郭澤慧,吳深濤,石禮靜,劉弘毅

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院/國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300380；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650000)

隨著人們生活水平的不斷提高，患上糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)也在增加，在全球范圍內(nèi)每11個(gè)成年人中就有1個(gè)人患上糖尿病[1]，其中90%是2型糖尿病[2]。在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程中，胰島素抵抗為其中重要的影響因素之一。早期的研究發(fā)現(xiàn)，糖脂代謝紊亂及其糖脂毒性既是胰島素抵抗的結(jié)果，又是胰島素抵抗的重要致病因素。糖脂代謝紊亂主要表現(xiàn)為血糖、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白升高及高密度脂蛋白降低，持續(xù)的高糖高脂狀態(tài)產(chǎn)生糖脂毒性，嚴(yán)重影響患者的健康狀況。脂素(Lipin)是一類對(duì)糖脂代謝和能量穩(wěn)定有重要作用的家族，其中Lipin-2主要在肝臟內(nèi)表達(dá)，與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)[3]。既往基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，化濁解毒顆粒能有效改善2型糖尿病高糖高脂狀態(tài)[4-6]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了化濁解毒顆粒對(duì)糖脂代謝和肝臟中Lipin-2表達(dá)的影響，旨在為該藥的臨床應(yīng)用提供更可靠的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡、雄性、SPF級(jí)的SD大鼠40只，體重150～180 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物房內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境保持恒溫恒濕，室溫控制在21～27 ℃，相對(duì)濕度(50±5)%。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及飼料 化濁解毒方顆粒為黃連、大黃、姜黃、蟬蛻、僵蠶、枳實(shí)、清半夏、白芍、柴胡、黃芩、干姜、佩蘭等配制而成的易溶顆粒物，藥物統(tǒng)一購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥廠，批號(hào)：津藥制字(臨)Z20130944。用藥劑量以人鼠單位體重用藥直接換算后劑量的10倍作為中劑量，以中劑量3倍量為高劑量，低劑量為中劑量的1/3,鼠劑量(mg/kg)=人劑量(mg/kg)×(人劑量/鼠劑量)1/3。普通飼料、高脂飼料均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3主要試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司，產(chǎn)品批號(hào)：s0130；Lipin-2抗體購于abcam公司，產(chǎn)品批號(hào)：ab176347；β-actin抗體購于bioworld公司，產(chǎn)品批號(hào)：AP0060；TC試劑盒(酶比色法)、三酰甘油(TG)試劑盒(酶比色法)均購于北京中生北控生物科技股份有限公司；血糖儀購于美國羅氏有限公司，型號(hào)：ACCU-CHEK；血糖試紙購于羅氏有限公司，為血糖儀配套試紙。 生物組織包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司，JB-P5)，病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司,RM2016)，全自動(dòng)生化分析儀(日本日立有限公司，7020型ISE)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取8只作為空白對(duì)照組，予普通飼料喂養(yǎng)；另外32只建立2型糖尿病胰島素抵抗模型：采用高脂飼料喂養(yǎng)8周，一次性尾靜脈注射25 mg/kg的STZ(溶于pH 4.4的0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液)。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)大鼠飼喂72 h后持續(xù)禁食12 h，用20%葡萄糖溶液2 g/kg進(jìn)行灌胃，以灌胃0 min和120 min后血糖值分別大于7.0 mmol/L和11.1 mmol/L為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為化濁解毒方低劑量組、化濁解毒方中劑量組、化濁解毒方高劑量組和模型組，每組8只?；瘽峤舛痉降?、中、高劑量組分別給予化濁解毒顆粒生藥1.5 g/(kg·d)、3.0 g/(kg·d)、6.0 g/(kg·d)灌胃，空白對(duì)照組和模型組給予同體積的生理鹽水灌胃，均1次/d，持續(xù)4周。

1.5檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1糖脂代謝指標(biāo) 4周灌胃結(jié)束后，空腹?fàn)顟B(tài)下各組經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，于室溫靜置2 h，4 ℃下3 000 r/min離心5 min，分離血清。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TG、TC水平，采用血糖儀檢測(cè)空腹血糖(FPG)水平，運(yùn)用放免法測(cè)定空腹胰島素(FINS)水平，參照文獻(xiàn)[7]計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、胰島素敏感性指數(shù)(HOMA-ISI)。HOMA-IR=FPG×FINS/22.5，HOMA-ISI=Ln[1/(FPGxFINS)]。

1.5.2肝臟組織中Lipin-2蛋白表達(dá)量 采用Western blot法檢測(cè)：取各組大鼠部分肝臟組織，使用細(xì)胞裂解液對(duì)肝臟組織總蛋白進(jìn)行裂解提取，BCA法測(cè)量蛋白濃度，以30 μg蛋白加樣，電泳80 V 25 min,100 V 75 min,轉(zhuǎn)膜條件為300 mA 90 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶1 000)4 ℃冰箱過夜，TBST洗膜，二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，用TBST進(jìn)行洗膜，顯色試劑A液和B液按1∶1比例混合，顯影，使用圖像分析軟件拍攝照片，采用Image J軟件定量分析條帶灰度值。

1.5.3肝臟病理觀察 取各組大鼠部分新鮮肝臟組織，放入4%多聚甲醛中固定24 h后，充分流水沖洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)病理切片并HE染色，顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血脂指標(biāo)比較 模型組大鼠血清TC、TG水平均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05);化濁解毒方各組大鼠血清TC、TG水平均明顯低于模型組(P均<0.05),化濁解毒方各組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 空白對(duì)照組和2型糖尿病胰島素抵抗各組大鼠血清TC、TG水平比較

2.2各組大鼠血糖相關(guān)指標(biāo)比較 與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均明顯升高(P均<0.05)，HOMA-ISI明顯降低(P<0.05);與模型組比較,化濁解毒方各組FPG、FINS、HOMA-IR均明顯降低(P均<0.05),HOMA-ISI均明顯升高(P均<0.05),化濁解毒方各組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 空白對(duì)照組和2型糖尿病胰島素抵抗各組大鼠血糖相關(guān)指標(biāo)比較

2.3各組大鼠肝臟組織中Lipin-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 模型組大鼠肝臟組織中Lipin-2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05),化濁解毒方各組均明顯低于模型組(P均<0.05),化濁解毒方各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

A為空白對(duì)照組;B為模型組;C為化濁解毒方低劑量組;D為化濁解毒方中劑量組;E為化濁解毒方高劑量組

2.4各組大鼠肝臟病理表現(xiàn) 空白對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞排列整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠肝細(xì)胞呈現(xiàn)腫脹狀態(tài),其胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡化，為脂滴空泡,肝細(xì)胞界限不清,與周邊細(xì)胞有粘連，核居邊,肝竇狹窄,匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤；與模型組比較,化濁解毒方各組的上述病理變化均有不同程度改善,尤其以中劑量組、高劑量組改善更為顯著。見圖2。

圖2 空白對(duì)照組和2型糖尿病胰島素抵抗各組大鼠肝臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

3 討 論

肝作為糖異生和脂質(zhì)代謝的核心，同時(shí)也是胰島素和胰高糖素作用的主要靶器官[8]，肝內(nèi)胰島素抵抗是全身胰島素抵抗的主體[9]，因此肝臟的影響至關(guān)重要。在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，非脂肪組織如肝、胰島細(xì)胞內(nèi)脂肪的過度聚積(即脂毒性)是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要原因[10]。另外，糖流量的增加刺激胰島素的生成和釋放，損傷了外周受體對(duì)胰島素的敏感性(即糖毒性)，也是產(chǎn)生胰島素抵抗的原因之一。所以，穩(wěn)定的糖脂代謝是改善胰島素抵抗的關(guān)鍵。

糖脂代謝和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)受多種因子調(diào)控，Lipin是其中的重要調(diào)控因子，一方面Lipin具有相當(dāng)于磷脂酸磷酸酶(PAP)活性的作用，能夠促進(jìn)TG、磷脂的合成；另一方面Lipin作為一個(gè)協(xié)同刺激因子，可與肝過氧化物酶體增殖物活化受體作用共同調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的增殖分化及脂肪酸氧化[11]。最新研究表明，Lipin-2對(duì)糖脂代謝，特別是胰島素抵抗具有重要作用。Lipin-2為肝糖脂代謝和胰島素抵抗的關(guān)鍵酶，其在肝組織中大量表達(dá)，可作為轉(zhuǎn)錄因子而加速脂肪合成的胞內(nèi)關(guān)鍵酶的催化，影響肝臟 TAG的合成，從而達(dá)到調(diào)節(jié)糖脂代謝的目的[3]；其過表達(dá)則可增強(qiáng)肝臟的胰島素抵抗[12]。

在治療糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗方面，中醫(yī)學(xué)不僅有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的基礎(chǔ)，而且有其獨(dú)特的診療理念。在持續(xù)高血糖的情況下，胰腺β細(xì)胞在由胰島素代償分泌增加進(jìn)而導(dǎo)致失代償分泌缺陷的過程中，逐漸發(fā)生糖毒性。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為此過程的病機(jī)為氣機(jī)壅滯，血濁內(nèi)瘀，然后釀生毒性，即由濁而毒的過程，由此可見糖毒與脂毒二者之間有著共同的病理基礎(chǔ)。就脂毒而言，目前已證實(shí)脂代謝的紊亂會(huì)加重對(duì)胰島的損害。導(dǎo)致胰島素抵抗的脂毒，與古代醫(yī)學(xué)中的水谷之氣壅遏所形成的血濁等一系列損傷清陽之氣的邪氣，膠著在血分的醞釀所生有損正氣之毒性，可謂源同而名異[13]。吳深濤教授認(rèn)為糖尿病的糖脂代謝紊亂與脾氣失于健運(yùn)有關(guān)，由胃腑納入腐熟之水谷精微之氣壅遏于中焦不得化，體內(nèi)清濁之氣升降失司，則精氣不能輸布于四肢經(jīng)絡(luò)百骸，血濁之氣在體內(nèi)瘀久生濁毒，提出血濁內(nèi)瘀是糖尿病高血糖的起始要素，“濁毒”是糖尿病病機(jī)的啟動(dòng)因子和轉(zhuǎn)化因子，濁毒兼雜頑惡為其核心，貫穿于糖尿病發(fā)病的全過程，造成各種并發(fā)癥[14-17]。吳深濤教授將理論與實(shí)踐相結(jié)合總結(jié)出了化濁解毒的方法，自擬化濁解毒方。此自擬方是由古代醫(yī)方升降散為基礎(chǔ)化裁而來，方藥配伍嚴(yán)謹(jǐn)，辛涼寒溫并用，升清與降濁同施，方中僵蠶與蟬蛻相合使清陽之氣得以上升，姜黃與大黃相合使?jié)彡幹畾獾靡韵陆担鍧嶂畾馍涤行驗(yàn)槿交{(diào)。而化濁解毒方以黃連、大黃為君藥清胃腸之熱、蕩滌濁邪；以柴胡、黃芩為臣藥，取其清解少陽之火而條暢脾胃之效；佐以白芍柔肝養(yǎng)陰，疏肝而不傷陰；輔以枳實(shí)增其理氣導(dǎo)滯之力，使體內(nèi)壅滯之濁氣運(yùn)行，再以清半夏使內(nèi)盛之濁氣下降；黃連辛開苦降，疏暢氣機(jī)樞紐；佩蘭味辛，善辟穢化濁和中消脾癉，干姜辛溫，尤善逐中焦之寒，更有健脾還陽之功，佩蘭與干姜之辛溫共制他藥苦寒之性，使祛邪而不傷正。諸藥合用使?jié)峄窘狻⒅薪箽鈾C(jī)健運(yùn)而升降有序。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，化濁解毒方各組大鼠FPG、TG、TC、FINS、HOMA-IR及肝臟組織中Lipin-2蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于模型組，HOMA-ISI均明顯高于模型組，且肝臟組織病理損傷均有不同程度的改善，以化濁解毒方中、高劑量作用更明顯。證實(shí)化濁解毒方可顯著改善糖脂代謝紊亂導(dǎo)致的肝臟胰島素抵抗，其機(jī)制可能與下調(diào)肝臟Lipin-2表達(dá)有關(guān)，為脂質(zhì)代謝異常及胰島素抵抗的研究提供了一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。