張 可，紀皓楠，柴 河，姜立鑫，趙 曼，佟 彬，郭 峰，吳宏軍，劉愛榮，王雅春*，張 毅*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，北京 100193；2.海拉爾農(nóng)牧場管理局謝爾塔拉農(nóng)牧場，內(nèi)蒙古呼倫貝爾 021012；3.內(nèi)蒙古大學生命科學學院，省部共建草原家畜生殖調(diào)控與繁育國家重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010071；4.內(nèi)蒙古通遼市畜牧業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古通遼 028000）

三河牛是我國自主培育的乳肉兼用牛品種，起源于內(nèi)蒙古呼倫貝爾額爾古納右旗的三河地區(qū)（根河、哈烏爾河、得勒布爾河）及呼倫貝爾市境內(nèi)濱州鐵路沿線一帶。自品種育成以來，三河牛一直保持品系選育的育種方法[1]，除了高產(chǎn)奶系和高產(chǎn)肉系，還選育形成一個無角品系，在當?shù)厮追Q“禿頭系”，具有爭斗少、易管理的優(yōu)點。

目前已報道的牛無角基因主要有3 個獨立的來源：安格斯牛、西門塔爾牛等肉牛和兼用牛品種中的凱爾特無角基因（Celtic），荷斯坦牛、娟珊牛等奶牛品種中的弗里生無角基因（Friesian），在蒙古國的牛和牦牛中發(fā)現(xiàn)的蒙古牛無角基因（Mongolian）[2]。這些無角基因均定位于牛1 號染色體起始區(qū)域，但突變類型各不相同[3]。凱爾特無角基因是一段長度為212 bp 的重復(fù)，代替了長度為10 bp 的原序列，即P202ID位點[4]；弗里生無角基因源于一個長度80 kb 片段的重復(fù)，即P80kbID位點[4]；蒙古牛無角基因則是一個長度219 bp 的重復(fù)片段的插入，即P219ID位點[5]。此外，最近在南美洲的尼爾洛牛（Nellore）中新發(fā)現(xiàn)一個瘤牛特異的無角基因，序列特征為一個110 kb 片段的重復(fù)[6]。

牛的無角性狀屬于常染色體顯性遺傳[7]，因此攜帶任何一種無角基因均呈現(xiàn)無角。三河牛的培育過程經(jīng)歷了多品種雜交，含有本地牛、西門塔爾牛、西伯利亞牛、俄羅斯改良牛、后貝加爾土種牛等眾多品種的血緣[1]，目前關(guān)于三河牛無角基因的具體來源尚不清楚。因此，本研究通過對三河牛和蒙古牛的無角基因進行分子檢測，探究三河牛無角基因的來源，從而為三河牛無角品系的高效選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本及其基因組DNA 的提取 從內(nèi)蒙古謝爾塔拉農(nóng)牧場選擇三河牛無角品系公牛3 頭，有角公牛4 頭（圖1），收集冷凍精液樣本。在內(nèi)蒙古阿拉善盟阿拉善左旗采集21 頭蒙古牛的血液樣本。利用試劑盒（基因組DNA 提取試劑盒DP304，北京天根生化科技有限公司）提取血液樣本DNA；利用高鹽法[3]提取牛凍精基因組DNA。利用Thermo Scientific NanoDrop 2000 檢測基因組DNA 質(zhì)量和濃度，剔除經(jīng)檢測不合格的樣本1 個。此外，選擇基因型已知的無角西門塔爾牛（Celtic 無角基因）和無角荷斯坦牛（Friesian 無角基因）各1 頭為對照[3]。

圖1 無角三河牛和有角三河牛

1.2 引物合成與PCR 擴增及瓊脂糖凝膠電泳

1.2.1 引物合成 檢測3 種無角基因的特異性引物序列來自文獻報道（表1），由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 3 種無角基因分子檢測PCR 引物信息

1.2.2 目標序列擴增與凝膠電泳 PCR 反應(yīng)體系總體積20 μL，其 中10×Buffer 2 μL，dNTP 混合物（各2.5 mmol/L）1.6 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.15 μL，上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，基因組DNA 模板1 μL（約50 ng），ddH2O 14.25 μL 補齊剩余體積。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性8 min；然后35 個循環(huán)，95℃變性30 s，在引物對應(yīng)的退火溫度下復(fù)性30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。

制作濃度為2%的瓊脂糖凝膠，取PCR 產(chǎn)物4 μL點樣，在TAE 緩沖液中110 V 電壓下電泳20 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。各樣本編號對應(yīng)牛只信息如表2 所示。

表2 29 個樣本3 種無角基因的分子檢測結(jié)果

1.3 PCR 產(chǎn)物測序驗證 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖電泳條帶經(jīng)切膠回收后進行測序。使用Chromas 軟件查看測序結(jié)果，使用ContigExpress 軟件拼接和校對正反向測序序列，使用MEGA-X 軟件（https://megasoftware.net）進行個體間序列對比。對蒙古牛無角基因輔以克隆測序進行驗證。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢測結(jié)果 由圖2 可知，蒙古牛無角基因位點（P219ID）檢測結(jié)果中長度為895 bp的條帶對應(yīng)野生型，長度為1 112 bp 的單條帶對應(yīng)無角基因，雙條帶對應(yīng)無角雜合子（圖2A）。根據(jù)電泳條帶可以得知，樣本中2 頭無角蒙古牛（M1 和M2）的基因型為P219ID位點雜合子；3 頭無角三河牛中，有2頭（301 和83245）的基因型為P219ID雜合子，1 頭（15233）為P219ID純合子，所有有角個體的基因型都屬于野生型。另外，所有蒙古牛和三河牛樣本均沒有檢出歐洲牛特有的凱爾特無角基因（P202ID位點）以及弗里生無角基因（P80kbID位點）（圖2B、2C）。

圖2 3 種無角基因的PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2 驗證實驗結(jié)果 為了驗證PCR 產(chǎn)物凝膠電泳分型的準確性，對P219ID位點電泳產(chǎn)物中來自無角個體的條帶進行切膠回收和Sanger 測序，長度為1 112 bp 的條帶配合使用克隆測序，雜合個體的兩條帶均進行測序。

測序結(jié)果顯示，P219ID位點無角等位基因相對于野生型原序列是一種復(fù)雜的突變，有3 處變異：1）原序列（219 bp，基因組位置Chr1:1 976 128～1 976 345 bp，參考基因組版本Bos_taurus_UMD_3.1.1）下游間隔61 bp 存在1 個新拷貝（219 bp）；2）原序列上游621 bp處有1 個缺失-插入變異（7 bp 序列替換為6 bp 序列）；3）第一個拷貝中相對野生型序列有1 個單堿基突變（C →G）（圖3）。這3 個變異同時出現(xiàn)，故很可能是完全連鎖的。本研究測序發(fā)現(xiàn)，三河牛無角純合子個體（15233）及雜合子個體（301、83245）的1 112 bp條帶（突變型PCR 片段）均檢出了以上2 種特征性突變，蒙古牛無角雜合子個體（M1、M2）的1 112 bp 條帶也呈現(xiàn)了相同的測序結(jié)果，而三河牛與蒙古牛野生型個體及無角雜合子個體的895 bp 條帶（野生型PCR 片段）的測序結(jié)果則均與野生型參考序列相吻合（圖3）。

圖3 蒙古牛類型無角基因突變位點在基因組上的位置與分型引物示意圖及試驗樣本在對應(yīng)位點的測序結(jié)果

3 討 論

牛角作為?？苿游锾赜械纳眢w結(jié)構(gòu)，是長期自然選擇的結(jié)果[8-9]，但在現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖中，牛角成為影響生產(chǎn)安全的因素。目前牛場生產(chǎn)中一般在犢牛時期使用機械或化學方法去角，但這不僅會造成動物的應(yīng)激、影響生長，也不利于動物福利[10-11]。因此，國際上一直在研究培育天然的無角牛品種來擺脫這樣的困境[12-13]。除了常規(guī)育種之外，也有利用基因編輯技術(shù)快速培育無角牛的先例[14]。我國科學家還開展了牦牛無角基因的定位研究[15-16]和無角牦牛品種的選育[17]，并在2019 年培育出無角牦牛品種——阿什旦牦牛。三河牛是我國1983 年正式命名的乳肉兼用牛品種，培育過程是以內(nèi)蒙古額爾古納右旗三河地區(qū)的蒙古牛為主要母本，以西門塔爾牛、西伯利亞牛、俄國改良牛等外來品種為父本經(jīng)長期雜交和選育而成。三河牛毛色以紅白花為主，體質(zhì)結(jié)實勻稱，頭部清秀，蹄質(zhì)堅實，產(chǎn)奶量和乳脂率、乳蛋白率較高且產(chǎn)肉性能優(yōu)良；另外，三河牛還具有優(yōu)良的適應(yīng)性和抗病能力、較高的繁殖率[1]。當前三河牛飼養(yǎng)中仍然主要使用人工去角，但本研究結(jié)果有望加快其無角品系的培育，使三河牛具備更加突出的優(yōu)勢。

蒙古牛無角基因最早由Medugorac 等[5]通過基因組測序在蒙古國當?shù)嘏＃∕ongolian Turano cattle）上發(fā)現(xiàn)，谷明娟等[18]在我國北方的無角蒙古牛中也檢測到這一基因類型。該位點無角基因在我國的部分培育牛品種中也有報道，如云嶺牛[19]、蜀宣花牛[20]，但在這些品種中，蒙古牛無角基因頻率很低，而凱爾特（Celtic）無角基因更為常見。本研究發(fā)現(xiàn)三河牛的無角基因與蒙古牛的無角基因序列相同，都屬于Mongolian 無角基因類型（P219ID）。結(jié)合三河牛的育種過程可知，三河牛的無角基因來源于蒙古牛。顏澤等[3]采用整合競爭性等位基因特異性PCR（Kompetitive Allele-Specific PCR,KASP）技術(shù)對1 頭三河牛無角個體的無角基因類型進行了檢測，結(jié)果與本研究相符。同時，電泳分型結(jié)果與測序結(jié)果的一致性也驗證了基于PCR 技術(shù)的蒙古牛無角基因分子檢測方法的準確性。

本研究鑒定了1 頭三河牛無角純合種公牛，由于目前仍保存了該公牛一定數(shù)量的冷凍精液，相比于利用年限較短的母畜，這一無角純合種公牛個體凍精的有效使用更加有利于無角三河牛群體的擴大[21]。由于無角是顯性遺傳，使用無角純合子公牛配種，后代都攜帶無角基因，表型全部為無角，因此在未來較長一段時間內(nèi)可以繼續(xù)利用其凍精進行三河牛無角品系的培育。生產(chǎn)中天然的無角性狀屬于有利性狀，但三河牛的育種目標始終是提升其綜合性能，不能顧此失彼，因此在利用分子技術(shù)手段準確篩選無角基因的同時，需要對重要經(jīng)濟性狀不斷進行選育；與此同時，通過豐富種公牛血緣從而避免近交，才能最終獲得性能優(yōu)異且天然無角的優(yōu)良三河牛品系。

4 結(jié) 論

本研究通過分子檢測方法鑒定了三河牛無角性狀的基因型，證明其無角基因來源于蒙古牛，豐富了對我國牛品種遺傳資源特色性狀的認識，也為選育我國無角牛品種提供了技術(shù)支撐。