李運濤，李 歡，余 思，陳 倩 , 侯建軍

(1.蚌埠學院，安徽 蚌埠 233030；2.食用野生植物保育與利用湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435002)

0 引言

浮游生物在水生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色，它們具有非常重要的生態(tài)作用[1，2]。在淡水研究中，通常將直徑在0.2～5 μm之間的真核浮游生物定義為超微型真核浮游生物，它們數(shù)量龐大、分布廣泛，在淡水生態(tài)系統(tǒng)中扮演著不可或缺的角色[3，4]。水體中的超微型真核浮游生物的多樣性與該水體的營養(yǎng)狀態(tài)有關，不同營養(yǎng)狀態(tài)的水體中浮游生物會有不同的群落組成，故水體的營養(yǎng)狀態(tài)可以用超微型浮游生物的群落組成來判斷[5]。

磁湖位于湖北省黃石市市區(qū)，是黃石市區(qū)內最大的淡水湖，面積約為8平方千米；長江黃石段是黃石地區(qū)最大的活水流，流經黃石市區(qū)。磁湖與長江代表了靜止和流動兩類不同的水體，目前關于這兩類水體浮游生物的對比研究還較少。

本研究采用高通量測序方法，對長江黃石段和磁湖的超微型真核浮游生物的多樣性以及季節(jié)變化進行研究，探究不同流動狀態(tài)的水體中浮游生物多樣性的差異，研究結果可以為闡明區(qū)域水體的生物多樣性特征及水環(huán)境變化規(guī)律提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本研究選取湖北黃石市的城中湖——磁湖和長江黃石城區(qū)段作為目標水域，在2015年10月(秋季)以及12月(冬季)采樣，在每個水域中各設置三個采樣點，具體采樣點的設置如圖1所示。使用不銹鋼分層采樣器采集距離水表約0.5 m處的水樣，每個采樣點各取500 mL水樣，然后將每個水域三個采樣點的水樣混合?；旌纤畼酉冉浐Y絹過濾，接著用5 μm Isopore聚碳酸酯濾膜Isopore (Mil-lip re) 過濾，收集濾液，濾液接著用0.7 μm GF濾膜(Whatman)過濾，以收集超微型浮游生物樣品，將過濾得到的樣品膜于-80℃ 超低溫冰箱保存。四個樣本分別記為CJwin：長江冬季樣本；CJaut：長江秋季樣本；CHwin：磁湖冬季樣本；CHaut：磁湖秋季樣本。

圖1 采樣水域位置 (A: 磁湖; B: 長江)

1.2 理化指標的測定

本研究測定的理化指標有：總氮(TN)、總磷(TP)、pH、水溫(WT)、化學需氧量(CODMn)。水溫在采樣現(xiàn)場由溫度計直接測取，pH值使用pH計讀取，其他理化指標測試方法均使用國家水環(huán)境監(jiān)測的標準檢測法。各水域的營養(yǎng)化程度采用綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)(trophic level index, TLI)法進行評價。綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)的計算選取總氮濃度、總磷濃度、化學需氧量3 個指標，具體計算方法及營養(yǎng)狀態(tài)分級標準參考王鶴揚的方法[6]。

1.3 DNA提取，18S rRNA測序

本研究采用改良CTAB法提取樣品中的總DNA，提取的總DNA 的質量用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測合格的樣品DNA使用Illumina Hiseq PE300平臺進行測序，測序由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。測序針對18S rRNA的V4區(qū)，使用通用引物：F-574(GCG GTA ATT CCA GCT CCA A)和R-952(TTG GCA AATGCTTTC GC)進行測序[7]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測序原始數(shù)據(jù)經拼接、質量過濾并去除嵌合體，得到高質量的 Tags 序列。在相似性 97% 的水平上對序列進行聚類(USEARCH ,version 10.0)。選取Silva數(shù)據(jù)庫(Release128, http://www.arb-silva.de)進行物種比對，物種注釋使用RDP Classifier進行，置信度閾值取0.8(version 2.2, http://sourceforge.net/projects/rdpclassifier/)。樣本聚類分析使用非加權組平均法(Unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)，主坐標分析(Principal Coordinates Analysis，PCoA)和樣本聚類均基于Bray- Curtis 距離。多樣性指數(shù)計算、樣本聚類、主坐標分析均基于OUT數(shù)據(jù)并使用R語言vegan包進行。使用Origin 2018繪制物種相對豐度柱形圖、熱圖以及韋恩圖。本次研究采用徐兆禮、陳亞瞿提出的優(yōu)勢度指數(shù)來判定優(yōu)勢種的組成，選取優(yōu)勢度指數(shù)>0.02的類群作為優(yōu)勢種[8]。優(yōu)勢度指數(shù)計算公式為：Y=(Ni/N)fi，式中N為樣品中超微型真核浮游生物總序列數(shù)，Ni表示第i種類群的序列數(shù)，F(xiàn)i為第i種類群在各樣點出現(xiàn)的頻率[8]。

2 結果與分析

2.1 采樣點基本情況

由各樣點的理化因子判斷，各水域均是秋季營養(yǎng)化程度較高(表1)。根據(jù)綜合營養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)判斷，長江和磁湖站點在冬季處于中營養(yǎng)狀態(tài)，兩個站點在秋季則為輕度富營養(yǎng)狀態(tài)。兩個水域相比較，秋冬兩季長江站點的營養(yǎng)化狀態(tài)均低于磁湖站點。從季節(jié)上來看，兩個水域的營養(yǎng)化狀態(tài)均是秋季高于冬季。

表1 各樣本理化因子數(shù)據(jù)

2.2 測序基本情況

四個樣本測序共得到有效序列130 147條，序列平均長度為340bp左右。各個樣本的稀釋性曲線均趨向平坦，說明本次測序數(shù)據(jù)量是足夠的。四個樣本總共得到430個操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，其中CHaut樣本包含的OTU數(shù)目最多，為314個，CHwin樣本包含的OTU數(shù)目最少，為213個(圖2)。四個樣本共有的OTU為129個，CHaut樣本特有的OTU數(shù)目最多而CHwin樣本特有的OTU數(shù)目最少，它們含有的OUT數(shù)目分別為35個和8個。對兩個樣本共有的OTU數(shù)目進行分析后發(fā)現(xiàn)，CHaut-CJaut樣本共有的OTU最多，為228個，其次是CJaut-CJwin樣本，共有的OTU為200個，CHwin-CJwin樣本共有的OTU為 168個，CHaut-CHwin樣本共有的OTU最少，為165個(圖2)。

圖2 韋恩圖展示四個樣本的OUT重疊

2.3 群落多樣性分析

測序的4個樣本中，磁湖秋季(CHaut)的Chao1指數(shù)最高，提示CHaut具有最高的群落豐富度(表2)。磁湖冬季(CHwin)的Chao1指數(shù)最低，顯示CHwin 的群落豐富度是四個樣本中最低的。兩個水域中的Chao1指數(shù)的總體變化趨勢均為秋季比冬季高，表明黃石水域中的磁湖及長江黃石段超微型真核浮游生物物種豐富度都是秋季比冬季高。在長江站點中Chao1指數(shù)在秋冬兩個季節(jié)間的變化不大，相比之下，磁湖站點的Chao1指數(shù)隨季節(jié)變化波動較大。Shannon指數(shù)和PieLou均勻度指數(shù)最高的樣本是CJaut，但該樣本的Chao1指數(shù)并不是最高的，這說明該樣本的群落均勻度較高。長江站點的群落均勻度較磁湖站點高。群落豐富度方面則是秋季磁湖站點高，冬季長江站點高?？傮w來看，兩個水域群落多樣性均是秋季大于冬季，而長江站點的群落多樣性高于磁湖站點。

表2 各樣本多樣性指數(shù)

兩個水域中超微型真核浮游生物種類豐富，涵蓋各大類群，包括藻類、真菌以及原生動物。在高階分類單元上(絕大多數(shù)在門水平)，兩個水域總共包含19個類群，此外還有大量的未分類序列(圖3)。在磁湖站點中，兩個季節(jié)相對豐度最高的均是綠藻，占比分別為50%(冬季)和32%(秋季)。根據(jù)優(yōu)勢度指數(shù)>0.02的標準，磁湖秋季居于優(yōu)勢的還有纖毛蟲、Protalveolata、金藻、隱藻以及壺菌，而冬季居于優(yōu)勢的則還有隱藻、Protalveolata、纖毛蟲以及隱真菌。長江站點中秋季Protalveolata處于絕對優(yōu)勢，秋季的優(yōu)勢類群還有纖毛蟲、金藻、隱藻以及綠藻，此外還有一些真菌，如隱真菌和擔子菌。與秋季不一樣的是，長江站點中冬季金藻處于絕對優(yōu)勢，冬季優(yōu)勢類群還有綠藻、Protalveolata、甲藻、纖毛蟲和隱藻。這些結果表明兩個水域的物種組成差異較大，優(yōu)勢類群也不一樣，而且優(yōu)勢類群總體上隨季節(jié)變動而變動。檢測到的綠藻中，主要為綠藻綱，Protalveolata主要為帕金蟲科。在總共430個OTU中，相對豐度最高的10個OTU占總序列數(shù)的58.41%，這10個OTU分屬于綠藻、隱藻等，其中OTU3(屬于綠藻綱)在CHwin樣本中占絕對優(yōu)勢，而OTU2(屬于色金藻目)在CJwin樣本中占絕對優(yōu)勢(圖4)。

圖3 不同樣本超微型真核浮游生物門水平變化

圖4 熱圖顯示相對豐度前十的OTU

聚類分析結果顯示(圖5)，四個樣本按季節(jié)聚成兩個大的類群。PCoA分析得到了與聚類分析類似的結果(圖6)，所測的4個樣本沿著第一軸按季節(jié)分開，第一軸可以解釋樣品中所有差異的40.03%，表明季節(jié)對群落結構的影響最大。第二軸將4個樣本按水域分開，第二軸可以解釋樣品中所有差異的33.64%.這些結果表明空間對群落結構的影響小于季節(jié)。

圖5 4個樣本群落結構聚類分析

圖6 4個樣本群落結構PCoA 分析

3 討論

不同水域的營養(yǎng)和水文狀態(tài)會影響水域中的浮游生物組成[9]。本研究結果顯示，長江黃石段水域超微型真核浮游生物多樣性總體上大于磁湖水域，而長江黃石段水域營養(yǎng)狀態(tài)總體小于磁湖水域，這些結果提示水體營養(yǎng)化加劇可導致浮游生物多樣性降低。造成長江黃石段水域營養(yǎng)狀態(tài)總體小于磁湖水域的原因，可能一部分是因為長江水體流動性較強，自凈能力較強，而磁湖為靜止水體，自凈能力稍弱。我們的結果還顯示季節(jié)對群落結構的影響大于空間，這可能是因為兩個水域相距較近，空間因素的影響較弱，季節(jié)變動會引起營養(yǎng)元素及水溫的較大變化，而水溫及營養(yǎng)元素是影響浮游生物生長的關鍵因素[10，11]。金藻多分布于溫度和有機質含量較低、透明度較大的水體，在寒冷季節(jié)生長旺盛[12]。長江站點冬季營養(yǎng)化程度在四個樣本中最低(TLI=38.61)，這或許可以部分解釋為什么金藻在長江站點冬季處于絕對優(yōu)勢。

兩個水域的優(yōu)勢類群主要是藻類，但也有原生動物和真菌。秋季長江站點中隱真菌為優(yōu)勢類群，目前對隱真菌的了解還不多。隱真菌主要在水環(huán)境中發(fā)現(xiàn)，已知某些隱真菌寄生于壺菌中[13]，而壺菌寄生于初級生產者中[14]，這提示隱真菌有可能通過壺菌對初級生產者進行調控，并在水體微食物網(wǎng)中發(fā)揮重要作用。然而有關隱真菌作用于水體微生物網(wǎng)的定量研究還極少[15]。