史雪麗，張萬里，毛 俊，顏悅蓉

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是由異常自身免疫反應介導的慢性肝實質炎癥性病變性疾病，具有血清轉氨酶和免疫球蛋白G升高、肝組織學炎癥和血循環(huán)有多種自身抗體存在的特點[1]。AIH臨床表現(xiàn)不一，診斷需要排除其他肝臟疾病。對AIH的及時診斷和治療可防止肝硬化和終末期肝病的發(fā)生[2]。AIH的確切病因尚不清楚，但越來越多的研究證據(jù)表明，在特定的自身免疫生態(tài)系統(tǒng)中，遺傳易感性、血清趨化因子、分子模型學說和效應與調(diào)節(jié)免疫之間的不平衡是AIH發(fā)展的關鍵性病理學因素[3]。白介素(interleukin，IL)-1家族成員是固有免疫的重要組成部分，IL-38是IL-1家族成員之一，位于2號染色體q12-14位置，在包括扁桃體、胎盤、心臟和大腦在內(nèi)的多種組織中均有表達，與自身免疫性疾病等多種疾病密切相關[4]。研究[5]顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血漿IL-38水平顯著高于健康人，在活動期患者體內(nèi)水平更高，應用IL-38干預系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠可明顯下調(diào)炎癥細胞因子表達，提示IL-38水平與系統(tǒng)性紅斑狼瘡有關，并可能通過抑制促炎細胞因子的生成而調(diào)節(jié)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生。β2糖蛋白I(β2-glycoprotein I，β2GPI)是一個大小為50 kDa的磷脂結合蛋白，位于17號染色體q23-24位置，具有兩種不同的構象，主要在肝細胞中合成，血漿β2GPI水平可被檢測[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)，β2GPI是自身免疫性疾病抗磷脂抗體綜合征中最重要的自身抗原[7]。此外，在抗磷脂抗體綜合征患者和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血均可檢測到氧化低密度脂蛋白(oxLDL)-β2GPI復合體[8]。本研究檢測了AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平，并分析了其與肝組織病變的關系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器 清潔級、雄性Wistar大鼠40只，12周齡，體質量210～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【許可證號SCXK(京)：2020-0005】。飼養(yǎng)條件：溫度24±2℃，相對濕度50%～60%，12 h光照和12 h暗適應處理，適應性飼養(yǎng)2 w。弗氏完全佐劑(北京Solarbio科技有限公司)；水合氯醛(天津一方科技有限公司)；檢測血清IL-38的ELISA試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)；檢測血清β2GPI 的ELISA試劑盒(美國Ebioscience公司)；低溫冰箱(青島海爾公司)。

1.2 AIH大鼠模型的建立 將弗氏完全佐劑2 mg與肝細胞特異性脂蛋白1:1混勻，取0.2 ml腹腔注射，1次/10 d，連續(xù)注射2次；取肝細胞特異性脂蛋白1 mg腹腔注射，1次/w，注射3次，再改為1次/m，注射3次。于末次注射后的第3 d，取肝細胞特異性脂蛋白2 mg腹腔注射，加強免疫1次。3 d后，隨機取3只大鼠處死，行肝組織病理學檢查，顯示大鼠肝細胞變性壞死明顯，出現(xiàn)中度碎屑樣壞死和橋接壞死，小葉內(nèi)有纖維間隔形成，表明AIH大鼠模型制作成功。在建模成功后，使用水合氯醛麻醉大鼠，開腹并于腹主動脈取血，立即收集于抗凝管中，靜置，離心，置于-20℃冰箱。同時，取大鼠肝組織，行病理學檢查[9]，肝組織表現(xiàn)為肝細胞變性，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤、小葉結構完整、伴或者不伴局限性碎屑樣壞死、血管點狀或者灶狀壞死或者出現(xiàn)凋亡小體，為輕度AIH；肝細胞變性，匯管區(qū)明顯血管壁炎癥細胞浸潤、小葉炎癥明顯、存在中度碎屑樣壞死、出現(xiàn)融合性壞死或者存在少數(shù)橋接壞死，形成纖維間隔，為中度AIH；匯管區(qū)血管壁彌漫性炎癥細胞浸潤、小葉結構紊亂、伴隨有嚴重的碎屑樣壞死、存在多數(shù)的橋接壞死，形成大量的纖維間隔，為重度AIH。

1.3 肝內(nèi)血管病變分級法[10]分為1級、2級和3級，其中1級：血管壁少量炎性細胞浸潤，僅有血管點狀破壞，纖維化區(qū)血管≤5個，匯管區(qū)或炎癥區(qū)1～3個血管被阻塞；2級：血管壁炎性細胞浸潤介于1～3級，血管點狀破壞介于1～3級，匯管增生介于1～3級，血管阻塞介于1～3級；3級：血管壁彌漫性炎性細胞浸潤，血管壁大部分被破壞，匯管區(qū)和纖維化區(qū)血管≥20個，匯管區(qū)或炎癥區(qū)或纖維化區(qū)血管阻塞>5個。

1.4 大鼠血清IL-38和β2GPI水平檢測 采用ELISA法。

2 結果

2.1 不同肝組織病變的AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平比較 重度AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于(P<0.05)，而血清β2GPI水平顯著高于輕度或中度AIH大鼠(P<0.05)，中度AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于(P<0.05)，而血清β2GPI水平顯著高于輕度AIH大鼠(P<0.05，表1)。

表1 不同肝組織病變的AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平比較

2.2 不同肝組織血管病變的AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平比較 隨著肝組織血管病變分級的增加，AIH大鼠血清IL-38水平逐漸降低，而β2GPI水平逐漸升高。3級肝組織血管病變的AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于，而血清β2GPI水平顯著高于1級或2級AIH大鼠(P<0.05)，2級肝組織血管病變的AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于(P<0.05)，而血清β2GPI水平顯著高于1級AIH大鼠(P<0.05，表2)。

表2 不同肝組織血管病變的AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平比較

3 討論

AIH是一種慢性炎癥性肝病，主要由自身免疫反應攻擊所致，具有以淋巴細胞和漿細胞浸潤為主的炎癥性肝組織學特征，病情嚴重可進一步導致肝纖維化，乃至肝硬化以及肝細胞癌，并最終導致肝功能衰竭[11,12]。盡管AIH致癌風險低于病毒性肝炎，但因AIH導致的肝硬化患者肝癌發(fā)生率為3.3%～5.1%，在一定程度上可能與疾病長期進展有關[13]。因此，盡早對AIH進行診斷，及時予以治療，對于促進患者預后的良好轉歸至關重要。AIH的病因尚不明確，但遺傳和免疫調(diào)節(jié)失衡、自身抗體以及一些誘導因子所致的自身免疫反應不耐受均可能誘導疾病的發(fā)生。IL-38和β2GPI與系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性炎癥性疾病有關。因此，本研究通過建立AIH大鼠模型，檢測了AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平，并分析其與肝組織病變的關系。

IL-38是一種新發(fā)現(xiàn)的IL-1家族細胞因子，可在多種組織中表達，并由外周血單個核細胞、成纖維細胞樣滑膜細胞、B細胞、角質形成細胞和各種免疫細胞等多種細胞分泌[14]。報道[15]稱，IL-38通過與多種受體，如IL-36受體(IL-36 receptor，IL-36R)、IL-1受體輔助性蛋白1(IL-1 receptor accessory protein-like 1，IL-1RAPL 1)和IL-1受體1(IL-1 receptor 1，IL-1R1)結合而發(fā)揮抗炎作用，從而阻斷與其他促炎細胞因子的結合，并抑制下游信號通路，從而調(diào)節(jié)T細胞、外周血單個核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的活化和功能發(fā)揮，最終抑制輔助性T細胞(T helper cells，Th)17的成熟，促進調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)的增殖。最近的研究[16]表明，IL-38在類風濕性關節(jié)炎、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、原發(fā)性干燥綜合征、炎癥性腸病、化膿性汗腺炎、強直性脊柱炎、青光眼等炎癥性自身免疫性疾病患者異常表達，提示IL-38可能是預測炎癥性自身免疫性疾病發(fā)展和炎癥性自身免疫性疾病治療轉歸的潛在的生物標志物。β2GPI為主要在肝組織合成的磷脂結合蛋白，在體內(nèi)可與磷脂結合，進而參與凝血功能發(fā)揮和凋亡機制的進行[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，β2GPI與膜Toll樣受體直接發(fā)生相互作用，β2GPI及其抗體復合物通過Toll樣受體誘導細胞內(nèi)信號轉導，進而導致內(nèi)皮細胞、單核細胞的活化和促炎細胞因子的表達。β2GPI是抗磷脂抗體綜合征患者體內(nèi)最重要的自身抗原[19]。另外，β2GPI還可能與乙型肝炎病毒感染、肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生有關[20,21]。

本研究結果顯示，不同嚴重程度的肝組織病變AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平存在顯著性差異。重度AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于輕度或中度AIH大鼠，而血清β2GPI水平顯著高于輕度或中度AIH大鼠，且中度AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于輕度AIH大鼠，血清β2GPI水平顯著高于輕度AIH大鼠，表明AIH大鼠肝組織病變嚴重程度與其血清IL-38和β2GPI水平有關。肝組織病變越嚴重，血清IL-38水平越低，而β2GPI水平越高。此外，本研究結果還顯示，嚴重血管病變的AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于輕度AIH大鼠，而血清β2GPI水平顯著高于輕度血管病變的AIH大鼠；肝組織血管病變3級的AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于1級或2級AIH大鼠，而血清β2GPI水平顯著高于1級或2級AIH大鼠，肝組織血管病變2級AIH大鼠血清IL-38水平顯著低于1級AIH大鼠，而β2GPI水平也顯著高于1級AIH大鼠，表明AIH大鼠血清IL-38水平隨著肝組織炎癥分級和血管病變分級的加重而降低，而血清β2GPI水平隨著肝組織炎癥分級和血管病變分級的加重而升高。故我們認為，AIH大鼠血清IL-38和β2GPI水平升高與其肝組織病變嚴重程度密切相關，血清IL-38和β2GPI水平可能是反映AIH肝損傷的良好指標。盡管我們還沒有證實血清IL-38和β2GPI水平變化是否為AIH肝損傷的誘因，但兩者水平的變化能夠在一定程度上預示肝組織病變的進展。

綜上所述，隨著肝組織病變的加重，AIH大鼠血清IL-38水平隨之降低，而血清β2GPI水平隨之升高，為進一步揭示AIH的發(fā)生和發(fā)展機制奠定了理論基礎。監(jiān)測血清IL-38和β2GPI水平可能有助于對AIH病情進行評估，進而為及時采取干預方案提供科學的指導。本研究未檢測AIH動物肝組織兩種細胞因子表達及其基因水平變化情況，后續(xù)研究需對這些問題予以闡明，將為AIH發(fā)病機制研究提供更多的視角，從而為制定干預措施提供方向性的指導。