劉長風， 張曉宇， 王 椰， 段士鑫， 范文玉， 王 黎

(1.沈陽化工大學 環(huán)境與安全工程學院， 遼寧 沈陽 110142；2.武漢科技大學 資源與環(huán)境工程學院， 湖北 武漢 430081)

甲烷氧化細菌是可以以甲烷為唯一碳源和能源，通過生長代謝將甲烷氧化為二氧化碳的特殊革蘭氏陰性菌，在環(huán)境中分布廣泛[1-4].甲烷作為清潔能源的同時，也是引起全球氣候變暖的主要溫室氣體之一.根據(jù)2015～2019年《中國生態(tài)環(huán)境狀況公報》，我國全年平均氣溫日益升高，2009～2019年大氣中甲烷的年平均絕對增量為5.5 μg/m3.甲烷作為僅次于二氧化碳的溫室氣體[5]，單分子增溫勢大約為二氧化碳的20～30倍，因此控制大氣中甲烷的含量能有效緩解全球氣候變暖[6-9].大量研究發(fā)現(xiàn)土壤中含有豐富的甲烷氧化細菌，是氧化大氣中痕量甲烷的唯一途徑[10-11].土壤甲烷氧化細菌對緩解全球氣候變暖，維持大氣甲烷平衡和碳循環(huán)平衡有著重要意義[12-13].

本文實驗通過對5種不同類型土壤樣品甲烷降解能力的對比研究，找出一種降解能力較強的土壤樣品，并從中篩選出目的菌株，通過正交試驗確定其最佳生長代謝條件,為甲烷氧化菌降解甲烷研究及甲烷氧化菌的培養(yǎng)優(yōu)化提供基礎數(shù)據(jù).

1 實驗材料和實驗方法

1.1 培養(yǎng)基組成

實驗采用無碳培養(yǎng)基[14-17]，無機鹽為主要成分(NaNO3、KH2PO4·12H2O、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O).

1.2 菌種的篩選

取湖岸土壤、沙土土壤、森林土壤、花園土壤、稻田土壤樣品各20 g裝入培養(yǎng)瓶中，注入無菌CH4氣體，密封[18]，35 ℃培養(yǎng).每隔一定時間測定其中甲烷含量(采用氣相色譜法測定，色譜柱為TDX-01，檢測器為TCD)，考察其甲烷降解能力(以單位時間內(nèi)甲烷的減少量為標準)，篩選出降解率最優(yōu)的土壤樣品.

在以甲烷為唯一碳源和能源的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用土壤浸出液經(jīng)平板涂布，搖瓶培養(yǎng)，平板劃線，分離篩選出一株目的菌株并對其進行革蘭氏染色[19,20]和掃描電鏡觀察[1,21].

1.3 菌種生長條件優(yōu)化

在培養(yǎng)瓶中加入25 mL培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)接種量、溫度、pH、甲烷含量，密封振蕩培養(yǎng).每隔一定時間測定甲烷含量并計算降解率.空白試樣培養(yǎng)基pH=7，不接種菌液，其他條件與試樣相同.

1.4 甲烷的測定

實驗采用氣相色譜法進行CH4含量的測定[22-24]，色譜柱為TDX-01，氫火焰檢測器(FID).具體測定條件：N230 mL/min，H230 mL/min，空氣 300 mL/min，柱溫90 ℃，進樣溫度100 ℃ ，檢測溫度200 ℃，出峰時間為 3.75 min.

1.5 菌株生長曲線測定

實驗采用紫外可見分光光度法測定培養(yǎng)48 h時的菌懸液在600 nm處的吸光度.由于培養(yǎng)基中含有鈣鹽和鎂鹽等難溶物質，pH=7時培養(yǎng)基較渾濁，對吸光度影響較大，因此在測量OD值時將菌液pH調(diào)至5，使難溶的鈣鹽和鎂鹽溶解，迅速測定，此時測得的吸光度值完全是細菌的存在造成的[25].

2 結果與分析

2.1 不同土壤樣品甲烷降解能力

不同土壤樣品甲烷降解率隨時間變化趨勢如圖1所示.

圖1 不同類型土壤樣品對甲烷的降解率

由圖1可以看出：在相同培養(yǎng)條件下，實驗所用5種土壤樣品均具有降解甲烷的能力，但降解能力差異較大.培養(yǎng)68 h時，沙土土壤樣品、森林土壤樣品、花園土壤樣品的甲烷降解率較低，均低于40 %；湖岸土壤樣品、稻田土壤樣品的甲烷降解能力最強，降解率可達90 %以上.稻田土壤樣品在44 h內(nèi)的甲烷降解率達94.8 %，遠高于湖岸土壤樣品的46.0 %.由此可知，稻田土壤樣品的甲烷降解能力最強，降解速度快，故實驗選用稻田土壤樣品作為甲烷氧化細菌目的菌株分離的土壤樣品.

2.2 菌種篩選結果

從稻田土壤樣品浸出液中分離出一株目的菌株，命名為L08，革蘭氏染色及掃描電鏡觀察結果如圖2所示.

圖2 菌株L08染色觀察及掃描電鏡形態(tài)

由圖2(a)可以看出：菌株L08在固體斜面上劃線培養(yǎng)7 d時斜面上長出膿泡狀的透明單菌落，菌落為規(guī)則圓形，直徑為2 mm左右，有光澤，邊緣整齊，表面光滑.革蘭氏染色表明該菌為革蘭氏陰性菌，細菌形態(tài)呈桿狀.由圖2(b)可以看出：整個視野下菌體形態(tài)基本一致，均呈直桿狀，有些桿狀菌體略彎，菌體表面光滑，無鞭毛，兩端光滑，菌體尺寸大小約為0.5 μm×1 μm.

2.3 菌種最優(yōu)生長條件分析

2.3.1 細菌的接種量對甲烷降解能力的影響

按1.3項要求將細菌接種量分別控制為0.8 %、1.6 %、3.2 %、4.0 %、8.0 %、20.0 %、32.0 %(體積分數(shù)，下同)，甲烷含量為10.0 %(體積分數(shù)，下同)，培養(yǎng)基pH=7.0，試樣置于35 ℃、150 r/min的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h檢測一次甲烷含量，并計算甲烷的降解率，結果如圖3所示.

圖3 細菌接種量對甲烷降解率的影響

由圖3可知：甲烷降解率與細菌接種量呈正相關，接種量在1.6 %～4.0 %時，反應64 h甲烷降解率均達到100 %；接種量大于等于8.0 %時，僅反應48 h甲烷就可完全耗盡.為更好地考察甲烷降解情況，選擇最佳接種量為4.0 %.

2.3.2 培養(yǎng)溫度對甲烷降解能力的影響

將pH=7.0的培養(yǎng)基、細菌接種量為4.0 %、甲烷含量為10.0 %的試樣分別置于15 ℃、25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃，150 r/min的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔6 h檢測一次甲烷含量，并計算甲烷的降解率，結果如圖4所示.由圖4可知：溫度對L08降解甲烷的能力有顯著的影響.當反應28 h時，培養(yǎng)溫度低于25 ℃，甲烷降解率最高達到8.9 %；當培養(yǎng)溫度為55 ℃，甲烷降解率僅為4.8 %；當培養(yǎng)溫度為35 ℃和45 ℃時，甲烷的降解率分別為達到57.1 %和62.5 %，且隨反應時間的延長，降解率有明顯上升的趨勢，而其他溫度培養(yǎng)下，甲烷降解率仍保持較低水平.由此可知，實驗篩選出的甲烷氧化細菌最適宜生長溫度為35～45 ℃，從節(jié)約能耗角度考慮，選擇35 ℃為最適宜培養(yǎng)溫度.

圖4 溫度對甲烷降解率的影響

2.3.3 pH對甲烷降解能力的影響

控制培養(yǎng)基pH分別為 2.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0，細菌接種量為4.0 %，甲烷含量為10.0 %，試樣置于35 ℃、150 r/min的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h檢測一次甲烷含量，并計算甲烷的降解率，結果如圖5所示.

圖5 pH對甲烷降解率的影響

由圖5可知：在強酸條件下(pH=2.0、4.0、5.0)，甲烷降解率較低，反應156 h甲烷的降解率最大值僅為23.9 %；當pH=6.0～11.0時，甲烷的降解率均可在反應156 h之內(nèi)達到100 %，其中pH=7.0時甲烷降解能力最強.故菌株L08在中性或弱堿性條件下的氧化能力較強，pH=7.0為最佳值.

2.3.4 不同甲烷含量對甲烷降解能力的影響

取25 mL無機鹽培養(yǎng)基分別裝于培養(yǎng)瓶中，注入無菌甲烷，培養(yǎng)瓶中甲烷含量分別為3.0 %、5.0 %、10.0 %、20.0 %、30.0 %、40.0 %(體積分數(shù)，下同)的無菌甲烷，培養(yǎng)基pH=7.0，細菌接種量為4.0 %，于35 ℃得到不同甲烷含量對降解率的影響曲線，結果如圖6所示.由圖6可知：隨著甲烷體積分數(shù)的增加，降解率逐漸降低.這可能是由于培養(yǎng)瓶的容積有限，過多地增加甲烷含量勢必會減少O2量，而甲烷的降解是需氧過程[26]，氧的濃度決定著甲烷氧化細菌利用氧的動力學特性以及甲烷單加氧酶(MMO)與氧結合的動力學性質[19].當甲烷含量為3.0 %時，反應36 h甲烷降解速率達89.0 %，當甲烷含量為10.0 %時，降解趨勢較為平穩(wěn)，且降解率在72 h還有繼續(xù)上升的趨勢.因此實驗選擇最佳的甲烷含量為10.0 %，既能為細菌提供足夠的碳源，又能獲得適合的O2量.

圖6 不同甲烷含量對甲烷降解率的影響

2.4 培養(yǎng)條件正交試驗

在培養(yǎng)條件單因素試驗中，已確定菌株最適宜培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度35 ℃、pH=7.0、菌懸液接種量4.0 %(體積分數(shù))、甲烷含量10.0 %.采用正交優(yōu)化試驗方法，進一步考察其培養(yǎng)條件的綜合因素對甲烷降解能力的影響.采用L16(45)正交試驗設計[27-28]，以溫度、pH、細菌接種量、甲烷含量為試驗因素，甲烷降解率為指標，因素水平設計表見表1.正交試驗結果如表2所示.

表1 正交試驗因素水平

表2 培養(yǎng)條件正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，對培養(yǎng)條件進行正交優(yōu)化，得出影響甲烷降解能力的因素序列為：pH>培養(yǎng)溫度>甲烷含量>細菌接種量；從正交試驗分析結果可以得出，正交試驗確定的培養(yǎng)條件與單因素試驗結果基本相同，說明各因素對甲烷降解能力及細菌生長的影響相對獨立，仍采用細菌原培養(yǎng)條件，即pH=7.0、培養(yǎng)溫度35 ℃、甲烷含量10.0 %、細菌接種量4.0 %.

2.5 細菌生長曲線測定

為更好地了解細菌的生長周期變化，按最優(yōu)生長條件對細菌生長曲線進行測定，實驗結果如圖7所示.細菌的生長繁殖可分為4個時期：停滯期、對數(shù)期、靜止期和衰亡期.由圖7可以看出：L08在0～8 h時為停滯期，此時期細菌不立即生長而是經(jīng)過一段時間適應才能在新的培養(yǎng)基中生長，且生長較緩，所以OD值變化不大；8～50 h為對數(shù)期，此時期細菌的生長速率最快，OD值隨時間增加顯著增大，OD值在50 h時增至最大；50～75 h 為靜止期，此時期由于營養(yǎng)物質的消耗，培養(yǎng)基濃度降低，細菌代謝開始減慢，OD值開始下降；75 h之后為衰亡期，此時期由于培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質消耗殆盡，細菌因缺乏營養(yǎng)而利用儲存物質進行內(nèi)源呼吸即自身溶解，所以OD值逐漸下降直至不變.

圖7 細菌生長曲線

3 結 論

本研究通過對5種不同地區(qū)土壤樣品進行甲烷降解效率試驗得出某稻田土壤樣品對甲烷的降解效率最高.利用稻田土壤樣品浸出液進行菌種的分離，并純化、鑒定，成功分離出一株高效降解的甲烷氧化菌株L08，革蘭氏染色表明其為革蘭氏陰性菌，電鏡觀察表明細菌形態(tài)多呈桿狀，少量呈球狀.通過試驗研究發(fā)現(xiàn)甲烷氧化細菌L08的最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35 ℃，pH=7.0，菌液接種量4.0 %，甲烷含量為10 %.目標菌株L08生長曲線測定發(fā)現(xiàn)：菌株培養(yǎng)8～50 h為對數(shù)期，細菌生長最旺盛、甲烷降解能力最強，且細菌的最佳轉接時間不宜超過75 h，實際以3～5 d 內(nèi)轉接1次為宜.實驗通過對甲烷氧化細菌的篩選分離及生長條件優(yōu)化，為后續(xù)外在因素改變對甲烷氧化細菌降解甲烷能力的影響研究提供數(shù)據(jù)支撐，同時也為甲烷細菌氧化降解甲烷生成甲醇研究提供前期基礎，為后續(xù)甲烷去除研究提供前期的技術支撐.