顧雪香，李祥玉，單勤星

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指排除酒精、藥物、免疫損傷、病毒感染等明確損肝因素以外，發(fā)生超過5%肝細(xì)胞脂肪變性引起的疾病。研究發(fā)現(xiàn)[1，2]，胰島素抵抗(IR)在NAFLD發(fā)病中具有重要的作用，不僅可阻礙胰島素對(duì)脂肪的代謝，增加機(jī)體脂肪量，而且會(huì)導(dǎo)致高胰島素血癥，使血液游離脂肪酸(FFA)增多，脂蛋白合成減少，堆積于肝臟。因此，積極改善IR為治療NAFLD提供了新的思路。柴胡是祖國(guó)醫(yī)學(xué)常用的中藥，其中藥方劑除作為護(hù)肝藥物廣泛應(yīng)用于急性肝損傷和肝纖維化等的治療外，近年來也作為改善IR藥物逐漸應(yīng)用于治療糖尿病患者[3-5]。柴胡皂苷a(saikosaponin a，SSa)是柴胡的主要有效成分，其抗病毒、抗炎、抗腫瘤等藥理作用已被廣為認(rèn)可，但關(guān)于其改善IR作用及其應(yīng)用于治療NAFLD效果的研究尚少。本研究通過建立NAFLD大鼠模型，并給予SSa干預(yù)，觀察了對(duì)脂肪變的干預(yù)效果，并探討了其可能的作用機(jī)制，為SSa應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器、藥品、試劑 46只SPF級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量為190～210 g，由上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部提供[動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(滬)2018-0006]。URIT-8020A全自動(dòng)生化分析儀(桂林優(yōu)利特電子集團(tuán)有限公司)、Synergy-HD顯微鏡(日本Toshiba公司)、Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳儀(美國(guó)伯樂公司)。SSa(純度>98%，上海博麥德生物技術(shù)有限公司)、抗過氧化物增殖物活化受體α(PPARα)信號(hào)通路抑制劑GW6471(美國(guó)R&D Systems公司)、高脂飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司)、血糖測(cè)定試劑盒、放射免疫分析測(cè)定胰島素試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)，檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA試劑盒(南京建成生物工程研究所)，油紅O染色試劑盒(上海懋康生物科技有限公司)，兔抗大鼠5-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase， AMPK)、抗p-AMPK、抗過氧化物增殖物活化受體α(peroxide proliferator activated receptor α，PPARα，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)。

1.2 NAFLD模型建立[6]隨機(jī)將46只大鼠分為對(duì)照組10只和NAFLD組12只、SSa干預(yù)組12只和SSa聯(lián)合GW6471干預(yù)組12只。給予對(duì)照組動(dòng)物普通飼料喂養(yǎng)，給予其他組動(dòng)物高脂飼料(普通飼料73%、豬油20%、白糖4%、奶粉2%、膽固醇1%)喂養(yǎng)8 w。在干預(yù)組，每組取2只動(dòng)物檢查造模情況。在建模成功后，分別給予SSa 5 mg.kg-1(溶于生理鹽水)灌胃，或SSa灌胃和GW6471 3.5 mg.kg-1腹腔注射，或給予等體積生理鹽水灌胃和腹腔注射，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。在末次給藥后禁食不禁水24 h，稱體質(zhì)量。給予戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 mL。采用脫頸法處死大鼠，冰盤上分離肝臟，稱質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)(%)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%；將其余肝組織置于液氮中保存。

1.3 血糖指標(biāo)檢測(cè) 采用葡萄糖氧化酶偶聯(lián)比色法和放射免疫分析法檢測(cè)空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。

1.4 肝組織脂肪含量檢測(cè) 取出液氮保存的肝組織，按照肝組織質(zhì)量：生理鹽水=1:9勻漿，4 ℃搖床過夜，離心10 min，收集上清，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG和FFA含量。

1.5 肝組織病理學(xué)檢查 取肝組織，低溫速凍后，切成7 μm厚的切片，常溫風(fēng)干0.5 h，4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水充分沖洗。在60%異丙醇中浸泡180 s。導(dǎo)入油紅O儲(chǔ)液60 mL、蒸餾水40 mL 30min。加60%異丙醇，蒸餾水充分沖洗，蘇木精對(duì)比染色120 s，蒸餾水充分沖洗，用水性封片機(jī)固封，常溫陰干后在顯微鏡下觀察。

1.6 肝組織AMPK、p-AMPK和PPARα蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)，取液氮保存的肝組織，研磨后轉(zhuǎn)至離心管，加入RIPA裂解液裂解30 min，用BCA試劑盒定量。取60 μg樣品，按比例與上樣緩沖液混合，100 ℃金屬浴煮5 min，使蛋白變性，在8%凝膠上電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)至膜，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠AMPK(1:400)、抗p-AMPK(1:400)、抗PPARα(1:500)、抗GAPDH，4 ℃搖床孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔IgG(1:2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌，加入ELC顯影劑于暗室曝光、顯影，在凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，以AMPK、p-AMPK、PPARα灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算p-AMPK/AMPK比值。

2 結(jié)果

2.1 各組血糖指標(biāo)比較 與對(duì)照組比，NAFLD組FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組比，SSa干預(yù)組FBG、FINS和HOMA-IR顯著降低(P<0.05)；與SSa干預(yù)組比，SSa聯(lián)合GW6471干預(yù)組FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高(P<0.05，表1)。

表1 各組血糖指標(biāo)比較

2.2 大鼠肝指數(shù)和肝組織脂質(zhì)含量比較 與對(duì)照組比，NAFLD組肝指數(shù)和肝組織TC、TG、FFA含量顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組比，SSa組肝指數(shù)和肝組織TC、TG、FFA含量顯著降低(P<0.05)；與SSa組比，SSa聯(lián)合GW6471組肝指數(shù)和肝組織TC、TG、FFA含量顯著升高(P<0.05，表2)。

表2 各組肝指數(shù)和肝組織脂質(zhì)含量比較

2.3 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 NAFLD組可觀察到橘紅色脂滴呈彌漫性分布和大泡性脂肪變，而在SSa干預(yù)組和SSa聯(lián)合GW6471干預(yù)組肝組織脂滴顯著減少，其中SSa組脂滴少于SSa聯(lián)合GW6471組(圖1)。

圖1 各組大鼠肝組織脂質(zhì)沉積表現(xiàn)(油紅O染色， 200×)A：對(duì)照組；B：NAFLD組；C：SSa組；D：SSa聯(lián)合GW6471組

2.4 各組肝組織PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比，NAFLD組PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-AMPK/AMPK比值顯著降低(P<0.05)；與NAFLD組比，SSa干預(yù)組PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-AMPK/AMPK比值顯著升高(P<0.05)；與SSa干預(yù)組比，SSa聯(lián)合GW6471干預(yù)組PPARα蛋白相對(duì)表達(dá)量和p-AMPK/AMPK比值顯著降低(P<0.05，表3)。

表3 各組肝組織蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

本研究結(jié)果顯示，采用SSa干預(yù)NAFLD大鼠后，其FBG、FINS、HOMA-IR、肝指數(shù)，肝臟組織TC、TG、FFA含量均顯著降低，肝組織脂滴減少，提示SSa可有效改善NAFLD大鼠IR，并減少肝組織脂質(zhì)沉積。SSa是柴胡提取物中活性最強(qiáng)的成分之一，有抗內(nèi)毒素、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抗炎、抗腫瘤、保肝、護(hù)腎等廣泛的藥理作用，但目前關(guān)于其調(diào)節(jié)糖脂代謝作用的研究尚少。有學(xué)者在治療血糖不能控制的2型糖尿病時(shí)發(fā)現(xiàn)[7-9]，柴胡桂枝干姜湯方可有效控制血糖，促進(jìn)胰島素分泌并抑制IR，在此方中柴胡可能發(fā)揮了功效。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明[10-12]，SSa可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞能量代謝異常、維持鈣平衡、抑制脂質(zhì)和氧自由基過氧化、調(diào)節(jié)肝細(xì)胞免疫功能，阻滯纖維化進(jìn)程，從而發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用，說明其具有調(diào)節(jié)糖脂代謝平衡的生物學(xué)功能。

PPARα屬于新型甾體類激素受體，通常表達(dá)于肌肉組織和進(jìn)行FFA氧化的器官。研究發(fā)現(xiàn)[13-16]，PPARα激活后可促進(jìn)肝組織FFA發(fā)生β氧化，調(diào)控脂質(zhì)代謝基因表達(dá)，提高脂質(zhì)利用效率，減少FFA合成和在肝臟的沉積。AMPK通過感受胞漿AMP與ATP的比值變化調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)代謝，調(diào)控骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取、FFA氧化和ATP生成，以維持細(xì)胞能量的平衡[17-19]。研究表明[20]，抑制AMPK磷酸化，PPARα表達(dá)明顯下調(diào)，能加快NAFLD進(jìn)程，而激活A(yù)MPK則具有胰島素增敏效應(yīng)，促進(jìn)脂肪酸氧化代謝。由此可推測(cè)，AMPK-PPARα信號(hào)通路可能是治療NAFLD的新靶點(diǎn)。