唐曉婷，熊敏琪，2，崔金剛，2，王培偉，2，杜霄燁，2，陳 瑜，2，張 騰，2

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；2.上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所，上海 200437)

腸道是人體最大的內(nèi)分泌神經(jīng)激素網(wǎng)絡(luò)，腸道菌群在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腸道菌群參與許多必要和有益的生理過(guò)程，如大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和一些維生素的合成，微生物群落結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化與多種疾病狀態(tài)相關(guān)[1]。目前研究表明腸道菌群失調(diào)與高血壓密切相關(guān)，這是因?yàn)槟c道菌群與內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)進(jìn)行通信，以調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)平衡，包括血壓[2-3]。腸道菌群失調(diào)還可以誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)[4]，而輕度的慢性炎癥可以促進(jìn)高血壓的發(fā)展[5-6]。菌群代謝產(chǎn)物如短鏈脂肪酸能介導(dǎo)與宿主的相互作用，可以影響腸道健康以及免疫系統(tǒng)、血管系統(tǒng)和心臟[7]。本課題組前期臨床觀察結(jié)果表明，清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方可以顯著降低高血壓前期患者收縮壓及舒張壓，在顯著改善24 h動(dòng)態(tài)血壓相關(guān)參數(shù)的同時(shí)，還可以有效降低患者的收縮壓負(fù)荷及舒張壓負(fù)荷[8]。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明，清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方具有顯著的降壓效果，對(duì)高血壓相關(guān)腸道屏障功能失調(diào)具有干預(yù)效應(yīng)[9-10]。因此本實(shí)驗(yàn)以腸道菌群為切入點(diǎn)，研究清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方對(duì)高血壓狀態(tài)下腸道菌群失調(diào)的干預(yù)作用，旨在為清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方干預(yù)高血壓及高血壓相關(guān)病理過(guò)程的效應(yīng)機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡WKY雄性大鼠6只、自發(fā)性高血壓(SHR)雄性大鼠12只，均為SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)室溫度(23±2)℃，濕度40%～70%，光照周期為12 h光照/12 h黑夜，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.2藥物與試劑 清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方由川芎15 g、益母草30 g、桑寄生15 g、柴胡15 g、黃連6 g、川牛膝15 g、羌活15 g、防風(fēng)15 g、黃精15 g、炒黃芩15 g、石決明30 g、夏枯草30 g組成，各藥材購(gòu)于上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆Ｒ?guī)煎煮。QIAamp糞便DNA抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司。

1.3主要儀器 Agilent6890N 氣相色譜儀 HP-INNOWax，美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)；PCR定量測(cè)試儀(Mastercycler pro)，德國(guó)Eppendorf 公司生產(chǎn)。

1.4動(dòng)物分組與干預(yù) 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，先將動(dòng)物按體重由大到小依次編號(hào)，然后從隨機(jī)數(shù)字表上抄錄隨機(jī)數(shù)字，用完全隨機(jī)方法將SHR大鼠分為模型組、清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方組各6只，將6只同周齡WKY雄性大鼠設(shè)為正常組。清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方給藥劑量按照人體劑量的6.3倍換算(川芎1.35 g/kg、1.35 g/kg、黃連0.54 g/kg、羌活1.35 g/kg、防風(fēng)1.35 g/kg、夏枯草2.70 g/kg、川牛膝1.35 g/kg、黃精1.35 g/kg、石決明2.70 g/kg、炒黃芩1.35 g/kg、桑寄生1.35 g/kg、益母草2.70 g/kg)制備濃縮液。從6周齡開始，清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方組給予清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方濃縮液2 mL灌胃，正常組和模型組給予等體積純凈水灌胃，均1次/d，持續(xù)至20周齡。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1糞便16s rDNA測(cè)序 20周齡時(shí)，將各組大鼠置于代謝籠中12 h，次日采集糞便，存放于-80 ℃冰箱，糞便進(jìn)行DNA抽提，運(yùn)送至上海伯豪生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16s rDNA測(cè)序，觀察糞便中菌群多樣性和豐度變化，其中Chao和Ace指數(shù)用于計(jì)算菌群豐度，Simpson和Shannon指數(shù)用于計(jì)算菌群多樣性。

1.5.2糞便短鏈脂肪酸檢測(cè) 取大鼠糞便2.0 g，放置于15 mL的離心管中，用10 mL純水溶解，振蕩2 min，用大于10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，過(guò)濾(0.45 μm)后裝入15 mL離心管內(nèi)。取2 mL制備好的樣品，放置于15 mL離心管中，加入0.2 mL硫酸溶液(濃度50%)，再加入2.0 mL乙醚，振蕩30次后離心，轉(zhuǎn)速大于10 000 r/min離心5 min，置4 ℃冰箱內(nèi)放置30 min，取上層乙醚溶液進(jìn)行氣相色譜分析。采用HP-INNOWax 彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；色譜柱溫度程序：100 ℃(1 min)5 ℃/min→150 ℃(5 min)；載氣：高純氮?dú)?，純度?9.999%；載氣流速2 mL/min；進(jìn)樣口溫度270 ℃；無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量2.0 μL；檢測(cè)器溫度(FID)280 ℃，檢測(cè)乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腸道菌群多樣性及豐度比較 模型組的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)均顯著低于正常組(P均<0.05)；清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方組Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)均顯著高于模型組(P均<0.05)，Simpson指數(shù)顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 正常組和自發(fā)性高血壓各組大鼠糞便16s rDNA測(cè)序Ace、Chao、Shannon、Simpson指數(shù)比較

2.2各組大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度比較 基于Unifrac的PCoA分析顯示，無(wú)論是考慮序列豐度的基于權(quán)重的方法(Weighted Unifrac)還是不考慮序列豐度的方法(Unweighted Unifrac)，均顯示3組的菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一定的差異性，見圖1及圖2。模型組的變形菌門及變形菌綱相對(duì)豐度均顯著高于正常組(P均<0.05)，雙歧桿菌目及雙歧桿菌屬相對(duì)豐度均顯著低于正常組(P均<0.05)；清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方組變形菌門及變形菌綱相對(duì)豐度均顯著低于模型組(P均<0.05)，雙歧桿菌目及雙歧桿菌屬相對(duì)豐度均顯著高于模型組(P均<0.05)，見圖3。

圖1 正常組和自發(fā)性高血壓各組大鼠大鼠腸道菌群考慮序列豐度的基于權(quán)重的Weighted Unifrac PCoA分析

圖2 正常組和自發(fā)性高血壓各組大鼠大鼠腸道菌群不考慮序列豐度的Unweighted Unifrac PCoA分析

圖3 正常組和自發(fā)性高血壓各組大鼠腸道菌群的相對(duì)豐度比較

2.3各組大鼠糞便短鏈脂肪酸水平比較 模型組大鼠糞便中乙酸、丙酸、異丁酸相對(duì)水平均顯著低于正常組(P均<0.05)，丁酸、戊酸、異戊酸相對(duì)水平與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方組大鼠糞便中乙酸、丁酸相對(duì)水平均顯著高于模型組(P均<0.05),丙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸相對(duì)水平與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖4。

圖4 正常組和自發(fā)性高血壓各組大鼠糞便中短鏈脂肪酸相對(duì)水平比較

3 討 論

腸道微生物群的平衡是維持腸道免疫和體內(nèi)平衡的關(guān)鍵，這種平衡的破壞可能引起嚴(yán)重的后果。一項(xiàng)對(duì)41個(gè)健康人群、56個(gè)高血壓前期受試者和99個(gè)原發(fā)性高血壓個(gè)體進(jìn)行的全面宏基因組和代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：在高血壓前期和高血壓人群中，腸道微生物豐富度和多樣性顯著降低[11]。多項(xiàng)臨床研究也表明血壓升高與腸道菌群多樣性降低有關(guān)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組大鼠糞便中Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著低于正常組，說(shuō)明高血壓大鼠腸道細(xì)菌的豐富度和均勻度均降低，與既往研究結(jié)果一致；清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方組Ace指數(shù)、Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于模型組，說(shuō)明清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方可在一定程度上改善腸道菌群的豐富度和均勻度。

腸道菌群主要由擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和疣微菌門組成，其中擬桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度大于90%。成熟菌群的組成主要包括擬桿菌門和厚壁菌門；若變形菌門的數(shù)量占主導(dǎo)地位，則標(biāo)志著“不成熟”微生物群落的組成，同時(shí)也是導(dǎo)致腸道炎癥的原因[14]。腸道菌群的不平衡也是由于變形菌門的豐度持續(xù)增加引起的[15]。有研究發(fā)現(xiàn)將老年小鼠的菌群移植給青年小鼠后，變形菌門等有所增加，T細(xì)胞活化，小腸發(fā)生炎癥反應(yīng)[16]。雙歧桿菌是一種革蘭陽(yáng)性厭氧菌，屬于放線菌門，它是第一種定植于人類胃腸道的細(xì)菌，母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道中雙歧桿菌的數(shù)量約占細(xì)菌總數(shù)的90%[17]。雙歧桿菌作為一種益生菌，能抑制小鼠因反復(fù)使用抗生素引起的腸道炎癥[18]。在體外模型中，雙歧桿菌可通過(guò)抑制NF-κB和 p38 MAPK通路，保護(hù)因腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導(dǎo)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的腸上皮細(xì)胞，同時(shí)有效恢復(fù)腸黏膜的屏障功能[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠糞便中變形菌門及變形菌綱相對(duì)豐度均顯著高于正常組，雙歧桿菌目及雙歧桿菌屬相對(duì)豐度均顯著低于正常組；清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方組變形菌門及變形菌綱相對(duì)豐度均顯著低于模型組，雙歧桿菌目及雙歧桿菌屬相對(duì)豐度均顯著高于模型組。提示高血壓使腸道菌群失調(diào)，而腸道菌群組成的變化與腸屏障功能紊亂有關(guān)，清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方干預(yù)高血壓的效應(yīng)可能與降低變形菌豐度、升高雙歧桿菌豐度，增強(qiáng)腸道生物屏障從而抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。

腸道微生物群釋放的代謝產(chǎn)物對(duì)宿主的心血管健康有重要影響。短鏈脂肪酸是腸道內(nèi)細(xì)菌代謝的最終產(chǎn)物，主要來(lái)自于膳食纖維。短鏈脂肪酸能調(diào)控腸上皮細(xì)胞增殖與凋亡的平衡，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞分泌內(nèi)源性抗菌肽，從而維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[20-21]。短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。丁酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，在灌注AngⅡ的小鼠模型中，丁酸能顯著改善腸道滲透性，降低血壓，其與腸道屏障功能和高血壓之間聯(lián)系緊密[22]。體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，丙酸和丁酸可以誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化，抑制炎癥反應(yīng)[23-24]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)高血壓小鼠補(bǔ)充乙酸能顯著降低收縮壓和舒張壓，抑制心肌纖維化和左心室肥厚[25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方干預(yù)能促進(jìn)高血壓大鼠腸道中乙酸及丁酸的產(chǎn)生，從而起到降壓、抑制炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方能下調(diào)高血壓大鼠變形菌門菌群的豐度，促進(jìn)腸道雙歧桿菌的生長(zhǎng)及腸道短鏈脂肪酸乙酸、丁酸的產(chǎn)生，從而改善菌群失調(diào)，維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步明確了清肝益腎祛風(fēng)復(fù)方治療高血壓的機(jī)制。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。