張曉東　孫立亞　孟然　李趙嘉　王秀萍　吳哲

摘要：為了篩選適宜在濱海鹽堿地區(qū)域生產(chǎn)的蒲公英優(yōu)質(zhì)資源，利用野外搜集、鹽脅迫誘變育種方式獲得22份蒲公英資源。從酚酸類(lèi)功能成分分析、指紋圖譜質(zhì)量分析、體外抗氧化試驗(yàn)以及抑菌能力等角度綜合評(píng)價(jià)22份蒲公英資源的成分及功能活性。結(jié)果表明，誘變蒲公英后代中，T1-3材料的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量分別為13.59、1066、43.08 mg/g，顯著高于親品（品系3）對(duì)照材料;本地蒲公英系列中，唐海6、唐海2的咖啡酸含量較高，但綠原酸、總黃酮含量低于T1系列誘變材料。結(jié)合質(zhì)量圖譜分析結(jié)果可知，鹽脅迫對(duì)蒲公英質(zhì)量具有提升作用，0.5%鹽脅迫處理能顯著提升誘變系列材料（T4-2、T6-3和T6-4-1）和唐海本地系列（除唐海6外）材料的相應(yīng)成分含量?？寡趸囼?yàn)和抑菌能力測(cè)試結(jié)果表明，高功能成分含量的蒲公英材料與功能活性測(cè)試結(jié)果一致，其中T1系列材料的功能活性最強(qiáng)。綜合研究分析可知，T1-1、T1-3、T2-3-2和T3-2-1等誘變材料和唐海2蒲公英資源可作為優(yōu)質(zhì)新品系選育材料。

關(guān)鍵詞：蒲公英資源;鹽堿地;指紋圖譜;抑菌;抗氧化;酚酸類(lèi)成分

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.23+9.01;R284文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2021）19-0190-06

蒲公英是菊科蒲公英屬多年生草本植物，其分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng)，是我國(guó)傳統(tǒng)藥食同源植物。蒲公英的活性成分主要是萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、倍半萜內(nèi)脂化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗癌等作用。長(zhǎng)期以來(lái)，蒲公英主要以粗放式或野生種植為主，關(guān)于其人工育種和栽培管理等的研究較少。近年來(lái)，隨著蒲公英的醫(yī)療與營(yíng)養(yǎng)保健功能被進(jìn)一步發(fā)掘和利用，蒲公英的需求量呈上升趨勢(shì)，人工栽培面積也逐年擴(kuò)大，迫切需要蒲公英育種和栽培等相關(guān)研究。目前，蒲公英育種主要采用資源鑒選、誘變育種等方法，如山西農(nóng)業(yè)大學(xué)采用多倍體育種方法育成新品種銘賢1號(hào)，河北省農(nóng)林科學(xué)院采用鹽脅迫誘變育種方法育成新品種濱蒲1號(hào)，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)采用資源馴化篩選方式育成新品種沈農(nóng)蒲公英1號(hào)等。然而，目前蒲公英新育成的品種依然稀少，難以滿足當(dāng)前蒲公英醫(yī)用、保健、菜用等多樣化需求?；诖?，本研究以河北省收集的蒲公英資源以及人工鹽脅迫誘變獲得的共22份蒲公英資源為研究對(duì)象，通過(guò)不同產(chǎn)地及鹽生環(huán)境下的功能成分含量、抗氧化性以及抑菌能力等多個(gè)角度分析，綜合篩選表現(xiàn)較好的資源，以期為今后的蒲公英品質(zhì)育種奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與地點(diǎn)

本研究共包括22份蒲公英材料，其中T系列的12份資源為河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所以野生的大葉蒲公英葉片為外植體親本，采用鹽脅迫突變體誘變育種方法獲得的表現(xiàn)較好品系材料^[1-3]，其余10份資源是近年來(lái)從河北省各地收集的且在本地表現(xiàn)較好的材料，暫以收集地點(diǎn)命名，詳見(jiàn)表1，其中誘變后代材料的親本（品系3）及市售栽培品種（保定）為對(duì)照。所有試驗(yàn)均在濱海農(nóng)業(yè)研究所現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范基地進(jìn)行，試驗(yàn)時(shí)間為2020年8—9月。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1蒲公英栽培及取樣所有蒲公英資源種子均在溫室中播種（2020年8月17日），待長(zhǎng)出3張葉片時(shí)移栽至示范基地大田中，栽培行距×株距為20 cm×10 cm，試驗(yàn)期內(nèi)采取負(fù)壓滴灌自動(dòng)灌溉系統(tǒng)，其中負(fù)壓控制的土壤基質(zhì)勢(shì)為-15 kPa，水資源為灤河河水^[4-5]。田間土壤為濱海鹽堿土，土壤含鹽量為0.3%～0.4%，土壤容重為1.4～1.6 g/cm3，地下水埋深為0.8～1.2 m，地下水礦化度>10 g/L，土壤pH值為7.8～8.5，有機(jī)質(zhì)含量為1.426%，速效氮含量為62.3 mg/kg，速效磷含量為27.1 mg/kg，速效鉀含量為232 mg/kg。

隨機(jī)選擇其中的10份資源另行設(shè)定鹽脅迫處理，鹽脅迫濃度為0.5%，采用地下微咸水（原始鹽度為1.2%）調(diào)配，對(duì)照處理的鹽濃度為0.1%，鹽脅迫試驗(yàn)在示范基地的耐鹽鑒定池中進(jìn)行[5-6]。待蒲公英移栽1周后（2020年9月14日）進(jìn)行第1次飽和灌溉微咸水，移栽2周后（2020年9月21日）重復(fù)1次，移栽3周后（2020年9月28日）對(duì)所有處理采樣并進(jìn)行成分檢測(cè)和功能測(cè)試。

1.2.2蒲公英成分的提取參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2020版），將蒲公英鮮葉放置于烘箱中，于60 ℃烘干至水分含量低于13%，然后將蒲公英粉碎過(guò)80目篩，稱(chēng)取約0.1 g樣品，加入5 mL纖維素酶溶液（質(zhì)量濃度為0.1%，pH值為4，酶活性為 5 000 U/g）;于60 ℃水浴30 min后用70%甲醇溶液定容至25 mL，然后超聲處理120 min，超聲功率為120 W;隨后于4 000 r/min離心15 min，取上清液，備用^[7-8]。

1.2.31，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除試驗(yàn)? 按照“1.2.2”節(jié)中所述方法，分別取1 mL提取液置于10 mL離心管中，加入3 mL 0004% DPPH溶液，室溫下避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率^[9]：

式中：D₀為1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;D_s為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度;D_c為1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.2.4抑菌能力測(cè)試按照“1.2.2”節(jié)所述方法，將提取液旋轉(zhuǎn)蒸干濃縮至生料濃度為2.5 g/mL，備用。將活化后的金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，于32 ℃培養(yǎng)24 h后，用比濁法將各菌株用無(wú)菌水配制成106 CFU/mL的菌懸液。采用預(yù)混勻法向牛肉膏蛋白胨平板中加入0.2 mL細(xì)菌的菌懸液，采用濾紙片法進(jìn)行體外抑菌能力測(cè)試，以5 μg/mL芐卡青霉素鈉為陽(yáng)性對(duì)照。處理24 h后測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，計(jì)算平均抑菌圈直徑^[10]。

1.3咖啡酸、綠原酸及總黃酮含量的檢測(cè)

按照“1.2.2”節(jié)中所得提取液，用注射器和045 μm有機(jī)濾膜將濾液注入進(jìn)樣瓶中，再用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量。其中HPLC條件為安捷倫1200 HPLC，鉆石1代C18色譜柱 （4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相A（0.02% 磷酸水溶液） ∶流動(dòng)相B（甲醇）=50 ∶50;檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm;柱溫為30 ℃;流速為1 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。

配制不同濃度的綠原酸、咖啡酸和蕓香苷標(biāo)品，與對(duì)應(yīng)的HPLC峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)擬合后，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如下：y₁=16.835x₁-16.971，r²=0.999 6;y₂=22.173x₂-13.042，r²=0.999 2;y₃=15.467x₃+1.900，r²=0.999 6。式中，y₁、y₂、y₃分別為綠原酸、咖啡酸、蕓香苷的峰面積;x₁、x₂、x₃分別為綠原酸、咖啡酸、以蕓香苷計(jì)的總黃酮含量，有效檢測(cè)范圍均為0～100 μg/mL^[7-9]。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理均設(shè)3次重復(fù)，所得數(shù)據(jù)均使用Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并采用SPSS 22.0軟件分析，包括單因素方差分析和Duncans（D）顯著性分析。蒲公英成分質(zhì)量采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2結(jié)果與分析

2.1蒲公英資源和品系的功能成分含量分析

對(duì)22個(gè)蒲公英品系的綠原酸、咖啡酸和總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定后，按照材料編號(hào)排列，其中標(biāo)記為T(mén)的材料為鹽脅迫誘變后代，品系3為誘變材料的親本，詳見(jiàn)表1。T1系列材料和T3-2-1 3類(lèi)功能成分的總體水平較高，T1-3材料的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量均最高，分別較親本提高了1.43、2.96、2.61倍，分別比市場(chǎng)銷(xiāo)售品種（保定）提升了1.24、2.29、2.21倍;T3-2-1材料的3類(lèi)功能成分較高，分別較親本提升了0.90、2.40、1.90倍，分別較市場(chǎng)銷(xiāo)售品種（保定）提升了0.76、1.82、158倍。在唐海本地系列蒲公英中，唐海6、唐海2的表現(xiàn)較好，咖啡酸含量較高，但綠原酸、總黃酮含量低于上述誘變系列。綜合品質(zhì)分析認(rèn)為，T1-1、T1-3、T1-4、T3-2-1等誘變材料和唐海2、唐海6為代表的本地蒲公英資源可作為優(yōu)質(zhì)候選新品系。

另外，由于本試驗(yàn)所處地區(qū)為濱海鹽堿地區(qū)域，考慮到田間的實(shí)際情況，特別考察了鹽脅迫對(duì)蒲公英功能成分的影響。從表1中隨機(jī)選出10份材料，測(cè)試它們?cè)?.5%鹽脅迫下的功能成分含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，鹽脅迫明顯提升了大部分蒲公英資源的功能成分含量，其中誘變系列資源（T4-2、T6-3和T6-4-1）在鹽脅迫下的咖啡酸、綠原酸、總黃酮含量較對(duì)照提升了4.4%～33.3%，然而這些物質(zhì)的含量整體較唐海本地系列及親本低。在唐海系列蒲公英中，除了唐海6外，其余唐海本地系列蒲公英在鹽脅迫下的功能成分含量呈降低趨勢(shì)。邯鄲蒲公英的咖啡酸、綠原酸、總黃酮含量在鹽脅迫下均最高，且分別較對(duì)照提升了1.79、0.72、1.37倍。從濱海鹽堿地區(qū)域蒲公英栽培的角度考慮，鹽脅迫下功能成分含量較高的資源可作為優(yōu)質(zhì)蒲公英候選品系。

2.2蒲公英品系的體外抗氧化功能驗(yàn)證

以22份蒲公英資源的酚酸提取物為材料，對(duì)DPPH自由基消除能力進(jìn)行驗(yàn)證。由圖2可以看出，突變體材料中除了T3-2-2、T5-3-1和T6系列外，其余材料對(duì)DPPH自由基的清除率均在82.8%以上，與親本品系3、唐海本地系列相當(dāng)，其中T1系列的表現(xiàn)優(yōu)于T2系列，T1-4對(duì)DPPH自由基的清除率最高，為94.9%，與親本相比提高了7.0%，與市場(chǎng)銷(xiāo)售品種（保定）相比提高了38.6%，說(shuō)明該誘變體系總體上具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

2.3蒲公英品系的抑菌功能驗(yàn)證

以卞卡青霉素鈉的抑菌能力作為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算22個(gè)蒲公英材料與對(duì)照之間的抑菌能力差異。由圖3可以看出， 蒲公英提取液對(duì)2種細(xì)菌都表現(xiàn)

出一定的抑菌能力，但材料之間抑菌能力的強(qiáng)弱不同，與對(duì)照相比，突變體材料T1-1、T2-3-2、T2-3-4、T3-2-1、T6-4-2對(duì)2種細(xì)菌較其余材料均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌能力，對(duì)金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌能力分別較對(duì)照高2.1%～5.9%、

1.3%～9.0%。非誘變材料中，唐海2和品系3也

表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。其余非誘變材料盡管也表現(xiàn)出一定的抑菌活性，但是與對(duì)照相比，抑制這2種細(xì)菌能力分別降低了0.7%～32.6%、1.7%～36.6%。上述結(jié)果表明，相對(duì)而言突變體材料具有較高的抑菌活性。

2.4蒲公英指紋圖譜質(zhì)量分析

將表1中的22份蒲公英材料以及部分作耐鹽處理的材料（共計(jì)37個(gè)）的HPLC記錄峰譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件，經(jīng)過(guò)峰點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，以親本品系3為參照?qǐng)D譜，以中位數(shù)法t=0.1 min建立對(duì)照指紋圖譜（圖4）。根據(jù)峰匹配結(jié)果，以峰面積為參數(shù)，計(jì)算出待試蒲公英指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的整體相似度，結(jié)果表明，所有待試材料的相似度均大于0.9，符合指紋圖譜相似度要求。圖4中的S1～S12為突變體誘變系列，其中與親本（S13）相似度相當(dāng)?shù)挠蠺6-4-1、T6-4-2、T6-3 和T2-3-2，其中T6-4-1相似度最高，為0.997;S14～S17為除唐海本地外河北省收集的蒲公英材料，其中保定蒲公英（S15）的相似度最高，為0.997;S18～S27、S28～S37為10個(gè)蒲公英材料（見(jiàn)表1中額外標(biāo)記的編號(hào)）在非鹽脅迫和0.5%鹽脅迫下的圖譜，可以看出，在鹽脅迫下各蒲公英圖譜的峰面積均變大，而對(duì)應(yīng)的相似度也有所提升，從 0.990～0998提升至0.995～0.999，說(shuō)明鹽脅迫能夠增加蒲公英主要成分含量，進(jìn)而提升蒲公英的質(zhì)量。由圖5可以看出，這批蒲公英材料中典型的共有峰有4個(gè)，分別對(duì)應(yīng)七葉內(nèi)酯^[11]、綠原酸、木樨草苷和咖啡酸。

3結(jié)論與討論

蒲公英含有多種活性成分，如黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、酚酸類(lèi)和多糖等[12]，其中含酚酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)較多。酚酸類(lèi)物質(zhì)包括咖啡酸和綠原酸，具有明顯的抑菌作用。此外，蒲公英中還含有較高含量的菊苣酸、單咖啡酰酒石酸，這2種有機(jī)酸均為咖啡酸的衍生物，具有降糖、降脂、抗菌、抗病毒和治療感冒的功效[12-13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分誘變獲得的蒲公英材料中的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量較親本顯著提升，這些材料包括T1-1、T1-3、T1-4、T2-3-2及T3-2-1，唐海本地系列中的唐海2、唐海3、唐

海5、唐海6的功能成分也顯著高于誘變親本，另外鹽脅迫處理也有利于蒲公英材料功能成分的累積。從抗氧化性試驗(yàn)和抑菌能力測(cè)試結(jié)果看出，這些材料均較其余材料表現(xiàn)出較好的功能性，尤其是T1系列材料，與其余蒲公英材料相比其功能活性最強(qiáng)。該結(jié)果表明，高功效成分的材料具有較高的功能活性。該結(jié)論與目前多數(shù)藥用植物功效研究結(jié)論一致，例如孫博等利用超高效液相色譜儀連接二級(jí)陣列檢測(cè)器（UPLC-DAD）檢測(cè)方法對(duì)不同產(chǎn)地13批次蒲公英制成的飲片主成分檢測(cè)，結(jié)果表明，高咖啡酸含量（11.34 μg/mL）的蒲公英質(zhì)量最高^[14]。孫長(zhǎng)霞等研究了不同溶劑提取的蒲公英提取物的體外抑菌效果，結(jié)果表明，蒲公英醇提液得率及抑菌能力（枯草芽孢桿菌、金色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25～0.75 g/mL）均高于水提液^[15]。然而，植物中的功能活性物質(zhì)并非單一成分，對(duì)提取物中的具體成分功效還應(yīng)繼續(xù)研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同處理能夠影響蒲公英化學(xué)成分的含量，其中部分的誘變系列如T4-2、T6-3和T6-4-1的主要功能成分含量比親本或其他資源低，其功能活性及指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果也均低于其他資源，原因可能在于鹽脅迫誘變過(guò)程中某基因缺失造成的連鎖反應(yīng)。劉艷芬等利用NaCl脅迫蒲公英愈傷組織，經(jīng)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）分子鑒定結(jié)果表明，與親本愈傷組織相比，在0.8%、1.0%鹽度下，750、500 bp處分別少了1、2條帶，推測(cè)缺失的該基因可能與蒲公英功能成分合成有關(guān)^[2-3]。另外鹽脅迫也會(huì)影響蒲公英功能成分含量。本研究發(fā)現(xiàn)，除了唐海2、唐海3和唐海5資源外，其余所有蒲公英在鹽脅迫下的咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量均有提升，該結(jié)論與目前一些研究結(jié)果一致。例如Wu等研究鹽堿地蒲公英栽培技術(shù)對(duì)蒲公英生長(zhǎng)和功能成分的影響發(fā)現(xiàn)，在0.3%～04%土壤鹽度條件下，蒲公英中綠原酸、總黃酮含量最高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，蒲公英耐鹽的閾值為0.40%～043%，過(guò)高的鹽脅迫會(huì)影響蒲公英功能成分的積累^[16]。在本研究中，唐海2、唐海3和唐海5蒲公英資源在0.5%鹽脅迫條件下的功能成分下降，可能與該系列蒲公英的耐鹽閾值較低有關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前關(guān)于蒲公英功能成分方面的評(píng)價(jià)研究較多，然而缺乏相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定了合格的蒲公英標(biāo)準(zhǔn)為咖啡酸含量不低于0.02%;2020版《中華人民共和國(guó)藥典》則規(guī)定了合格的蒲公英標(biāo)準(zhǔn)為菊苣酸含量不低于045%，蒲公英飲片中的菊苣酸含量不低于0.3%。然而，無(wú)論《中華人民共和國(guó)藥典》如何規(guī)定，現(xiàn)代中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，中藥是一個(gè)多組分的化學(xué)庫(kù)，它的療效不是來(lái)自單一的活性化學(xué)成分，而是來(lái)自多種成分之間的協(xié)同作用^[17]。中藥質(zhì)量指紋圖譜分析則得益于多成分批量模糊分析而廣泛用于中藥化學(xué)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)、品種篩選、產(chǎn)品篩選等。如孫博等以綠原酸為特征利用指紋圖譜分析篩選了綜合質(zhì)量較好的蒲公英飲片^[14];李景華等則以咖啡酸為特征利用指紋圖譜對(duì)吉林市12種蒲公英質(zhì)量進(jìn)行了分析^[17];馮倩等則以咖啡酸和總黃酮為特征分析了不同產(chǎn)地蒲公英藥材質(zhì)量^[18]。本研究則通過(guò)咖啡酸、綠原酸和總黃酮含量結(jié)合指紋圖譜對(duì)22份蒲公英資源共計(jì)37個(gè)處理進(jìn)行了分析和驗(yàn)證，結(jié)果表明，蒲公英資源的功能成分與指紋圖譜質(zhì)量分析結(jié)果一致，可充分說(shuō)明這些資源可作為高質(zhì)量蒲公英品種的候選資源，例如部分的T1系列、T2系列及唐海系列。蒲公英育種不僅僅依據(jù)功能成分，也與蒲公英的生物量、抗病性等密切相關(guān)，由此可見(jiàn)，篩選或培育一個(gè)優(yōu)秀的蒲公英品種需要綜合考慮各因素指標(biāo)。

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基金項(xiàng)目：河北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（編號(hào)：2019-1-6-1）;河北省省級(jí)科技計(jì)劃（編號(hào)：19227126D）;唐山市重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：19150202E）。

作者簡(jiǎn)介：張曉東（1965—），男，河北石家莊人，副研究員，主要從事功能產(chǎn)品研發(fā)及鹽堿地高效利用研究。E-mail：nkybhszxd@163.com。

通信作者：吳? 哲，博士，副研究員，主要從事功能植物成分提取及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究。E-mail：wuzhe26l@163.com。