江偉,肖昕,王昆,吳晉芝,張良,陸方筱
(1.華僑大學(xué) 福建省生物化工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021;2.華僑大學(xué) 化工學(xué)院,福建 廈門 361021)
被污染土壤中的重金屬離子往往表現(xiàn)出化學(xué)污染物的聯(lián)合毒性,即幾種污染物會(huì)同時(shí)存在于現(xiàn)實(shí)環(huán)境中,暴露在其中的生物機(jī)體會(huì)受其影響而產(chǎn)生完全不同于單一化學(xué)污染物的生物學(xué)效應(yīng).這類兩種或兩種以上的化學(xué)污染物共同作用而產(chǎn)生的綜合毒性作用,稱為化學(xué)污染物的聯(lián)合毒性作用[1-2].
發(fā)光細(xì)菌是一類在正常的生理?xiàng)l件下能夠發(fā)射可見熒光的細(xì)菌,熒光波長(zhǎng)在420~660 nm之間[3].常見的菌屬有異短桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、希瓦氏菌屬和弧菌屬等[4].朱麗娜[5]等指出發(fā)光細(xì)菌毒性試驗(yàn)具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、對(duì)有毒物質(zhì)反應(yīng)靈敏、檢測(cè)周期短、具有同高等動(dòng)物相類似的理化特性(如呼吸作用,ATP水平變化,酶活性變化等),能在短時(shí)間內(nèi)得到準(zhǔn)確的毒性數(shù)據(jù)等優(yōu)點(diǎn).發(fā)光細(xì)菌中的費(fèi)氏弧菌(Vibriofischeri)屬弧菌屬,曾用來檢測(cè)污水中的毒性物質(zhì)[6]并作為一種單一重金屬離子毒性的表征試劑[7].同時(shí),費(fèi)氏弧菌擁有培養(yǎng)成本低、繁殖周期短,耐受性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),是探究聯(lián)合毒性檢測(cè)的理想材料.本文通過費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與重金屬離子的綜合含量的關(guān)系,建立一個(gè)對(duì)土壤重金屬綜合含量進(jìn)行定量分析的數(shù)學(xué)模型.
主要儀器有AOL-1型全光譜超微弱光檢測(cè)器、搖床等.主要試劑有氯化鈉、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鉛、乙酸鉻、乙酸鎳.五處采樣地點(diǎn)的土壤樣品.費(fèi)氏弧菌凍干粉購(gòu)自浙江托科司生物科技有限責(zé)任公司.
取一份費(fèi)氏弧菌凍干粉和一只復(fù)蘇液,置于室溫下平衡15 min.將2 mL復(fù)蘇液注入凍干粉試劑瓶中,靜置10 min.復(fù)蘇完成后將費(fèi)氏弧菌以1∶4的比例用2%的氯化鈉溶液進(jìn)行稀釋,得菌稀釋液.
分別配制濃度為0.3 mg·L-1的硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鉛、乙酸鉻、乙酸鎳溶液作為單因素實(shí)驗(yàn)的待測(cè)液.將菌稀釋液以1∶90的比例與待測(cè)液混合,反應(yīng)時(shí)間為15 min.采用AOL-1型全光譜超微弱光檢測(cè)器對(duì)混合后的樣品進(jìn)行檢測(cè),記錄費(fèi)氏弧菌在不同種類重金屬離子中的發(fā)光強(qiáng)度.
在單因素實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白組,將費(fèi)氏弧菌稀釋液與2%氯化鈉溶液以1∶90的比例混合15 min后檢測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度,并計(jì)算相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=樣品發(fā)光強(qiáng)度/空白發(fā)光強(qiáng)度).
計(jì)算單因素實(shí)驗(yàn)中每種重金屬離子的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度.為確保模型的上限毒性足夠大,選擇毒性較大的3種重金屬離子作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素.參考趙莉等[8]的研究,設(shè)置水平分別為0.10,0.20,0.30 mg·L-1Pb2+;0.10,0.45,0.80 mg·L-1Ni2+;0.10,0.35,0.60 mg·L-1Cu2+,使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析.
本研究選取五處土壤樣品采集點(diǎn),布置如表1所示.每一個(gè)采樣點(diǎn)采集4份土樣,分別采集距地表20 cm處深層土和地表淺層土,取樣點(diǎn)分布在排污口和車間兩處,采用隨機(jī)取樣的方法進(jìn)行取樣.
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平
采集到土樣后,剔除土壤中砂礫、石塊、木棒、雜草、植物殘根、昆蟲尸體、石塊,以及新生體錳結(jié)核和石灰結(jié)核等雜物,然后將土壤平鋪在墊襯有干凈白紙的晾曬板或木板上自然風(fēng)干(嚴(yán)禁暴曬).當(dāng)樣品達(dá)到半干狀態(tài)時(shí),將大塊土打碎,以免結(jié)成硬塊,并在風(fēng)干過程中,隨時(shí)揀掉石礫、動(dòng)植物殘?bào)w.風(fēng)干室保持干燥通風(fēng),風(fēng)干溫度為30~35 ℃,風(fēng)干時(shí)間為3~7 d.將風(fēng)干土用研磨棒磨碎,首先需將其過孔徑為2 mm尼龍篩,再進(jìn)一步用研缽反復(fù)研磨,過篩3~4遍,直至僅有少量沙粒方可停止,最后再過100目細(xì)篩.
稱取過篩后的土樣,以土壤∶水=1∶5的比例配成土壤懸濁液,搖床震蕩8 h,靜置16 h后取得上清液;然后,用20 μm超濾膜進(jìn)行過濾,將濾液以轉(zhuǎn)速5 000~9 000 r·min-1,時(shí)間為3 min進(jìn)行離心,得到無色透明的溶液即為待測(cè)土壤樣品.
將菌稀釋液以1∶90的比例與待測(cè)樣品混合,同時(shí)設(shè)立空白組.此空白組與單因素實(shí)驗(yàn)中的空白組相同.
在單因素實(shí)驗(yàn)中,計(jì)算可得硫酸銅、硫酸亞鐵、氯化鉛、乙酸鉻和乙酸鎳的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(Ire)分別為17.12%,22.51%,12.52%,19.29%和12.10%.相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最低的前3種金屬離子分別為Ni2+,Pb2+,Cu2+,故將它們作為響應(yīng)面分析的3因素.
響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì),如表2所示.使用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面結(jié)果分析,如表3所示.表3中:I為發(fā)光強(qiáng)度.Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析,如表4所示.表4中:“*”表示P<0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;“**”表示P<0.01,極具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;“-”表示P>0.05,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.由表4可知:模型的F=10.98,說明該模型顯著;失擬項(xiàng)P=0.238 9>0.05,即不顯著,表明該模型在零水平處擬合較好,模型選擇正確.
表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析
各金屬離子濃度交互作用對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(I)影響的曲面圖和等高線圖,如圖1所示.
(a)A(Pb2+)-B(Cu2+)
運(yùn)用構(gòu)建好的二階經(jīng)驗(yàn)?zāi)P蛠磉M(jìn)行分析.對(duì)試驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行二階回歸擬合,得到回歸方程為
上式中:A,B,C分別代表Pb2+,Cu2+,Ni2+,其中C的系數(shù)最大,表明Ni2+的濃度對(duì)費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度的影響最顯著.這可能是由于Ni2+的濃度梯度范圍過大所導(dǎo)致,但本研究并未進(jìn)行深入探討.因素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光強(qiáng)度影響的主次順序依次為Ni2+,Pb2+,Cu2+.當(dāng)Ni2+濃度不變時(shí),可以看出費(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度隨著Cu2+濃度的上升先減小后變大,BC交互項(xiàng)(P>0.05)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的影響并不顯著.
在最優(yōu)條件下,各因素及響應(yīng)值的取值如圖2所示.從圖2可知:當(dāng)理論上的濃度值Pb2+=0.3 mg·L-1,Cu2+=0.1 mg·L-1,Ni2+=0.737 602 mg·L-1時(shí),發(fā)光強(qiáng)度可以達(dá)到最大值960.015.
圖2 各因素及響應(yīng)值在最優(yōu)條件下的取值
利用響應(yīng)面分析,擬合出不同離子配比下相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度由強(qiáng)到弱的線性關(guān)系模型;然后,將此線性模型中離子綜合濃度等比例放大和縮小,結(jié)果如表5,圖3所示.圖3中:Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;n為濃縮倍數(shù).從表5,圖3可知:不同倍數(shù)下,斜率相同,線性關(guān)系仍然成立,即在濃度條件改變下,配比不變,相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度差值不變.但是在同一配比下,離子綜合濃度不同,相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度不同.
表5 不同稀釋倍數(shù)下三元混合體系線性回歸方程
(a)響應(yīng)面模擬 (b)各離子濃度均縮小2倍
在此基礎(chǔ)上,將離子配比固定,改變離子綜合濃度,得到相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度數(shù)值后,再次構(gòu)建聯(lián)合毒性模型,如圖4所示.圖4中:Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;ξ為毒性系數(shù).首先定義毒性系數(shù),將Pb2+∶Cu2+∶Ni2+的濃度比例為0.20∶0.35∶0.45時(shí),定義毒性系數(shù)為1.即放大10倍,毒性系數(shù)就是10,放大0.3倍,毒性系數(shù)就是0.3,放大0.5倍,毒性系數(shù)就是0.5,以此類推.其次,進(jìn)行毒性區(qū)間的劃分,即Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)的毒性區(qū)間分別表示土壤的綜合毒性相當(dāng)于重金屬離子含量分別為0.01,10,20 mg·L-1.
圖4 聯(lián)合毒性模型
在對(duì)土壤檢測(cè)的應(yīng)用中,本實(shí)驗(yàn)分別采集了上述5個(gè)企業(yè)的深層和表層的土壤進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表6所示.表6中:Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;取樣地靠近排污口為“樣一”,靠近車間為“樣二”.
表6 五個(gè)取樣地點(diǎn)深層與表層土上清液對(duì)應(yīng)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度
同一工廠不同采樣點(diǎn)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)差(SD)對(duì)比,如圖5所示.深層層土與表層層土的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(Ire)對(duì)比,結(jié)果如圖6所示.
(a)深層樣一,深層樣二 (b)表層樣一,表層樣二
圖6 深層層與表層土相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度對(duì)比
從圖5可知:同一工廠“深層樣一,深層樣二”和“表層樣一,表層樣二”的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度有著相同的變化趨勢(shì),其中二化化工廠排污口和車間的土壤污染程度存較其他工廠存在較為明顯的差異.從圖6可知:深層土的生物毒性比表層土的要弱,即深層土壤的污染程度略低于表層土壤的污染程度.此外,所有土樣毒性區(qū)間都在Ⅱ區(qū),土壤的生物毒性相當(dāng)于重金屬離子含量101mg·L-1等級(jí),生物毒性較小.
本研究采用響應(yīng)面分析法得出費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與重金屬離子的綜合含量的關(guān)系,將不同重金屬的含量范圍定義為不同的毒性區(qū)間,從而建立了一個(gè)可以對(duì)土壤重金屬綜合含量進(jìn)行定量的數(shù)學(xué)模型.單因素實(shí)驗(yàn)中所得出的離子毒性從大到小排序?yàn)镹i2+>Pb2+>Cu2+>Cr6+>Fe2+,這與趙莉等[8]、楊虹[7]研究中Pb2+,Cu2+,Cr6+的毒性大小排序相符合.同時(shí),本實(shí)驗(yàn)增加檢測(cè)了鎳、鉻的毒性,而鎳是合金、陶瓷染料等生活中常見的物品配方.此外,近年來推廣的混合動(dòng)力汽車多數(shù)使用的是鎳氫動(dòng)力電池[9],報(bào)廢的鎳氫電池造成的城市污染也是不容小覷的.鉻則一直作為合金生產(chǎn)等工業(yè)生產(chǎn)的重要元素,因此,鉻渣帶來的污染也同樣值得關(guān)注.
不同放大倍數(shù)下費(fèi)氏弧菌毒性的變化趨勢(shì),如圖7所示.圖7中:Ire為相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度;ξ為毒性系數(shù).從圖7可知:費(fèi)氏弧菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度在不同濃度重金屬離子的作用下,存在“低濃度促進(jìn),高濃度抑制”的現(xiàn)象,即毒物興奮效應(yīng)(hormesis).此效應(yīng)廣泛存在于各類發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)中.它是指某種毒物在高濃度時(shí)對(duì)生物體產(chǎn)生負(fù)面作用,但在低濃度時(shí)對(duì)生物體卻產(chǎn)生正面作用[10].Shen等[11]研究了Cu2+,Zn2+,Cd2+,Cr6+作為單一毒物對(duì)青?;【挠绊懀舶l(fā)現(xiàn)了上述效應(yīng),并且還發(fā)現(xiàn)這種效應(yīng)不隨接觸時(shí)間的改變而改變.此現(xiàn)象出現(xiàn)的可能原因是,發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光反應(yīng)是一種氧化反應(yīng),它會(huì)產(chǎn)生一種氧化產(chǎn)物黃素單核苷酸(FMN)[12].研究表明,F(xiàn)MN能夠結(jié)合煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)提供的H+而被還原重新生成FMNH2[13],從而使得發(fā)光能夠連續(xù)進(jìn)行.
(a)最弱毒性 (b)最強(qiáng)毒性
通過研究鹽酸四環(huán)素對(duì)費(fèi)氏弧菌發(fā)光的影響,湯淼等[14]發(fā)現(xiàn)低濃度的鹽酸四環(huán)素會(huì)促進(jìn)發(fā)光的原因在于,鹽酸四環(huán)素相較于NADH更能提供所需的質(zhì)子.一般情況下,重金屬離子在水溶液中會(huì)存在一種水解反應(yīng),且濃度越低越能促進(jìn)水解反應(yīng)的發(fā)生.水解反應(yīng)會(huì)使得溶液中存在一定量的H+,這一定量的H+可能促使FMN重新還原為FMNH2.這種效應(yīng)的存在會(huì)產(chǎn)生一個(gè)相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度最大值,在本實(shí)驗(yàn)的模型中將它稱之為“拐點(diǎn)”.方便起見,將Pb2+∶Cu2+∶Ni2+濃度比例為0.20∶0.35∶0.45時(shí)的模型作為初步模型.
由于拐點(diǎn)的存在,本實(shí)驗(yàn)的模型在應(yīng)用時(shí)可以借助其他數(shù)據(jù)來細(xì)化區(qū)間.根據(jù)趙莉等[8]的研究,汞離子對(duì)于費(fèi)氏弧菌的毒性較強(qiáng),不存在拐點(diǎn).因此,當(dāng)待測(cè)樣品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度可同時(shí)對(duì)應(yīng)Ⅰ級(jí)毒性區(qū)間和Ⅲ級(jí)毒性區(qū)間,將該樣品的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度帶入汞離子與費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比.若該發(fā)光強(qiáng)度與汞離子濃度的對(duì)應(yīng)值在0.09 mg·L-1以上,則認(rèn)為毒性在Ⅲ級(jí)毒性區(qū)間;否則,在Ⅰ級(jí)毒性區(qū)間.此處,將0.09 mg·L-1作為判斷Ⅰ和Ⅲ區(qū)間的原因是,正如楊虹[7]所述,發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度隨汞離子濃度的增加而逐漸減弱,當(dāng)汞離子濃度大于等于0.09時(shí),相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度趨近于0,此濃度范圍以上已經(jīng)超過了生物法檢測(cè)的范圍,生物已經(jīng)失活.在本文的模型中,金屬離子綜合濃度在200 mg·L-1濃度范圍時(shí),發(fā)光細(xì)菌尚未失活,但發(fā)光強(qiáng)度在逐漸減弱.因此,將0.09 mg·L-1作為判斷離子濃度在Ⅰ還是Ⅲ區(qū)間的標(biāo)準(zhǔn).
此外,毒性區(qū)間Ⅱ區(qū)的這個(gè)“拐點(diǎn)”,在理論上是難以通過實(shí)驗(yàn)的方法找出的,這與菌種對(duì)生物毒性的敏感度有關(guān);再者,對(duì)于并非單因素水平實(shí)驗(yàn),聯(lián)合毒性受限于實(shí)驗(yàn)菌種的生物敏感性和各因素水平變化幅度的精確性,在實(shí)驗(yàn)水平上只能無限逼近這個(gè)拐點(diǎn)而很難找到拐點(diǎn)的具體數(shù)值.當(dāng)然,“拐點(diǎn)”可以通過進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)縮小,得到更為精確的區(qū)間范圍.
在現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15441-1995《水質(zhì)急性毒性的測(cè)定發(fā)光細(xì)菌法》中,所用發(fā)光細(xì)菌為明亮桿菌,所測(cè)發(fā)光值對(duì)應(yīng)的Hg2+濃度為土壤污染標(biāo)準(zhǔn).相比費(fèi)氏弧菌而言,明亮桿菌較喜低溫環(huán)境,發(fā)光最適溫度在18 ℃[15];而費(fèi)氏弧菌的發(fā)光最適溫度在25 ℃[16],更加方便在室溫條件下進(jìn)行操作.此外,土壤的成分復(fù)雜,其中可能包括多種金屬氧化物或金屬化合物,它們之間往往存在著復(fù)雜的聯(lián)合毒性作用[17].本研究模型采用的是Pb2+,Ni2+,Cu2+等3種重金屬離子三因素三水平聯(lián)合毒性,相比于單因素或兩因素單水平的毒性探究而言更加復(fù)雜,也能夠更好地模擬土壤重金屬生物毒性的復(fù)雜性.
本研究通過費(fèi)氏弧菌相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度與重金屬離子的綜合含量的關(guān)系,將不同重金屬的含量范圍定義為不同的毒性區(qū)間,建立了一個(gè)可以對(duì)土壤重金屬綜合含量進(jìn)行定量的數(shù)學(xué)模型.此模型可以表示土壤中重金屬離子的綜合含量,同時(shí)也能表征土壤中重金屬離子的聯(lián)合毒性,可為后續(xù)的研究發(fā)展提供了新思路.