賈 坤，蘇建榮，孫 偉

慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)是感染丙型肝炎病毒(HCV)所致的傳染病。HCV為小RNA病毒，侵犯肝臟后會引起一系列免疫反應(yīng)，導(dǎo)致慢性肝炎。如不給予治療，可能會發(fā)展為肝硬化，嚴(yán)重時可誘發(fā)肝細(xì)胞癌((hepatocellular carcinoma，HCC)[1]。當(dāng)HCV感染細(xì)胞后，已感染病毒的細(xì)胞會分泌包裹病毒RNA的外泌體，以復(fù)合物的形式傳播至未感染細(xì)胞，并參與未感染細(xì)胞生物功能的調(diào)控，影響其正常的生理功能[2，3]。目前認(rèn)為，從分子生物學(xué)角度研究CHC的發(fā)病機(jī)制或有助于后期進(jìn)行靶向治療，以改善患者預(yù)后。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類參與了多種生物學(xué)進(jìn)程的非編碼RNA，包含多種類型的轉(zhuǎn)錄本。肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的中長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA in high expression in HCC，LncRNA-HEIH)能夠影響細(xì)胞周期，但其在CHC患者的變化研究尚處于探索階段。本研究分析了CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平變化，旨在探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年9月～2020年7月我院診治的CHC患者77例，男45例，女32例；年齡為45～71歲，平均年齡為(59.5±5.7)歲。符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[4]的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除合并其他類型肝臟疾病、嚴(yán)重的糖尿病和感染性疾病、妊娠或哺乳期婦女、嚴(yán)重的心血管疾病和惡性腫瘤患者。另選擇同期我院診治的HCC患者40例，男24例，女16例；年齡43～69歲，平均年齡為(58.7±6.1)歲。符合《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南(2015年版)》[5,6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)?；颊吆炇鹬橥鈺狙芯拷?jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核。

1.2 治療方法 給予所有CHC患者標(biāo)準(zhǔn)化，即聚乙二醇化干擾素-α聯(lián)合利巴韋林治療6個月。

1.3 血清LncRNA HEIH水平檢測 采集空腹靜脈血3 ml 2份，置于EDTA管中保存，在室溫下靜置30 min，取其中一份，3000 r/m離心10 min，留取上清液，放置于-80℃下保存?zhèn)錂z。定量RT-PCR反應(yīng)：應(yīng)用上海生工生物工程股份有限公司合成的PCR引物，基因序列如下，GAPHD-F：5′-CATCTTCTTTTGCGTCGCCA-3′；GAPHD-R：5′-TTAAAAGCAGCCCTGGTGACC-3′；LncRNA HEIH-F：5′-AAGAACTCTTCGCTCCAGCC-3′；LncRNA HEIH-R：5′-ACAAAAGCAGACTAGGGCGG-3′。取血清，溶于Reagent Kit液中，加入氯仿，用裂解液分解為水相和有機(jī)相，提取含有RNA的上層水相(試劑盒由日本SYBR提供)，加入乙醇，反應(yīng)條件為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，用雙蒸水作為對照。PCR反應(yīng)條件為95℃ 10 min、95℃ 10 s、60℃ 30 s，共45個循環(huán)，采用2-△△法進(jìn)行計算。

1.4 外泌體LncRNA HEIH水平檢測 提取外泌體，取血清，在4℃下超速離心2 h，加入1×PBS溶液1 ml洗滌沉淀物。然后，再次離心3 h，收集沉淀，置于-80℃下保存?zhèn)錂z。外泌體RNA提?。河肞BS重懸沉淀物，取懸液20 μL，滴加于載樣銅網(wǎng)上，用濾紙從濾網(wǎng)側(cè)邊吸干液體，用3%磷鎢酸溶液負(fù)染5 min，室溫晾干，在透射電鏡(COXEM-30 PLUS，韓國)下觀察外泌體形態(tài)。然后，應(yīng)用miRNeasy Mini kit試劑盒提取外泌體總RNA。實時定量RT-PCR反應(yīng)同上。

1.5 肝活檢 在彩色多普勒超聲診斷儀下定位，使用16 G穿刺針穿刺，取得肝組織，置于甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，進(jìn)行肝組織炎癥分級和肝纖維化分期診斷。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較 CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水顯著低于HCC患者(P<0.05，表1)。

表1 兩組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較

2.2 不同肝組織炎癥和纖維化程度的CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較 肝組織炎癥G0～G1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平顯著高于肝組織炎癥>G2者，肝纖維化S0～S1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平顯著高于肝纖維化>S2者(P<0.05，表2)。

表2 不同肝組織病變的CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較

2.3 血清和外泌體LncRNA HEIH水平與CHC患者肝組織病理學(xué)特征的多因素Logistics回歸分析 分析發(fā)現(xiàn)血清LncRNA HEIH水平<2.0是預(yù)測肝組織炎癥分級和肝纖維化分期顯著的因素(P<0.05，表3)。

表3 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預(yù)測CHC患者肝組織病理學(xué)特征的Logistics回歸分析

2.4 應(yīng)答與不應(yīng)答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較 不應(yīng)答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平均顯著低于應(yīng)答組(P<0.05，表4)。

表4 應(yīng)答與不應(yīng)答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平比較

2.5 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預(yù)測CHC患者顯著肝組織病變的價值分析 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預(yù)測CHC患者肝組織病變顯著的AUC分別為0.764～0.778和0.723～0.736之間(圖1,表5)。

圖1 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預(yù)測CHC患者肝組織顯著病變的ROC曲線分析

表5 血清和外泌體LncRNA HEIH水平預(yù)測肝組織病變價值分析

3 討論

外泌體是包含了復(fù)雜RNA和蛋白質(zhì)的小膜泡，存在于大多數(shù)體液中，其在活體內(nèi)可作為運載脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA等物質(zhì)的新型媒介。相關(guān)研究指出，外泌體參與了CHC的發(fā)生發(fā)展過程[7，8]。HCV感染后在發(fā)生壞死性肝組織炎癥反應(yīng)時，會釋放含有LncRNA的外泌體[9，10]。故本研究探究了血清和外泌體中LncRNA HEIH水平在CHC患者的臨床意義。

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的RNA，具有mRNA許多相同的結(jié)構(gòu)特性，可以在表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個層面調(diào)控基因水平，參與機(jī)體生理和病理學(xué)過程[11]。相關(guān)報道指出，HCC患者血清和外泌體LncRNA HEIH呈現(xiàn)為高水平，且與疾病進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)[12，13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHC患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平均低于肝癌患者，肝癌患者LncRNA HEIH高水平可能促進(jìn)了PGKI分泌，以發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CHC患者外泌體LncRNA HEIH水平高于血清水平，其臨床意義值得探討[14，15]。

目前認(rèn)為，CHC的病情進(jìn)展與炎癥反應(yīng)有關(guān)，減輕機(jī)體炎癥程度可延緩疾病進(jìn)展，減緩肝纖維化的發(fā)生[16，17]。LncRNA HEIH可誘發(fā)肝癌的發(fā)生，或與引發(fā)肝纖維化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肝組織炎癥G0～G1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平均顯著高于肝組織炎癥>G2者，肝纖維化S0～S1患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平均顯著高于肝纖維化>S2者，說明肝組織炎癥分級和肝纖維化分期嚴(yán)重的患者存在血清和外泌體LncRNA HEIH低水平現(xiàn)象，檢測它們水平的變化可能有助于判斷肝組織病變。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清LncRNA HEIH水平是影響肝組織炎癥分級和肝纖維化分期的預(yù)測因素，但目前尚不知其具體機(jī)制。有人認(rèn)為這或許與LncRNA HEIH與臨近的基因相互作用，通過調(diào)控染色體構(gòu)象，改變了基因水平表達(dá)[18]。相關(guān)研究指出，肝臟可通過產(chǎn)生特異性的外泌體來傳遞纖維化信號[19]，故我們也認(rèn)為外泌體LncRNA HEIH水平或與肝纖維化的發(fā)生有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)對抗病毒治療不應(yīng)答組血清和外泌體LncRNA HEIH水平顯著低于應(yīng)答組，可能與這些患者肝組織炎癥反應(yīng)和纖維化程度較嚴(yán)重有關(guān)，提示或可通過檢測患者血清和外泌體LncRNA HEIH水平來預(yù)測其抗病毒治療的效果。本研究經(jīng)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用血清和外泌體LncRNA HEIH水平預(yù)測CHC患者肝組織炎癥和纖維化的AUC分別較高，具有一定的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，CHC患者存在血清和外泌體LncRNA HEIH水平異?，F(xiàn)象，監(jiān)測它們的變化對判斷CHC患者肝組織炎癥和纖維化程度或預(yù)測抗病毒療效都有一定的臨床應(yīng)用價值，值得進(jìn)一步深入研究。