李秋宇,金醒昉,朱惠容,李京輝

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650051；2.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，云南 昆明 650051；3.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院病理科，云南 昆明 650051)

膿毒癥(sepsis)是由感染導(dǎo)致的全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，可發(fā)展為膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS),并進(jìn)一步發(fā)展為多器官功能衰竭(multiple organ failure，MOF)。在膿毒癥諸多易受損器官中 ，肺臟是膿毒癥是最易被攻擊的靶器官 ，患者常較早并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征(acute respir‐ atory distress syndrome ，ARDS) ，是膿毒癥患者死亡的主要原因之一[1]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者的共同病理生理特征使一系列炎性細(xì)胞被相繼激活[2]，炎性反應(yīng)通過(guò)多種分子和細(xì)胞機(jī)制促進(jìn)凝血活化，炎性反應(yīng)和凝血之間的反饋?zhàn)饔眉觿×似鞴俟δ苷系K?，F(xiàn)代研究表明，紅花黃色素具有擴(kuò)張血管、改善心肌供血、明顯抑制ADP誘導(dǎo)的家兔血小板聚集[3]、抗炎作用等多種藥理作用，適用于冠心病、血管栓塞性疾病、高血壓、糖尿病并發(fā)癥等疾病[4]。因此本實(shí)驗(yàn)再次深入研究膿毒癥導(dǎo)致大鼠早期ARDS時(shí)不同劑量紅花黃色素A對(duì)大鼠血清中細(xì)胞因子和肺部功能的影響，希望能給膿毒癥治療提供更多實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，取健康SD大鼠195只，雌雄不拘，體重140～224 g(昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)(通風(fēng)向陽(yáng)，自由飲水，新鮮飼料，溫度20～22℃，濕度50%～55%)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型制備：清潔級(jí)雌雄不拘SD大鼠，體重 140～224 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照Rittirsch等報(bào)告的方法行CLP，復(fù)制嚴(yán)重腹腔感染致大鼠膿毒癥模型[5]。術(shù)前禁食12 h，可以自由飲水。以3%戊巴比妥腹腔注射(0.12 ml/kg體重)麻醉，大鼠麻醉后，腹正中線切口，結(jié)扎暴露的盲腸根部(避免結(jié)扎回盲部腸系膜血管)，用16號(hào)穿刺針貫通穿刺盲腸2次形成腸瘺，并輕輕擠壓讓小量大便進(jìn)入腹腔。將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢皮下立即注射10 ml生理鹽水，抗休克，給自由飲水。

1.2.2動(dòng)物的分組及處理：SD大鼠195只，雌雄隨機(jī)分成5個(gè)大組，細(xì)分13個(gè)小組，每組15只：正常對(duì)照組、手術(shù)組(模型組)、手術(shù)組+紅花黃色素A 20 mg/kg組、手術(shù)+紅花黃色素A 40 mg/kg組、手術(shù)+紅花黃色素A 60 mg/kg組，后四組再按處死大鼠時(shí)間分為手術(shù)后6 h組、12 h組、24 h組三組。紅花黃色素A各組于CLP后立即將注射用紅花黃色素(浙江永寧藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：20050148)20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg稀釋至1 ml進(jìn)行腹腔注射，而給予手術(shù)組等量生理鹽水，繼而將大鼠按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉后, 經(jīng)腹主動(dòng)脈無(wú)菌采血，采集肺部標(biāo)本。送檢各項(xiàng)目的測(cè)試。

1.3標(biāo)本采集及處理

1.3.1血標(biāo)本的采集與處理：將動(dòng)物按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈無(wú)菌采血，留取1 ml立即送檢動(dòng)脈血?dú)夥治?，留? ml血于含有3.8%枸櫞酸鈉的試管內(nèi)，分離血漿于-80℃保存待用。

1.3.2留取標(biāo)本用動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x檢測(cè)氧分壓：用大鼠APC酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA ) [江萊化學(xué)科技(上海)有限公司]檢查白介素-1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子(TNF-α)，血清組織因子(TF)及組織因子途徑抑制物(TFPI)。

1.3.3支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)分類：將支氣管肺泡灌洗液離心，獲得的細(xì)胞沉渣懸浮于0.2 ml鹽水中，涂片，離心，瑞-吉染液染色，在40倍光鏡下分類計(jì)數(shù)玻片上每200個(gè)細(xì)胞中的中性粒細(xì)胞。

1.3.4肺部病理切片制作： 大鼠處死后，立即取左下肺肺葉，取0.9%生理鹽水沖洗干凈血漬，放置固定液中，送本院病理實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行固定，脫水，浸蠟，包埋，切片，然后由病理實(shí)驗(yàn)室醫(yī)師出片報(bào)告。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、TF、TFPI表達(dá)含量：IL-1β：CLP各時(shí)間組、CLP+紅花黃色素A低劑量6 h組、12 h組和中、高劑量6 h組較正常組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， CLP+紅花黃色素A低劑量24 h組、中劑量12 h組、24 h組和高劑量6 h組、12 h組、24 h組較CLP相同時(shí)間組下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CLP+高劑量6 h較低低劑量6 h組下降明顯 (P<0.05)。說(shuō)明紅花黃色素A對(duì)白介素-1β有下調(diào)作用，但低劑量組時(shí)下降不明顯，反而到中-高劑量組效果才明顯。見表1。

TNF-α：CLP組與紅花黃色素A各劑量組較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同一時(shí)間段CLP+紅花黃色素A中劑量12 h組、24 h組和高劑量6 h組、12 h組、24 h組的比CLP組相同時(shí)間段比較明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中-高劑量組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明紅花黃色素可以顯著減少膿毒癥時(shí)TNF-α的釋放。而且與劑量有關(guān)。見表1。

TF：CLP組和CLP+紅花黃色素A各劑組較正常組顯著升高(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A低、中劑量的12 h組，24 h組及高劑量的6 h組、12 h組、24 h組較CLP組相同時(shí)間段下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，CLP+紅花黃色素A相同時(shí)間段不同劑量組之間相比較，高劑量組6 h組、24 h組較低劑量相同時(shí)間段有明顯差異，說(shuō)明對(duì)于下調(diào)組織因子小劑量的紅花黃色素A12 h就已經(jīng)有效，但高劑量效果更明顯。見表1。

TFPI：與正常組相較CLP+紅花黃色素A各劑量組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， CLP+紅花黃色素A各劑量12 h組、24 h組較相同時(shí)間段的CLP組升高明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明紅花黃色素對(duì)組織因子途徑抑制物有增強(qiáng)調(diào)節(jié)作用，在低劑量12 h就有增強(qiáng)作用，到24 h時(shí)增強(qiáng)最明顯。見表1。

表1 各組大鼠血清中 TNF-α,IL-1β，TF，TFPI表達(dá)含量

2.2各組大鼠動(dòng)脈血氧分壓(mm Hg)比較：與正常組比CLP組和紅花黃色素A各劑量組PaO2顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A各劑量組與CLP組相同時(shí)間段比較，血氧分壓均改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A相同時(shí)間段不同劑量組之間相較：高劑量組較低劑量組有改善，高劑量6 h組、24 h組較低劑量組血氧分壓明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明低劑量的紅花黃色素A已經(jīng)有改善氧和的作用，只是高劑量的紅花黃色素A 改善血氧含量的功效強(qiáng)于低劑量組。見表2。

表2 大鼠動(dòng)脈血氧分壓

2.3各組大鼠氧合指數(shù)比較：與正常組比CLP組和紅花黃色素A各劑組氧合指數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A各劑量組與CLP組相同時(shí)間段比較氧合指數(shù)改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A相同時(shí)間段不同劑量組之間相較，高劑量12 h組、24 h組較低劑量組氧合指數(shù)明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明低劑量的紅花黃色素A已經(jīng)有改善氧和指數(shù)的作用，只是高劑量的紅花黃色素A 改善血氧含量的功效強(qiáng)于低劑量組。見表3。

表3 大鼠氧合指數(shù)

2.4各組大鼠肺支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)：與正常組比CLP組和紅花黃色素A各劑組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A各劑量組與CLP組相同時(shí)間段比較中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，CLP+紅花黃色素A相同時(shí)間段不同劑量組之間相較，高劑量組較低劑量組有改善明，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明低劑量的紅花黃色素A已經(jīng)有減少中性粒細(xì)胞炎性聚集是作用，只是高劑量的紅花黃色素A 改善炎性反應(yīng)功效強(qiáng)于低劑量組。見表4。

表4 大鼠肺支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

2.5各組光鏡下大鼠肺組織病理表現(xiàn)(HE×40倍)比較：正常組肺組織病理切片肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡壁光滑薄，肺泡間隔一致、均勻，CLP 6 h炎性病變重度、肺間質(zhì)中度水腫，肺間質(zhì)內(nèi)及肺泡腔見中度淤血。CLP+紅花黃色素A 6 h炎性病變中度、肺間質(zhì)中度水腫，肺泡腔內(nèi)見中-輕度淤血。CLP 12 h組炎性病變重度、肺間質(zhì)中度水腫，部分肺泡腔變窄或消失，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)見中度淤血。CLP+紅花黃色素A 12 h肺泡壁增厚、肺泡腔變窄、腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)充血、水腫，可見局部肺氣腫并灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。CLP 24 h肺泡壁明顯增厚，肺泡腔變窄或消失,肺間質(zhì)增寬，腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞明顯增多，肺間質(zhì)水腫、充血, 可見肺氣腫伴局灶性肺不張并炎性細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，CLP+紅花黃色素A 24 h組肺泡壁變薄，肺泡腔變窄，腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)充血、水腫，可見局部肺氣腫并灶狀炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。紅花黃色素A治療后肺部組織的病變較CLP相同時(shí)間段組明顯緩解。見圖1。

注：A:正常肺組織；B: CLP6h組肺組織；C: CLP+紅花黃色素A 6 h組肺組織；D: CLP 12 h組肺組織；E: CLP+紅花黃色素A 12 h組大鼠肺組織；F: CLP 24 h組肺組織；G: CLP+紅花黃色素A 24 h組肺組織

3 討論

膿毒癥是臨床中極為常見的一種病情兇險(xiǎn)、病死率高的綜合征。膿毒癥時(shí)各炎性因子和炎性細(xì)胞共同構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的炎性系統(tǒng)，相互協(xié)同或彼此拮抗，一旦機(jī)體炎性細(xì)胞免疫平衡被打破，則發(fā)生炎性介質(zhì)大量釋放，導(dǎo)致全身靶器官組織的損傷，其中首先累及的臟器是肺，最早、最常見的并發(fā)癥是ALI/ARDS(急性肺損傷/呼吸窘迫綜合征)，也是膿毒癥患者直接死亡的原因之一。既往關(guān)于膿毒癥ARDS在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究[6]，已有部分指標(biāo)如TNF-α、IL-10、IL-6應(yīng)用于臨床，作為膿毒癥ARDS早期預(yù)警生物標(biāo)志物之一指導(dǎo)其早期診斷和治療。近年來(lái)，膿毒癥導(dǎo)致的急性肺損傷主要還是在積極治療膿毒癥的同時(shí)給予呼吸機(jī)機(jī)械通氣治療，但病死率仍高達(dá)30%～70%[7]，因此本實(shí)驗(yàn)再次深入研究膿毒癥導(dǎo)致大鼠ALI/ARDS時(shí)不同劑量紅花黃色素A對(duì)肺部炎性反應(yīng)的控制和肺部功能的改善，希望能給膿毒癥治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

肺部生理解剖結(jié)構(gòu)顯示，肺是唯一接受全部心排血量的器官 ，有著豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在局部炎性反應(yīng)中起著積極主動(dòng)的作用，肺巨噬細(xì)胞釋放一系列損傷性炎性介質(zhì)，是肺局部趨化因子的主要來(lái)源，可引起中性粒細(xì)胞等在肺臟的聚集造成損傷[8]，同時(shí)肺內(nèi)過(guò)度活化的炎性反應(yīng)，最終出現(xiàn)肺部廣泛的滲出，肺間質(zhì)及肺泡水腫，氧交換發(fā)生障礙，發(fā)生ALI /ARDS[9]。因此，在膿毒癥中肺臟是最早受累的靶器官，其急性肺損傷 (ALI)出現(xiàn)得最早且發(fā)生率最高。

紅花是中醫(yī)治療中常用的中藥之一，在很多驗(yàn)方中都是主要成分。由紅花中提取的注射用紅花黃色素主要成分是紅花黃色素A，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)它有降低白細(xì)胞黏滯及抗血小板集聚功能[10]，故而對(duì)抗凝血和改善循環(huán)，改善器官供血[11]降血壓、改善心肌缺血[12-13]，降血脂[14]，抑制細(xì)胞凋亡從而保護(hù)大鼠大腦缺血再灌注的損傷[15]，抗氧化[16]提高機(jī)體耐受缺氧的能力[17]抗炎作用，保護(hù)脂多糖導(dǎo)致的大鼠急性肺損傷的炎性因子有明顯的抑制作用[18]等廣泛的藥理作用。

本研究通過(guò)觀察SD大鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)建立膿毒癥模型。同時(shí)給予不同劑量的紅花黃色素A注射液治療發(fā)現(xiàn)，紅花黃色素A可以改善大鼠膿毒癥時(shí)炎性因子的表達(dá)，明顯降低血清TF、IL-1β、TNF-α表達(dá)水平，使血清TFPI表達(dá)水平升高，符合之前研究[19]。同時(shí)觀察到大鼠膿毒癥發(fā)生ALI/ARDS時(shí)，紅花黃色素治療組大鼠肺組織的損傷較CLP組減輕，符合紅花黃色素A可下調(diào)炎性因子水平的研究，說(shuō)明紅花黃色素可減輕膿毒癥時(shí)炎性因子的促進(jìn)作用，減緩器官功能障礙綜合征的發(fā)生，對(duì)膿毒癥時(shí)的肺損傷有保護(hù)作用，這與紅花黃色素A可以抑制膿毒癥大鼠肺組織的炎性因子和中性粒細(xì)胞增加的作用有明顯關(guān)系。

總之，膿毒癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多變，涉及多臟器，特別是一開始就傷及肺臟，可以引起炎性失控、免疫功能紊亂、凝血障礙等一系列問(wèn)題，本研究結(jié)果說(shuō)明，給予較大劑量紅花黃色素A治療能夠顯著改善膿毒癥大鼠的肺功能，改善氧和指數(shù)，明顯減低促炎因子的表達(dá)，增加抗炎因子的釋放，并且具有保護(hù)大鼠凝血功能[19]、調(diào)節(jié)促炎/抗炎平衡、保護(hù)肺功能，故可以考慮在膿毒癥早期有凝血功能障礙及ALI/ARDS時(shí)選擇使用。