李 琦,朱文慧,姜云鵬,趙林果

(南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京210037)

β-木糖苷酶的主要功能是與內(nèi)切木聚糖酶聯(lián)用降解木聚糖,木聚糖水解產(chǎn)物木糖可被繼續(xù)開(kāi)發(fā)成燃料、食品和飼料等行業(yè)中的系列化學(xué)品[1-3]。此外,β-木糖苷酶也被應(yīng)用于帶有木糖基的林源天然活性物質(zhì)(如三七皂苷R1、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等)的生物轉(zhuǎn)化中,進(jìn)而獲得活性更強(qiáng)的天然產(chǎn)物衍生物[4-6]。近年來(lái),研究人員就β-木糖苷酶的篩選、基因克隆和異源表達(dá)等方面進(jìn)行了深入的研究[7-8]。然而,現(xiàn)有的β-木糖苷酶仍存在著表達(dá)量低、穩(wěn)定性弱、底物特異性差等缺點(diǎn),遠(yuǎn)不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。筆者在前期的研究中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來(lái)源于嗜熱網(wǎng)球菌(Dictyoglomusthermophilum),糖苷水解酶39家族β-木糖苷酶(Xln-DT),并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),其在木二糖、三七皂苷R1和黃芪甲苷中顯示出極好的水解效率[9]。然而,Xln-DT在大腸桿菌中的起始表達(dá)量低,且因?yàn)椴徽_的折疊而聚集形成了大量的包涵體,嚴(yán)重制約了其后續(xù)在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。共表達(dá)分子伴侶蛋白和折疊酶,可以在一定程度上減少包涵體的形成、增加異源蛋白的可溶性表達(dá)。李軻等[10]利用分子伴侶蛋白質(zhì)粒pGro7與核糖核酸外切酶R共表達(dá),使蛋白表達(dá)量提高了43.08%。鄧通等[11]利用分子伴侶蛋白質(zhì)粒pGro7和醇脫氫酶CbADH共表達(dá),使CbADH的可溶性表達(dá)量提高了8.07倍。Bu等[12]利用分子伴侶蛋白質(zhì)粒pG-KJE6與木酮糖激酶共表達(dá),使木酮糖激酶可溶性表達(dá)量增加了8～77倍?；谇叭搜芯拷Y(jié)果,擬通過(guò)Xln-DT和分子伴侶蛋白共表達(dá)的方式提高其在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量,筆者通過(guò)分子克隆構(gòu)建帶有目的基因xln-DT的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-xln-DT,將6種分子伴侶質(zhì)粒pKJE6、pKJE7、pG-KJE8、pGro7、pG-Tf2、pTf16與pET-28a-xln-DT共表達(dá),并通過(guò)表達(dá)條件優(yōu)化提高Xln-DT在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)量,然后將Xln-DT與內(nèi)切木聚糖酶(XynB-DT)雙酶聯(lián)用酶解木聚糖,以期為該酶的進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

1.1.1菌株、質(zhì)粒與載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)Top10F’和BL21(DE3);源于嗜熱網(wǎng)球菌(D.thermophilum)的β-木糖苷酶基因xln-DT重組表達(dá)質(zhì)粒pET-20b-xln-DT;內(nèi)切木聚糖酶XynB-DT,均由南京林業(yè)大學(xué)微生物技術(shù)研究室提供。表達(dá)載體質(zhì)粒pET-20b、pET-28a、pET-32a和pACY-Duet-1均購(gòu)自美國(guó)Novagen公司;分子伴侶蛋白質(zhì)粒pKJE6、pKJE7、pG-KJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16,購(gòu)自日本TaKaRa公司。質(zhì)粒具體信息如表1所示。

表1 表達(dá)載體及分子伴侶蛋白質(zhì)粒信息Table 1 Expression vector and chaperone protein information

1.1.2試劑Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶、DL 10 000 DNA Marker和DNA限制性內(nèi)切酶(BamHI、XhoI、NotI和MscI),日本TaKaRa公司;分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Marker),美國(guó)Promega公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、氨芐、卡那霉素、四環(huán)素氯霉素,美國(guó)Axygen公司;胰蛋白胨、酵母提取物,英國(guó)Oxoid公司;麥芽糊精、糊精、花生粉餅、黃豆粉餅,市售;對(duì)硝基苯基-β-L-木糖苷(pNPX)、櫸木木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖,美國(guó)Sigma公司;玉米芯木聚糖、甘蔗渣木聚糖為實(shí)驗(yàn)室自制[13];其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物合成及測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.3培養(yǎng)基盧里亞·貝爾塔尼(LB)培養(yǎng)基:1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蛋白胨、0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母提取物、1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl,溶解于蒸餾水中,121℃滅菌20 min。LB培養(yǎng)基主要用于大腸桿菌菌株的活化及重組基因工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)。

Terrific-Broth(TB)培養(yǎng)基:A液為2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))麥芽糊精、1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蛋白胨、2.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))酵母提取物,溶解于蒸餾水中;B液為17 mmol/L磷酸二氫鉀、72 mmo/L磷酸氫二鉀(溶劑均為蒸餾水);A液與B液體積比為9∶1。TB培養(yǎng)基主要用于重組基因工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)。

1.1.4儀器SX-500全自動(dòng)高溫高壓蒸汽滅菌鍋;Verti梯度PCR儀,美國(guó)ABI公司;5415R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng),美國(guó)Bio-rad公司;ZHWY-2102C搖床;JY98-IIIN超聲波細(xì)胞破碎儀,寧波新芝公司;SpectraMax190全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular Devices公司;EPS600電泳儀,上海天能科技有限公司。

1.2 菌株的重組

1.2.1原核表達(dá)菌株的構(gòu)建以pET-20b-xln-DT為模板,設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,具體酶切位點(diǎn)如下:1)pET-28a(BamHI和XhoI);2)pET-32a(MscI和XhoI);3)pACY-Duet-1(BamHI和NotI)。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙酶切,產(chǎn)物濃縮后分別與表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a、pET-32a和pACYDuet-1連接,篩選帶有正確目的基因的陽(yáng)性克隆;提取質(zhì)粒,進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,獲得重組質(zhì)粒pET-28axln-DT、pET-32a-xln-DT和pACY-Duet-1-xln-DT;將重組質(zhì)粒pET-20b-xln-DT、pET-28a-xln-DT、pET-32axln-DT和pACY-Duet-1-xln-DT轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,得到上述4種重組表達(dá)菌株。分別挑取4種重組表達(dá)菌株的單菌落置于含有Kana和Amp抗性的5 mL的LB培養(yǎng)基中,在溫度37℃,轉(zhuǎn)速180 r/min下恒溫培養(yǎng)至600 nm下光密度(OD600)值為0.8,加入終濃度為0.01 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(ITPG),設(shè)定溫度為28℃下誘導(dǎo)表達(dá)10 h,離心收集菌體。將離心后的菌體用pH值7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol/L)重懸,重懸后的菌液置于冰水混合物中進(jìn)行超聲波破碎直至菌液澄清。將破碎后的菌液在4℃、10 000 r/min下離心10 min,上清液即為胞內(nèi)酶液,用于酶活測(cè)定。

1.2.2分子伴侶蛋白質(zhì)粒篩選及SDS-PAGE分析 分別將6種分子伴侶蛋白質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pET-28a-xln-DT混合后轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,利用表1中對(duì)應(yīng)的LB抗性平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子篩選。分別挑取6種共表達(dá)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(pKJE6+pET-28a-xln-DT、pKJE7+pET-28a-xln-DT、pG-KJE8+pET-28a-xln-DT、pGro7+pET-28a-xln-DT、pG-Tf2+pET-28a-xln-DT和pTf16+pET-28a-xln-DT)于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8,加入0.01 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌液,離心后的沉淀用1 mL的20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液重懸。重懸液體利用超聲波破碎,破碎后的樣品(全細(xì)胞樣品)經(jīng)離心后的上清液為上清液樣品、沉淀為變性蛋白樣品。分別測(cè)定各共表達(dá)體系的上清液樣品中β-木糖苷酶的酶活,并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)按照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南中的步驟進(jìn)行,從而篩選出能提高目的蛋白表達(dá)的分子伴侶蛋白質(zhì)粒。

1.2.3重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)挑取pET-28a-Xln-DT的單菌落置于含有Kana抗性的5 mL的LB培養(yǎng)基中,在溫度37℃,轉(zhuǎn)速180 r/min下恒溫培養(yǎng)10 h以作為種子液。將篩選所得的共表達(dá)菌株接種至30 mL TB培養(yǎng)基中,于37℃搖床中培養(yǎng),并對(duì)培養(yǎng)基的碳源、氮源及表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。

分別接種等量表達(dá)后的pET-28a-Xln-DT種子液至30 mL含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的不同碳源(麥芽糊精、糊精、葡萄糖、甘油、玉米淀粉)和氮源(蛋白胨、花生餅粉、黃豆餅粉)的TB培養(yǎng)基中,保持其他培養(yǎng)條件一致,表達(dá)后的菌體經(jīng)重懸、破碎、離心后取上清液進(jìn)行酶活分析,從而篩選出TB培養(yǎng)基的最佳碳氮源。

對(duì)IPTG濃度(0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100和0.200 mmol/L)、溫度(20、28、32、37和42℃)、四環(huán)素質(zhì)量濃度(0、1、3、5、7和10μg/L)、L-阿拉伯糖質(zhì)量濃度(0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0、3.5和4.0 g/L)和誘導(dǎo)時(shí)間(24、30、36、48、54、60、72和78 h)進(jìn)行優(yōu)化,每次固定一個(gè)變量,重組菌的培養(yǎng)及酶活測(cè)定方法同1.2.1節(jié)。

1.2.4酶活測(cè)定以pNPX(20 mmol/L)為底物,加入上清酶液酶解10 min,以1 mol/L的碳酸鈉終止反應(yīng),并測(cè)定405 nm下產(chǎn)物的吸光度,以不加酶液的反應(yīng)體系為空白對(duì)照。β-木糖苷酶的酶活測(cè)定步驟及酶活的定義參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

1.3 協(xié)同酶解木聚糖

分別以2 g/L的櫸木木聚糖、樺木木聚糖、玉米芯木聚糖、燕麥木聚糖和甘蔗渣木聚糖為底物,添加500 U/g的內(nèi)切木聚糖酶XynB-DT,在80℃、pH值6.0下反應(yīng)18 h,繼而加入500 U/g的β-木糖苷酶Xln-DT繼續(xù)反應(yīng)4 h。此外,探討了雙酶協(xié)同酶解木聚糖的模式:1)XynB-DT;2)XynB-DT+Xln-DT;3)Xln-DT。分別按照3種模式酶解木聚糖后,通過(guò)離子色譜進(jìn)行酶解產(chǎn)物含量計(jì)算和分析。雙酶酶解木聚糖的協(xié)同度計(jì)算如下:協(xié)同度=雙酶酶解木聚糖所得木糖質(zhì)量濃度/(XynB-DT單獨(dú)酶解木聚糖所得木糖質(zhì)量濃度+Xln-DT單獨(dú)酶解木聚糖所得木糖質(zhì)量濃度)。

1.4 產(chǎn)物檢測(cè)及計(jì)算

木聚糖水解產(chǎn)物低聚木糖的測(cè)定選用Dionex ICS-5000型高效離子色譜,色譜柱為CarboPacTM PA200,檢測(cè)器為標(biāo)準(zhǔn)四電位脈沖安培檢測(cè)器,流動(dòng)相、流動(dòng)相梯度洗脫程序、流速、溫度等條件參考文獻(xiàn)[14]。木糖測(cè)定選用安捷倫1260高效液相色譜,色譜柱為Aminex Bio-Rad HPX-87H,檢測(cè)器為示差檢測(cè)器,流動(dòng)相、流動(dòng)相梯度洗脫程序、流速、溫度等條件參考文獻(xiàn)[14]。按式(1)和(2)計(jì)算酶解率和低聚木糖得率,其中,X2～X6分別為木二糖、木三糖、木四糖、木五糖和木六糖質(zhì)量濃度,g/L,水解液總糖質(zhì)量濃度為由HPLC測(cè)定的木糖質(zhì)量濃度和低聚木糖質(zhì)量濃度的總和,木聚糖質(zhì)量濃度為2 g/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)

4種重組表達(dá)質(zhì)粒pET-20b-xln-DT、pET-28axln-DT、pET-32a-xln-DT和pACY-Duet-1-xln-DT經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,4種不同的重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后均獲得1 000～2 000 bp之間的DNA片段(圖1),與基因片段xln-DT大小一致,說(shuō)明重組子含有β-木糖苷酶xln-DT基因。將4種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),pET-20b-Xln-DT、pET-28a-Xln-DT、pET-32a-Xln-DT和pACY-Duet-1-Xln-DT誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果分別為0.68、1.02、0.36和0.34 U/mL,pET-28a-Xln-DT的表達(dá)量顯著高于其他3種。

圖1 4種重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.1 Double enzyme digestion verification electrophoresis of four recombinant expression plasmids

以pET-28a-Xln-DT作為出發(fā)菌株,通過(guò)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后,進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,pET-28a-Xln-DT上清液的蛋白表達(dá)量較低,在55 ku左右的位置有蛋白條帶,沉淀中存在大量的變性蛋白,說(shuō)明該酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)較差,極大程度影響了β-木糖苷酶Xln-DT的實(shí)際應(yīng)用。

圖2 pET-28a-Xln-DT的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE analysis of pet-28a-Xln-DT

2.2 不同分子伴侶蛋白對(duì)Xln-DT可溶性表達(dá)的影響

Laskey等[15]在非洲爪蟾卵的浸出液中發(fā)現(xiàn)了分子伴侶蛋白,其可以協(xié)助和參與生物大分子的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解等過(guò)程,從而極大程度提高目的蛋白的可溶性表達(dá)。將重組質(zhì)粒pET-28a-xln-DT分別與6種分子伴侶蛋白質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行共表達(dá),未添加分子伴侶質(zhì)粒的原酶表達(dá)量為1.02 U/mL,分別添加分子伴侶蛋白質(zhì)粒pKJE6、pKJE7、pG-KJE8、pGro7、pG-Tf2和pTf16后的表達(dá)量分別為0.51、0.66、1.34、0.92、0.77和0.86 U/mL,其中pG-KJE8質(zhì)粒與pET-28a-xln-DT構(gòu)建的共表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)量最高,為原酶初始表達(dá)量的1.31倍。

經(jīng)SDS-PAGE分析可知,除了pTf16以外,其他幾種分子伴侶蛋白質(zhì)粒均能夠提高上清液中Xln-DT的表達(dá)量,即可溶性表達(dá)量有了顯著地提升(圖3)。分析這幾種伴侶蛋白質(zhì)粒所表達(dá)的融合蛋白組合可知,groES-groEL主要協(xié)助部分折疊的蛋白克服動(dòng)力學(xué)障礙,從而正確折疊為其天然形態(tài),免于多肽鏈的錯(cuò)誤聚集。結(jié)合共表達(dá)菌株的可溶性表達(dá)量,選取pET-28a-xln-DT和pG-KJE8雙質(zhì)粒共表達(dá)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 分子伴侶蛋白篩選的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of molecular chaperone protein screening

2.3 共表達(dá)菌株的表達(dá)條件優(yōu)化

以表達(dá)量(酶活)為考察指標(biāo),對(duì)共表達(dá)菌株的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先,將種子液轉(zhuǎn)接至TB培養(yǎng)基中,選用了不同碳源、氮源來(lái)優(yōu)化pET-28a-Xln-DT/pG-KJE8共表達(dá)菌株的表達(dá)量,添加0.01 mmol/L IPTG后調(diào)整溫度至28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h,以麥芽糊精、糊精、葡萄糖、甘油、玉米淀粉、蛋白胨、花生餅粉、LB對(duì)照為碳/氮源時(shí),酶活分別為4.85、4.71、1.29、5.10、4.28、5.63、0.47和1.02 U/mg。經(jīng)比對(duì),TB培養(yǎng)基的最佳碳/氮源為:甘油(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%)/蛋白胨(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%),而葡萄糖作為碳源培養(yǎng)pET-28a-Xln-DT/pG-KJE8時(shí),其表達(dá)量?jī)H為甘油的30%。

選用甘油/蛋白胨為T(mén)B培養(yǎng)基的碳/氮源,以TB培養(yǎng)基,分別優(yōu)化了pET-28a-Xln-DT/pG-KJE8發(fā)酵的誘導(dǎo)劑IPTG濃度、四環(huán)素質(zhì)量濃度、L-阿拉伯糖質(zhì)量濃度和誘導(dǎo)溫度等條件,以酶活最大值為相對(duì)100%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知,IPTG添加量為0.01 mmol/L、四環(huán)素添加量為5μg/L、L-阿拉伯糖質(zhì)量濃度為1.5 g/L、溫度32℃時(shí),β-木糖苷酶Xln-DT的表達(dá)量最高。在優(yōu)化的表達(dá)條件下誘導(dǎo)60 h,酶活最大可達(dá)11.9 U/mL,較相同條件下單質(zhì)粒表達(dá)的原酶(5.29 U/mL)提高了1.25倍,較原酶在LB培養(yǎng)基中的表達(dá)(2.28 U/mL)提高了4.22倍。

圖4 共表達(dá)菌株的表達(dá)條件優(yōu)化Fig.4 Optimization of expression conditions of co-expression strains

2.4 Xln-DT協(xié)同XynB-DT酶解木聚糖

木聚糖作為植物中的主要成分之一,是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖,其主鏈由多聚戊糖通過(guò)β-1,4-木糖苷鍵連接而成,并在側(cè)鏈上攜帶阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、乙?；榷喾N取代基[16-17]。木聚糖的完全水解主要需要內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶,內(nèi)切木聚糖酶將木聚糖水解成低聚木糖后,繼而由β-木糖苷酶繼續(xù)水解成木糖。

筆者經(jīng)過(guò)前期研究,已從嗜熱網(wǎng)球菌中克隆并異源表達(dá)了一個(gè)GH11家族的內(nèi)切木聚糖酶XynB-DT[13],其最適溫度和最適pH值與β-木糖苷酶Xln-DT相近,均為80℃和pH值6.0左右,因此在協(xié)同酶解時(shí)具有極大的優(yōu)勢(shì)(不需要改變酶解條件)。選用櫸木木聚糖、樺木木聚糖、玉米芯木聚糖、燕麥木聚糖和甘蔗渣木聚糖為底物,利用內(nèi)切木聚糖酶XynB-DT和β-木糖苷酶Xln-DT進(jìn)行協(xié)同酶解,酶解反應(yīng)條件及協(xié)同度、低聚木糖(XOS)得率和酶解率見(jiàn)表2。

表2 內(nèi)切木聚糖酶XynB-DT和β-木糖苷酶Xln-DT對(duì)木聚糖協(xié)同水解的結(jié)果Table 2 The results of synergistic hydrolysis of xylan by endoxylanase XynB-DT andβ-xylosidase Xln-DT

在僅添加X(jué)ynB-DT時(shí),5種木聚糖的酶解產(chǎn)物含有較多的木二糖和木三糖,含有少量的木糖,低聚木糖(XOS)得率分別為44.7%(櫸木木聚糖)、38.7%(樺木木聚糖)、34.5%(玉米芯木聚糖)、27.2%(燕麥木聚糖)和16.2%(甘蔗渣木聚糖);在添加X(jué)ln-DT后,5種木聚糖的XOS得率有所提高,分別為55.2%、61.5%、53.3%、52.9%和46.2%,說(shuō)明β-木糖苷酶Xln-DT添加后,將XOS繼續(xù)水解成木糖(木糖質(zhì)量濃度分別為583.4、573.2、526.5、487.7和369.5 mg/L)。Xln-DT的添加解除了XOS對(duì)內(nèi)切木聚糖酶的抑制,使得木聚糖可以持續(xù)水解生成XOS。此外,添加X(jué)ln-DT后,5種木聚糖的酶解率分別為84.4%、90.2%、79.6%、77.3%和64.7%,相較于XynB-DT的酶解率(51.9%、45.9%、42.6%、32.9%和17.2%)有了顯著地提高。通過(guò)計(jì)算可知,雙酶酶解木聚糖的協(xié)同度分別為2.67、2.63、2.23、2.62和3.97,均高于Azelee等[1]和Yang等[18]報(bào)道的1.03和1.01,進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了XynB-DT和Xln-DT的協(xié)同酶解的促進(jìn)作用。

3 結(jié) 論

3.1以來(lái)源于嗜熱網(wǎng)球菌的β-木糖苷酶Xln-DT為研究對(duì)象,通過(guò)大腸桿菌表達(dá)載體篩選、分子伴侶蛋白共表達(dá)、表達(dá)條件優(yōu)化等手段,提高Xln-DT的可溶性表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:以pET-28a作為載體與xln-DT構(gòu)建的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)量最高,引入分子伴侶蛋白質(zhì)粒pG-KJE8與pET-28a-xln-DT在大腸桿菌中共表達(dá),明顯提高了Xln-DT的可溶性表達(dá)量。優(yōu)化了共表達(dá)菌株pET-28a-Xln-DT/pG-KJE8的表達(dá)條件,以TB培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,碳源、氮源分別為甘油和蛋白胨,添加0.01 mmol/L IPTG、5μg/L四環(huán)素、1.5 g/LL-阿拉伯糖,32℃下誘導(dǎo)60 h,酶活可達(dá)11.9 U/mL,較原酶在LB培養(yǎng)基中的表達(dá)提高了4.22倍。

3.2利用內(nèi)切木聚糖酶XynB-DT和β-木糖苷酶Xln-DT進(jìn)行協(xié)同酶解,添加X(jué)ln-DT后,櫸木木聚糖、樺木木聚糖、玉米芯木聚糖、燕麥木聚糖和甘蔗渣木聚糖的酶解率分別為84.4%、90.2%、79.6%、77.3%和64.7%,相較于單酶XynB-DT的酶解率有了顯著地提高,說(shuō)明耐熱內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶在酶解木聚糖生產(chǎn)低聚木糖和木糖上具有良好的應(yīng)用前景,延長(zhǎng)了林源植物纖維原料加工的產(chǎn)業(yè)鏈。