陳丹燕，余欣彤，彭幫貴，王瑜婷，汪 梅，陳江平，魏 梅

(廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

紅參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖[1]，始載于《本草綱目》[2]。具有大補元氣、復脈固脫、益氣攝血的功效，用于體虛欲脫、肢冷脈微、氣不攝血、崩漏下血等癥[1]。紅參的主要產(chǎn)區(qū)為遼寧撫順、吉林靖宇、吉林集安等[3]，化學成分主要有皂苷類、多糖類、生物堿類、多炔類、萜烯類等，其中皂苷類成分為主要活性物質(zhì)[4]?，F(xiàn)代研究表明，人參皂苷Rg1、Re、Rb1具有良好的抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等藥用效果[5-6]，2020版《中國藥典》亦將人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量限度作為紅參的質(zhì)量控制指標。

有文獻[7-9]報道紅參中人參皂苷的提取工藝研究，但其工藝以乙醇回流為主，研究內(nèi)容多以紅參藥材化學成分和質(zhì)量控制為主，未見多指標綜合評價紅參水提工藝的報道。本研究以水為提取溶劑，以浸泡時間、提取次數(shù)、提取時間和加水量為影響因素設計L9(34)正交試驗，結合歸一化法對人參皂苷Rg1、Rb1、Re含量和干膏得率進行數(shù)據(jù)處理，確定干膏得率，人參皂苷Rg1、Rb1、Re含量的權重系數(shù)分別為0.4、0.2、0.2、0.2，計算綜合評分，優(yōu)選出最佳水提工藝，為紅參傳統(tǒng)制劑產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ME204E型萬分之一天平，XP26型百萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(德國Merck公司)；RE-3000型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D(Ш)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；HWS-28型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏試驗設備有限公司)。

1.2 試藥

人參皂苷Rg1(批號為110703-201933，純度為93.4%)，人參皂苷Rb1(批號為110704-202028，純度為93.1%)，人參皂苷Re(批號為110754-201827，純度為93.4%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇為色譜純(德國Merck公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。紅參藥材(批號為G2006008)產(chǎn)地為吉林，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的栽培品經(jīng)蒸制后的干燥根和根莖，樣品存放于廣東一方制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 浸膏粉制備

取紅參飲片12份，每份約100 g，按正交試驗設計進行回流提取，濾過，分別合并每組試驗的水提液，取水提液減壓濃縮至適量，濃縮液置于真空干燥箱內(nèi)烘干，研細，得紅參浸膏粉，稱定重量，備用。

2.2 干膏得率測定

精密吸取紅參水提液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，并轉移至105 ℃烘箱干燥3 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱定重量，計算干膏得率=(M1-M0)V/25m，M1為干膏與蒸發(fā)皿總質(zhì)量，M0為空蒸發(fā)皿總質(zhì)量，V為水提液總體積，m為提取飲片質(zhì)量。

2.3 人參皂苷Rg1、Rb1、Re含量測定

2.3.1 色譜條件[10]色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫，0～35 min時19% A，35～55 min時19% A→29% A，55～70 min時29% A，70～100 min時29% A→40% A；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.2 對照品溶液制備 取人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Re對照品及人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含人參皂苷Rg1405.430 7 μg/mL、人參皂苷Re 310.685 8 μg/mL、人參皂苷Rb1404.985 0 μg/mL的混合對照品貯備液。

2.3.3 供試品溶液制備 取浸膏粉約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加三氯甲烷適量，加熱回流1 h。藥渣揮干溶劑，將藥渣連同濾紙筒一起轉移到具塞錐形瓶中，精密加入水飽和正丁醇50 mL，密塞，放置過夜，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補足重量，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 專屬性考察 分別精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液和供試品溶液、空白溶劑適量，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定。如圖1所示空白溶劑色譜圖中，在人參皂苷Rg1、Re、Rb1的出峰位置無吸收峰；供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應色譜峰，表明該方法專屬性良好。

1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rb1；A.空白溶劑；B.混合對照品溶液；C.供試品溶液。

2.3.5 線性考察 分別精密吸取“2.3.2”項下對照品儲備液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、3.0 mL、5.0 mL、10.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄人參皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面積，以溶液質(zhì)量濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。結果見表1。

表1 線性關系考察結果

2.3.6 精密度考察 精密吸取“2.3.2”項下混合對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為0.99%、0.97%%、0.83%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性考察 取同一浸膏粉適量，按“2.3.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD分別為2.88%、3.65%%、2.52%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.8 穩(wěn)定性考察 取同一浸膏粉適量，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件于制備0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后進樣測定，計算人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1峰面積的RSD分別為2.47%、2.50%、2.93%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。

2.3.9 加樣回收率試驗 取同一干浸膏粉適量，精密稱取9份，每份約0.5 g，分為3組，每組分別按高、中、低濃度精密加入人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1混合對照品溶液。按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率及RSD值。結果人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1的平均加樣回收率為100.79%、96.90%、105.13%，RSD分別為2.20%、2.52%、1.38%(n=9)。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果 (n=9)

2.4 正交試驗

2.4.1 因素水平設計 根據(jù)前期預試驗和相關文獻可知，提取工藝效果一般受到溶媒類型、溶媒用量、提取時間、提取次數(shù)、浸泡時間等因素影響[11-12]。因此，以浸泡時間(A)、加水倍數(shù)(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)為影響因素，按L9(34)正交試驗法進行實驗，以干膏得率、人參皂苷Rg1含量、人參皂苷Re含量、人參皂苷Rb1含量為評價指標，優(yōu)選紅參的水提工藝。因素水平表見表3。

表3 正交試驗因素與水平

2.4.2 數(shù)據(jù)處理 按正交試驗設計，測定各試驗組干膏得率、人參皂苷Rg1含量、人參皂苷Rb1含量、人參皂苷Re含量，采用Hassan法[13]，將每個指標進行歸一化處理，標準化為0～1之間的“歸一值”，歸一化公式如下：對于取值越大越好的指標，歸一值計算公式為：di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)；對于取值越小越好的指標，歸一值計算公式為：di=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)。對各指標歸一化值給予不同的權重系數(shù)，干膏得率作為主指標，權重系數(shù)為0.4，人參皂苷Rg1含量、人參皂苷Rb1含量和人參皂苷Re含量為次指標，權重系數(shù)分別為0.2。綜合評分值(Pj)按以下計算公式計算，綜合評分值(Pj)=0.4×干膏得率+0.2×人參皂苷Rg1含量+0.2×人參皂苷Rb1含量+0.2×人參皂苷Re含量。以綜合評分值對試驗數(shù)據(jù)進行直觀分析和方差分析，試驗結果見表4、表5。

表4 正交試驗結果及直觀分析結果

表5 方差分析結果

2.4.3 結果分析 以綜合評分值為標準，由表5可知，影響紅參水提工藝的主次順序為D(提取次數(shù))>C(提取時間)>A(浸泡時間)>B(加水倍數(shù))，以極差最小的B因素為誤差列，對各因素進行方差分析。提取次數(shù)對試驗結果具有顯著性影響(P<0.05)，浸泡時間、加水倍數(shù)、提取時間對試驗結果沒有顯著性影響(P>0.05)。主要影響因素D選擇最佳的水平。從離差平方和可知，浸泡時間、加水倍數(shù)對試驗結果的貢獻率較低。從降低生產(chǎn)成本和提高生產(chǎn)效率兩方面考慮，確定紅參最佳水提工藝為A1B1C1D3，即加8倍量水，浸泡30 min，提取3次，每次0.5 h。

2.5 驗證試驗

根據(jù)優(yōu)選出來的紅參水提工藝參數(shù)A1B1C1D3，稱取3份紅參飲片，每份約100 g，進行3份平行驗證試驗，結果見表6。結果表明，驗證試驗的干膏得率、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1含量的均值分別為56.47%、0.197 7%、0.104 5%、0.202 5%，RSD分別為1.92%、1.63%、2.01%、1.05%。各指標的提取效果均較好，優(yōu)選的紅參水提工藝穩(wěn)定、簡單、可行。

表6 驗證試驗結果 (n=3)

3 討論

中藥含有多種化學成分，具有多組分、多靶點、多環(huán)節(jié)的特點，不同功效有其不同的物質(zhì)基礎，單獨一個藥效成分并不能代表該味中藥的整體療效[14]。綜合評分法運用數(shù)學知識對一個復雜系統(tǒng)中的多個評價指標信息進行加工處理，從而對其優(yōu)劣程度進行評價[15]。本研究采用的多指標綜合評分方法為加權評分法，根據(jù)評價指標對試驗結果的影響程度賦予不同的權重系數(shù)，既保證了試驗結果的全面性，又對重要的評價指標有相應的側重，使得試驗結果更加科學。為了更好地優(yōu)選紅參的水提工藝，選取干膏得率和人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量作為評價指標，使得試驗結果更加科學全面。文獻[16]研究表明，紅參中還含有揮發(fā)油、多糖類等化學成分，本研究將人參皂苷Rg1、Re、Rb1含量作為優(yōu)選紅參水提工藝的評價指標稍顯不足。在后續(xù)試驗中，將對紅參的揮發(fā)油類、多糖類化學成分進行研究，充分結合紅參的化學成分來優(yōu)化其水提工藝。