trizol試劑提取總RNA，mRNA-seq根據(jù)VAHTSTM Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina v2 進(jìn)行制備。2)Ribo-seq文庫構(gòu)建：0 μM和200 μMCoCl2處理的SW620細(xì)胞，含放線菌酮(Cycloheximide)PBS溶液洗滌，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中離心5 min，去上清，重復(fù)一次。細(xì)胞裂解物先經(jīng)過核酸消化，將ribosome bounding RNA與游離mRNA分離。然后富集核糖體-mRNA復(fù)合物，得到RPFs.去除rRNA并用PAGE膠純化后，得到目的RNA片段。在兩端加5’和3’接頭進(jìn)行末端修飾。反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到的cDNA進(jìn)行PAGE膠純化。

1.2.5 測(cè)序方法及數(shù)據(jù)分析 1)將上述方法準(zhǔn)備好的樣品，利用Bioptic Qsep100 Analyzer對(duì)mRNA-seq和Ribo-seq文庫大小分布進(jìn)行質(zhì)檢。2)測(cè)序: 在Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)PE150進(jìn)行測(cè)序。3)數(shù)據(jù)分析：首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制處理，獲取Clean data，利用 Fast QC 分析質(zhì)量分布，堿基含量分布，重復(fù)測(cè)序片段比例等測(cè)序的數(shù)據(jù)質(zhì)量；利用 hisat2 軟件將過濾后的mRNA-seq和Ribo-Seq的reads數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)；使用htseq-count對(duì)mRNA-seq上的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，使用feature Counts軟件計(jì)算ORF區(qū)內(nèi)Ribo-seq水平的reads數(shù)，將其轉(zhuǎn)換為FPKM (Fragments Per Kilobase Million)值；使用 DEseq2 軟件通過log2FC>0條件篩選差異翻譯效率基因；篩選出的差異翻譯效率基因采用 Fisher 檢驗(yàn)計(jì)算篩選出顯著性GO和KEGG.

1.2.6 RNA提取和RT-qPCR 根據(jù)試劑盒說明書，提取總細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 60 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)水平，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)孔(所有使用的引物如表1所示)。

表1 引物序列信息

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過Origin 9.0統(tǒng)計(jì)繪圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.

2 結(jié)果

2.1 CoCl2化學(xué)處理SW620細(xì)胞模擬低氧條件

CoCl2化學(xué)處理是一種常用的化學(xué)模擬低氧處理試劑，CoCl2是羥化酶活性的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可以抑制低氧因子HIF1蛋白的羥基化，減少HIF1與pVHL結(jié)合來達(dá)到穩(wěn)定HIF1蛋白目的[11,12]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們分別利用0 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM的CoCl2處理SW620細(xì)胞，處理后的細(xì)胞利用Western blot技術(shù)檢測(cè)不同條件下HIF1-α的蛋白含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SW620細(xì)胞隨CoCl2濃度升高，HIF1-α蛋白的表達(dá)逐漸增加，在200 μM表達(dá)量最高(圖1)。因此，我們選用了200 μMCoCl2處理的SW620細(xì)胞進(jìn)行mRNA-seq和Ribo-seq實(shí)驗(yàn)。

圖1 CoCl2處理SW620細(xì)胞HIF1-α蛋白含量

2.2 mRNA-seq和Ribo-seq整體數(shù)據(jù)特征分析

為了比較低氧條件對(duì)SW620細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的影響，我們將200 μM的CoCl2處理的SW620細(xì)胞分別分成兩組，一組提取總RNA，用于mRNA-seq采集數(shù)據(jù)，一組用放線菌酮處理，按照Ribo-seq實(shí)驗(yàn)流程獲得采集數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示，在mRNA-seq中，0 μM和200 μMCoCl2處理的樣本的Total Read分別為86226028和93874676，Q30_rate分別為0.978和0.978；Ribo-seq實(shí)驗(yàn)中，Total Read分別為95491377和92705635，Q30_rate分別為0.954和0.967(表2)。這些數(shù)據(jù)顯示mRNA-seq和Ribo-seq采集的數(shù)據(jù)總量和質(zhì)量可滿足下游分析。

表2 mRNA-seq和Ribo-seq的樣本序列質(zhì)控統(tǒng)計(jì)結(jié)果

在Ribo-seq數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)0 μM和200 μMCoCl2處理的樣本RFs主要分布在25～34 nt(圖2a, 2c)。利用riboWaltzR對(duì)25～34 nt的評(píng)估RFs在RNA上的3堿基的周期性分布，如圖2b, 2d看出，橫坐標(biāo)為距離start-codon or stop-codon 的距離，縱坐標(biāo)為比對(duì)上的reads.0 μM和200 μMCoCl2處理的SW620兩組的25～34 nt的RFs符合3 nt特征，這也說明本研究中Ribo-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

圖2 SW620 在0 μM和200 μM CoCl2處理下核糖體的RFs長(zhǎng)度分布(a，c)以及25～34 nt長(zhǎng)度的RFs在翻譯起始位點(diǎn)后50 nt和終止密碼子前50 nt的3 nt特征(b，d)

2.3 CoCl2化學(xué)模擬低氧處理對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的影響

為了分析每個(gè)樣本中的基因轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平之間的關(guān)系，我們對(duì)每個(gè)樣本的mRNAs和核糖體結(jié)合mRNAs的豐度采用TPM (Transcripts Per Kilobase Million)方法來進(jìn)行均一化處理，然后計(jì)算每個(gè)基因的log10(TPM+1)值，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)樣本中基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation)分別為0.77和0.76(圖3a,3b)，說明在我們這兩個(gè)樣本基因的表達(dá)水平和翻譯水平具有強(qiáng)的正相關(guān)性。

圖3 0 μM和200 μM CoCl2處理下轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上log10(FTM+1)關(guān)系(a,b)以及200 μM CoCl2處理后轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的差異表達(dá)基因數(shù)量(c)和轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的基因關(guān)系(d)

根據(jù)mRNA-seq數(shù)據(jù)顯示在0 μM CoCl2處理檢測(cè)到24 613個(gè)基因，200 μM CoCl2處理檢測(cè)到24 321個(gè)基因。與0 μM CoCl2處理相比，200 μM CoCl2處理后的細(xì)胞有118個(gè)基因上調(diào)，119個(gè)基因下調(diào)。根據(jù)Ribo-seq數(shù)據(jù)我們發(fā)現(xiàn)0 μM CoCl2處理下檢測(cè)到6 829個(gè)基因，200 μM CoCl2處理后檢測(cè)到4 941個(gè)基因。與0 μM CoCl2處理相比，200 μM CoCl2處理后的細(xì)胞中有254個(gè)基因翻譯水平上調(diào)，646個(gè)基因翻譯水平下調(diào)(圖3c)。其中，4個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都上調(diào)，16個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都下調(diào)(圖3d)。上調(diào)的基因分別為NDRG1、CXCL8、MIR22HG、SLC2A3，下調(diào)的基因分別為PTK7FIBP、PRSS2、CHCHD10、APEH、BEX3、RAB13、DNPH1、ATF6B、FAM210B、TSTD1、STRA6、SCRN2、IGFBP6、VWA1、TMEM176A.KEGG分析結(jié)果顯示，低氧條件下，翻譯效率差異基因主要富集在10個(gè)信號(hào)通路：癌癥中蛋白聚糖，中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成，酗酒，病毒致癌作用，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，細(xì)胞衰老，補(bǔ)體系統(tǒng)，F(xiàn)OXO信號(hào)通路，ECM受體相互作用，膀胱癌(圖4d)。

圖4 差異翻譯效率基因GO細(xì)胞組分(a)、分子功能(b)和生物過程(c)分析結(jié)果以及差異翻譯效率基因KEGG排名前10的富集結(jié)果(d)

2.4 RT-qPCR和WB驗(yàn)證基因和蛋白表達(dá)

為了探究預(yù)測(cè)的mRNA-seq和Ribo-seq數(shù)據(jù)是否與蛋白質(zhì)水平相匹配。我們從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平變化一致的基因中，挑選了部分基因進(jìn)行了RT-qPCR(NDRG1、SLC2A3、APEH、TMEM176A、FAM210B)和Western blot(SLC2A3、APEH)實(shí)驗(yàn)。RT-qPCR結(jié)果顯示，在低氧條件下，NDRG1和SLC2A3在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)(圖5a, b)，APEH、TMEM176A、FAM210B在低氧條件下轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，但SLC2A3不顯著。Western blot結(jié)果顯示SLC2A3蛋白質(zhì)表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化，APEH蛋白質(zhì)水平降低(圖5c)。這些結(jié)果顯示暗示有的基因的蛋白水平可能與基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平不一致。

圖5 0 μM和200 μM CoCl2處理下HIF1-a、NDRG1、SLC2A3基因表達(dá)(a),APEH、TMEM176A、FAM210B基因表達(dá)(b)和APEH、SLC2A3蛋白表達(dá)(c)情況

3 討論

低氧是腫瘤組織的重要特征之一，但是低氧如何調(diào)控基因表達(dá)的研究仍需要深入研究。本項(xiàng)目中，我們利用mRNA-seq和Ribo-seq技術(shù)分析了CoCl2化學(xué)模擬低氧處理SW620細(xì)胞后基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平變化，并對(duì)基因的翻譯效率進(jìn)行了分析。據(jù)我們所知，這項(xiàng)研究是率先利用mRNA-seq和Ribo-seq技術(shù)研究低氧條件下SW620基因表達(dá)特征的報(bào)告，這些數(shù)據(jù)揭示了低氧條件下SW620的基因表達(dá)模式，將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)結(jié)直腸癌細(xì)胞的特征。

多種方法可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的體外低氧培養(yǎng)，包括低氧培養(yǎng)箱，低氧培養(yǎng)裝置，化學(xué)處理等。CoCl2還可以模擬建立體外Caco-2結(jié)直腸癌細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞的缺氧模型[13]。在本研究中，對(duì)HIF1蛋白的Western blot分析發(fā)現(xiàn)CoCl2處理SW620細(xì)胞也可使HIF1-a蛋白含量升高，也證明了CoCl2處理SW620細(xì)胞模擬低氧環(huán)境是可行的。

本項(xiàng)目中，我們分別采集了CoCl2處理的SW620細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)(mRNA-seq)和翻譯組學(xué)(Ribo-seq)數(shù)據(jù)。每個(gè)處理組的轉(zhuǎn)錄組學(xué)totalread超過100M，QC30超過了95%，可以判斷兩組轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)量和質(zhì)量可滿足下游分析的。在翻譯組學(xué)數(shù)據(jù)中，RFs長(zhǎng)度主要在25～34 nt之間，符合預(yù)期的核糖體保護(hù)的RNA片段(RFs)的長(zhǎng)度在28 nt左右的特征。翻譯過程中，核糖體在可翻譯的RNA以密碼子長(zhǎng)度(3 nt)為單位移動(dòng)，完成一次肽段延伸[14]。因?yàn)楹颂求w在密碼子第一堿基位置停留時(shí)間最長(zhǎng)，因此RFs 比對(duì)位置對(duì)應(yīng)密碼子第一個(gè)堿基的比例通常最高，而第二第三個(gè)堿基都偏低，RFs片段應(yīng)該在翻譯的RNA的開放閱讀框(ORF)中呈現(xiàn)數(shù)據(jù)呈現(xiàn)“高-低-低”三堿基周期模式，即3 nt特征。我們的Ribo-seq實(shí)驗(yàn)中的25～34 nt 的RFs也符合這些特征。由此，我們認(rèn)為本項(xiàng)目中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)(mRNA-seq)和翻譯組學(xué)(Ribo-seq)數(shù)據(jù)質(zhì)量好。

組學(xué)技術(shù)發(fā)展有助于我們對(duì)基因表達(dá)在不同水平的進(jìn)行研究，為我們了解基因表達(dá)調(diào)控提供思路。本項(xiàng)目中，我們利用兩組轉(zhuǎn)錄組學(xué)和翻譯組學(xué)中的RNA豐度進(jìn)行了相關(guān)性分析，研究發(fā)現(xiàn)兩組中的基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都呈強(qiáng)相關(guān)性?；虿町惐磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)翻譯水平上的變化基因數(shù)目大于轉(zhuǎn)錄水平上變化的基因。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)翻譯水平被抑制的基因多于增強(qiáng)的基因。這暗示著低氧條件可抑制基因的表達(dá)，這與Lei等人在玉米中的研究發(fā)現(xiàn)低氧抑制基因翻譯的現(xiàn)象相符合[15]。

我們對(duì)翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平上變化一致的基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，這暗示著低氧條件可以對(duì)這些基因的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平都存在著調(diào)控。NDRG1 (N-myc下游調(diào)節(jié)基因1)是一種與腫瘤侵襲和遷移密切相關(guān)的多功能基因，其通過G1/S期阻滯細(xì)胞周期來抑制Caco2細(xì)胞的增殖，且NDRG1過度表達(dá)時(shí)，侵襲和遷移的強(qiáng)度降低[16]。多個(gè)研究組表明該蛋白受HIF1-α的上調(diào)[17,18]。SLC2A3是編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的溶質(zhì)載體家族，也稱為GLUT3，介導(dǎo)葡萄糖從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，在癌細(xì)胞的代謝重編程中起關(guān)鍵作用[19]。SLC2A3基因的上調(diào)與結(jié)直腸癌患者的OS和DFS降低有關(guān)[20]。Taniguchi-Ponciano等在新冠肺炎重癥患者中發(fā)現(xiàn)HIF1a及其下游與碳水化合物代謝相關(guān)的SLC2A3基因表達(dá)都增加[21]。但是在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SLC2A3的轉(zhuǎn)錄水平受到低氧誘導(dǎo)表達(dá)但不顯著，蛋白水平也沒有顯著變化。這可能是由于不同的細(xì)胞組織低氧對(duì)SLC2A3誘導(dǎo)表達(dá)的程度不同導(dǎo)致的，也有可能是由于不同細(xì)胞對(duì)SLC2A3蛋白穩(wěn)定性調(diào)控不同。APEH(N-酰肽水解酶)是一種細(xì)胞溶質(zhì)酶，又稱氨基酸釋放酶(AARE)，屬于絲氨酸肽酶的脯氨酰寡肽酶家族，在泛素系統(tǒng)以及蛋白質(zhì)分解過程中起重要作用[22]。Palmieri等發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，在阿茨海默癥(AD)樣品中APEH活性顯著降低[23]。TMEM176A(人跨膜蛋白176A)的表達(dá)誘導(dǎo)H1299和H23細(xì)胞G2/M期阻滯導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并抑制集落形成、細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其通過抑制ERK1/2信號(hào)來抑制肺癌生長(zhǎng)[24]。FAM210B一種線粒體外膜蛋白的癌癥進(jìn)展抑制基因，F(xiàn)AM210B的低表達(dá)導(dǎo)致線粒體呼吸能力增加和糖酵解減少，從而激活EMT并增強(qiáng)遷移和侵襲特性，F(xiàn)AM210B缺失與體內(nèi)和體外存活率降低和轉(zhuǎn)移增強(qiáng)顯著相關(guān)[25]。

翻譯效率可以反映基因在翻譯水平上的精細(xì)調(diào)節(jié)。為了研究低氧對(duì)基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，我們分析了低氧條件下的基因翻譯效率的差異基因。KEGG分析發(fā)現(xiàn)低氧條件下最主要影響就是癌癥中蛋白聚糖，性粒細(xì)胞胞外陷阱形成，酗酒，病毒致癌作用，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，細(xì)胞衰老，補(bǔ)體系統(tǒng)，F(xiàn)OXO信號(hào)通路，ECM-受體相互作用，膀胱癌信號(hào)通路中的基因翻譯效率。其中蛋白聚糖信號(hào)通路是富集程度最高的一個(gè)通路，該通路中的26個(gè)基因的翻譯效率受低氧調(diào)控，之前的研究表明相關(guān)的基因有助于腫瘤生長(zhǎng)基質(zhì)的形成，影響細(xì)胞—細(xì)胞和細(xì)胞—基質(zhì)相互作用以及腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的表型和腫瘤基質(zhì)血管生成[26，27]。Zhang等人在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)低氧可調(diào)節(jié)蛋白聚糖信號(hào)通路[28]。本研究揭示了低氧調(diào)控相關(guān)的基因的表達(dá)可能是涉及翻譯水平的調(diào)控。

本文聯(lián)合了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和翻譯組學(xué)對(duì)低氧條件下結(jié)直腸癌細(xì)胞SW620的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)了一系列在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平變化一致的基因，更重要的是通過比較不同條件下基因翻譯效率發(fā)現(xiàn)，低氧可調(diào)控多個(gè)信號(hào)通路的基因翻譯效率，為闡述低氧調(diào)控基因表達(dá)機(jī)制提供新的角度。