朱澤業(yè) 邵 波

(1.浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院 環(huán)境工程專業(yè)，杭州 310000)

引言

個人護理產(chǎn)品((personal care products，PCPs)是與人們?nèi)粘Ｉ蠲芮邢嚓P(guān)的新型污染物，屬于PPCPs(藥品和個人護理產(chǎn)品)的一類。自1990年代后期以來，美國和歐洲的許多國家一直在研究這些物質(zhì)的理化性質(zhì)、去除機制、分析測試和生態(tài)毒性。近年來，我國也逐步開展了相關(guān)的研究[1]。近幾年，PCPs在水和大氣等環(huán)境介質(zhì)中被檢測到。這些物質(zhì)主要以尿液和糞便的形式釋放到環(huán)境中。根據(jù)對土壤等環(huán)境介質(zhì)的檢測，土壤中PCPs的檢測頻率也開始逐漸增加，造成“持續(xù)性”環(huán)境污染現(xiàn)象。PCPs在環(huán)境中的殘留濃度雖然不高，但分布廣泛，成分復雜多樣。但長期低劑量接觸會對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成不同程度的破壞[2]。因此，開展針對PCPs對土壤的生態(tài)影響就極為重要。

對羥基苯甲酸酯類作為常見的食用防腐劑已廣泛應(yīng)用于食品[3]、藥品[4]、化妝品及各類兒童制品[5]，主要包括對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben，MP)、乙酯(ethylparaben，EP)、丙酯(propylparaben，PP)和丁酯(butylparaben，BP)等。對羥基苯甲酸酯長期以來被認為是一種安全有效的防腐劑和抗菌劑，常用作普遍的食品防腐劑，也用于制藥、皮革等其他行業(yè)。這些物質(zhì)在人體內(nèi)的主要代謝途徑是血液和尿液，殘留量少，說明它們具有一定的累積作用。但近年來研究發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸酯類污染物對雄果蠅[6]的生殖有一定的毒性以及早孕小鼠著床期子宮內(nèi)膜功能也存在一定的毒害作用[7]，說明其對人體健康可能造成一定的威脅，但目前對土壤微生物的毒性效應(yīng)未有相關(guān)研究。

異噻唑啉酮類化合物是世界范圍內(nèi)廣泛使用的新型殺菌劑，其降解過程和降解產(chǎn)物對生態(tài)環(huán)境的影響很大?？ㄋ墒?-甲基-4-異噻唑啉-3-酮(MI)和2-甲基-5-氯-4-異噻唑啉-3-酮(CMI)及無機鹽穩(wěn)定劑的混合物，通常CMI：MI=3：1[8]。卡松是一種優(yōu)良的殺菌劑，廣泛用于成品、化妝品、洗發(fā)水和護發(fā)素的成分中，是一種抑制微生物生長的防腐劑?？ㄋ删哂泻軓姷纳锘钚?，可以抑制細菌并殺死它們?？山鉀Q真菌感染引起的發(fā)酵、霉變、破壞、細菌過多等問題。還可用于化妝品、洗滌劑、工業(yè)消毒水、機床冷卻液、油漆等，因為它對細菌粘液有滲透作用。作為一種環(huán)保型殺菌“綠色產(chǎn)品”，應(yīng)用范圍廣泛。此類物質(zhì)通常隨生活和工業(yè)廢水進入環(huán)境水體條件，通過降解反應(yīng)在環(huán)境中被消化，同時受一定pH值、重金屬等影響，降解速率不同，對環(huán)境有害，對水生環(huán)境和水生生物影響效果越來越嚴重。呂鵬[9]的研究實驗證實其對斑馬魚的胚胎具有一定毒性，影響胚胎的血管發(fā)育、心率和體長等，所以其潛在的環(huán)境與健康風險不容忽視。

土壤酶是土壤的組成成分之一，是一種具有加速土壤生化反應(yīng)速率功能的蛋白質(zhì)[10，11]，在土壤生物化學過程中，它參與了許多與物質(zhì)循環(huán)和能量流動有關(guān)的反應(yīng)，可以說，不僅僅是土壤中的有機物質(zhì)過氧化氫的執(zhí)行者，也是植物營養(yǎng)素的活性庫[12]。研究表明，土壤酶活性的高低可以表征土壤微生物活性的高低，也可以反映土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和遷移能力的強弱。而且它對環(huán)境中重要的外部因素引起的變化非常敏感[13，14]。因此，在幾乎所有生態(tài)系統(tǒng)的監(jiān)測和研究中，土壤酶活性的檢測已成為污染土壤生態(tài)毒理診斷的重要指標之一。

本研究通過測定PCPs中常用殺菌劑卡松和對羥基苯甲酸酯類中對羥基苯甲酸乙酯單獨和復合污染下，對土壤酶(過氧化氫酶、蔗糖酶、脲酶)活性的影響以及對植物生長的毒性作用，來評估卡松和對羥基苯甲酸乙酯污染的毒性效應(yīng)，旨在為個人護理品(PCPs)污染物的生態(tài)毒性和潛在健康風險的評價提出科學依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 供試土壤

土壤來自五點取樣法提供的樣品，樣品取自拱墅區(qū)。攪拌均勻后，去除土壤表面的雜草和枯葉，選擇耕地深度(0 cm-15 cm)進行取樣。清除碎石和植物殘骸后，取回的土樣立即通過10目篩網(wǎng)備用。一部分用于測定土壤的理化性質(zhì)，如表 1 所示。剩余的土壤在(25±1)℃恒溫箱內(nèi)預培養(yǎng)7天后進行后續(xù)實驗。

表1 供試土壤理化性質(zhì)

1.2 實驗儀器和試劑

30%過氧化氫、硫酸、次氯酸鈉、二硝基水楊酸(上海凌峰化學試劑有限公司)、高錳酸鉀、蔗糖(廣東光華科技股份有限公司)磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(湖州湖試化學試劑有限公司)、葡萄糖、酒石酸鉀鈉硫酸銨(西隴化工股份有限公司)尿素、檸檬酸(國藥集團化學試劑有限公司)氫氧化鉀、氫氧化鈉(杭州蕭山化學試劑廠)、苯酚(永華化學科技有限公司)、無水乙醇(安徽安特食品股份有限公司)、甲醇、丙酮、甲苯(杭州雙林化工試劑有限公司)均為分析純，水為二次沸騰蒸餾水。

燒杯、三角瓶、玻璃棒、漏斗、電子天平、雙面濾紙、試管及試管架、移液管、可見光分光光度計等。

1.3 酶活性試驗方法

稱取200 g試驗土壤放入500 mL錐形瓶中，加入適量溶液使土壤中對羥基苯甲酸乙酯和卡松的濃度分別為50 mg/L、200 mg/L、1000 mg/L、5g/L，同時設(shè)置空白對照(空試驗組不加任何農(nóng)藥，只加等量的蒸餾水)對羥基苯甲酸乙酯和卡松加入土壤中，充分混合。前測每3天測量一次，在培養(yǎng)3、6中，9天、12天、15天、18天、21天、24天、27天和30天定期取樣，每個測量組的每個濃度重復取2個樣品，每次測量的取樣量約為2.00 g，取樣后，將每個樣品用保鮮膜包好，放入25 ℃恒溫箱中保存。土壤脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法[15]測定；土壤過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法[16]測定；土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法[16]測定。

1.4 PCPs對植物生長的影響實驗

選擇大小相同、健康豐盈的鳳仙花種子，按體積比1：3加入80 ℃蒸餾水3浸潤3 min，室溫下蒸餾水浸泡24小時。種子發(fā)白后，調(diào)至直徑9 cm雙層濾紙將其鋪展。在帶濾紙的培養(yǎng)皿中，每盤 20 個種子。向培養(yǎng)皿中加入 10 mL 不同濃度的卡松和對羥基苯甲酸乙酯溶液，并將它們放入人工氣候箱中。每個濃度設(shè)置 3 個平行組。培養(yǎng)設(shè)定溫度為(22±1)℃，濕度為(80±5)%，每24小時加水一次。播種后24小時開始記錄發(fā)芽率，每天定時觀察，直至對照組種子發(fā)芽率不再變化，此時記錄發(fā)芽率。

每盆加入500 g土，加入不同濃度的卡松和對羥基苯甲酸乙酯，攪拌均勻，放置7天，風干。在培養(yǎng)箱中加速種子的發(fā)芽，然后將發(fā)芽的種子10粒移入每盆，保持土壤水分含量在60%-70%，生長周期為7天。測定各試驗組種子的芽長，計算芽長抑制率。

1.5 分析方法

1.5.1 標準曲線的繪制

脲酶標準曲線：

用移液管吸取10 mL氮的標準溶液，用容量瓶定容至100 mL，充分搖勻。從其中分別吸取0 mL、1.00 mL、3.00 mL、5.00 mL、7.00 mL、10.00 mL、13.00 mL移至50 mL比色管中，加水至20 mL，再加入4 mL苯酚鈉溶液，充分混合。緊接著加入3 mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，靜置20 min后，用蒸餾水稀釋至刻度。將顯色液在可見光光度計上于578 nm處，以1 cm比色皿進行比色測定，以試劑空白為參比。以標準溶液氮含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線如圖1。

蔗糖酶標準曲線：

用移液管分別取0 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、15 mL葡萄糖工作液于50 mL容量瓶中，加入3 mL，5-二硝基水楊酸溶液，搖勻后置于沸水中加熱5 min，之后迅速在自來水流下冷卻3 min，用蒸餾水定容至刻度。搖勻后在508 nm波長處比色測定吸光值，記錄整理并繪制標準曲線如圖2。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一實驗中不同濃度的卡松、對羥基苯甲酸乙酯對土壤酶活性的影響

2.1.1 過氧化氫酶單一作用實驗

圖1 脲酶活性標準曲線表

圖2 蔗糖酶活性標準曲線表

圖3 不同濃度的卡松(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤過氧化氫酶活性柱狀圖

圖4 不同濃度的對羥基苯甲酸乙酯(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤過氧化氫酶活性柱狀圖

外界污染物一旦進入土壤，就會通過氧化代謝作用被微生物分解，以降低其對微生物本身的毒性，同時為了保護自身免受氧化劑-過氧化氫的傷害，它必須產(chǎn)生過氧化氫酶來分解體內(nèi)殘留的過氧化氫。因此，微生物在初期受到污染物干擾時，會產(chǎn)生顯著的過氧化氫酶活化作用。隨著微生物對污染物的適應(yīng)能力增強，這種活化作用逐漸減弱，最終恢復到穩(wěn)定狀態(tài)。圖1為卡松對土壤過氧化氫酶活性的影響 。由圖3可知，卡松在低濃度(0.05 g/L-0.2 g/L)時，前3天時呈抑制狀態(tài)，從第6到第21天酶活性呈促進作用；當暴露24天時，卡松的酶活性呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，逐漸與空白對照組酶活性接近。圖4為對羥基苯甲酸乙酯對土壤過氧化氫酶活性的影響。由圖2可知，在前21天暴露時，土壤酶活性呈促進趨勢。到暴露時間為24天時，土壤過氧化氫酶活性也趨于平穩(wěn)狀態(tài)。說明實驗初期，卡松、對羥基苯甲酸乙酯對土壤過氧化氫酶基本上表現(xiàn)出活化作用，過氧化氫酶活性呈顯著上升趨勢。隨著土壤微生物對卡松、對羥基苯甲酸乙酯的適應(yīng)性逐漸增強，它們的加入逐漸減慢了脅迫反應(yīng)，從而在隨后的試驗階段，各處理土壤樣品中的過氧化氫酶活性逐漸恢復到穩(wěn)態(tài)，過氧化氫酶的活性在每個處理土壤之間的差異就不那么顯著。

2.1.2 脲酶單一作用實驗

圖5 不同濃度的卡松(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤脲酶活性柱狀圖

圖6 不同濃度的對羥基苯甲酸乙酯(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤脲酶活性柱狀圖

供試土壤脲酶活性受到卡松的變化如圖5所示，隨著暴露時間的增長，各處理組的(包括對照組)土壤脲酶活性基本上呈現(xiàn)出酶活性先抑制再促進再抑制最后促進的趨勢；同一處理時間，土壤脲酶活性在不同濃度卡松處理下的表現(xiàn)并不一致。與對照組相比，受到50 mg·L-1-200 mg·L-1濃度處理的組在前12天受到抑制作用，其中1000 mg·L1卡松處理組在第6天時酶活性顯著下降，表現(xiàn)為對土壤脲酶活性的抑制；1000 mg·L-1-5000 mg·L-1卡松處理組在第24 天時顯著升高，表現(xiàn)為對土壤脲酶活性的促進作用；處理后第21 天，各濃度處理的土壤脲酶活性均高于対照組，且隨著時間的延長，各濃度組的酶活性增加呈上升的趨勢，在1000 mg·L-1處理下的酶活性受卡松的影響最明顯。對羥基苯甲酸乙酯處理后，低濃度處理(50 mg/L、200 mg/L)的土壤脲酶活性得到一定的抑制，其中200 mg/L濃度的抑制時間比高濃度組的長，從21天開始才起促進作用，后面逐漸恢復到對照水平；高濃度處理(1000 mg/L、5000 mg/L)在試驗開始后就抑制了土壤脲酶活性，且抑制效果非常顯著，且這種抑制作用在第9天時達到最大值，隨后酶活性開始上升。隨著試驗時間的延長，高濃度處理土壤脲酶活性開始慢慢恢復，直到27天逐漸恢復到對照水平。

2.1.3 蔗糖酶單一作用實驗

圖7 不同濃度的卡松(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤蔗糖酶活性柱形圖

圖8 不同濃度的對羥基苯甲酸乙酯(0.05 g/L-5 g/L)暴露下的土壤蔗糖酶活性柱形圖

由上圖可知，土壤蔗糖酶活性受到明顯的抑制，卡松在12天時抑制作用達到最高峰，200 mg/L的酶活性抑制時間最長，到24天后酶活性開始恢復，到28天后，所有處理組的土壤蔗糖酶活性恢復到對照水平左右，30天時酶活性都高于對照組，起促進作用。對羥基苯甲酸乙酯在9天時抑制作用達到最高峰，200 mg/L的酶活性抑制時間也是最長，低濃度組(50 mg/L、200 mg/L)在24天后酶活性開始上升，高濃度組(1000 mg/L、5000 mg/L)在27天左右酶活性開始上升，到第30天時，卡松和對羥基苯甲酸乙酯的酶活性都恢復到対照組水平左右。蔗糖酶是表征土壤生物活性的一種重要水解酶。一般來說，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越強。因此，轉(zhuǎn)化酶不僅可以表征土壤生物活性的強弱，而且可以作為評價土壤成熟度和肥力的重要指標之一。本研究發(fā)現(xiàn)土壤蔗糖酶活性在使用卡松后受到了抑制，卡松的濃度越高，抑制作用越明顯，后期可以恢復到對照水平。這可能是由于卡松能夠作為一類殺菌劑，對蔗糖酶的微生物生存和數(shù)量造成影響，抑制其生長，從而使蔗糖酶活性被抑制，但隨著卡松在環(huán)境中不斷降解，卡松的含量逐漸減少，蔗糖酶活性恢復到對照值并逐漸上升。對羥基苯甲酸乙酯作為一種防腐劑，經(jīng)趙曉俊[6]等人的研究表明，其對生物具有一定的生殖毒性，可能對羥基苯甲酸乙酯抑制了土壤中蔗糖酶微生物的繁殖，造成了蔗糖酶活性的喪失，隨著對羥基苯甲酸乙酯在環(huán)境中的降解作用，蔗糖酶活性也開始逐漸上升。

2.4 PCPs對植物生長的影響實驗

①鳳仙花種子發(fā)芽率的測定

表2 不同濃度的卡松對鳳仙花種子發(fā)芽率的影響

表3 對羥基苯甲酸乙酯對鳳仙花種子發(fā)芽率的影響

由上述圖表可知，卡松濃度為0.05 g/L-5 g/L時，5000 mg/L的卡松對鳳仙花種子的發(fā)芽抑制率最高。1000 mg/L的卡松時鳳仙花種子的發(fā)芽率最高，抑制率最小。低濃度(50 mg/L、200 mgL)時鳳仙花種子發(fā)芽率相同，抑制效果較弱。對羥基苯甲酸乙酯在低濃度(50 mg/L、200 mg/L)時鳳仙花種子的發(fā)芽較高，抑制效果較低；在高濃度(1000 mg/L、5000 mg/L)較低，抑制效果較高。在200 mg/L時，抑制效果最不明顯。

②鳳仙花種子生長狀況的測定

表4 不同濃度的卡松和對羥基苯甲酸乙酯對鳳仙花種子的根長抑制

由上述表可知，卡松對鳳仙花的根長抑制效果比羥基苯甲酸乙酯明顯。卡松在50 mg/L和5000 mg/L時，對鳳仙花的根長抑制效果最明顯，對羥基苯甲酸乙酯在1000 mg/L對鳳仙花的根長有一定的抑制效果，其他濃度抑制效果不明顯。

表5 復合物對鳳仙花的發(fā)芽率和根長抑制

2.5 卡松和對羥基苯甲酸乙酯對土壤微生物的聯(lián)合毒性實驗

復合染毒實驗采用正交法和控制變量法，分別以卡松濃度和對羥基苯甲酸乙酯濃度為變量設(shè)置實驗組。每組設(shè)置3個平行組，實驗結(jié)果取平均值。具體設(shè)置如圖9-11所示。

由圖9可知，復合濃度下過氧化氫酶的活性呈上升趨勢，起促進作用。由圖10可知，復合濃度下脲酶隨著暴露時間的延長，酶活性逐漸下降，起抑制作用。在第12天時，酶活性為0，土壤脲酶失去活性。由圖11可知，復合濃度下蔗糖酶的活性呈上升-下降-上升趨勢。在前15天，酶活性被激活，起促進作用。第15天后，酶活性受到抑制，到21天左右，酶活性恢復到対照組水平。

3 結(jié)論

綜上所述，除了過氧化氫酶外，卡松的使用總體上會抑制其他幾種土壤酶的活性，低濃度(200 mg/L)的卡松對各種酶的影響時間比較持久，且到試驗后期基本都能恢復到對照水平，高濃度處理影響土壤酶的活性時間較短，但是最終都能恢復到對照水平。對羥基苯甲酸乙酯對過氧化氫酶有一定的促進作用；對脲酶、蔗糖酶都有一定的抑制作用，脲酶在1000 mg/L時抑制效果最明顯；蔗糖酶低濃度抑制時間比高濃度長一點。植物實驗中卡松高濃度時抑制發(fā)芽率較明顯，卡松低濃度對抑制效果較弱；根長抑制率中50 mg/L、5000 mg/L時抑制效果明顯，50 mg/L、200 mg/L時的抑制效果較接近，但對羥基苯甲酸乙酯抑制發(fā)芽率不明顯。但在濃度為1000 mg/L時對鳳仙花的根長有一定的抑制效果，其他濃度抑制效果不明顯。復合下，脲酶失去活性，過氧化氫酶呈促進效果但后期酶活性恢復到對照水平，而蔗糖酶活性呈上升-下降-上升趨勢。

圖9 復合濃度(1 g/L-1 g/L)下的暴露下的土壤過氧化氫酶活性折線圖

圖10 復合濃度(1g/L-1g/L)下的暴露下的土壤脲酶活性折線圖

圖11 復合濃度(1 g/L-1 g/L)下的暴露下的土壤蔗糖酶活性折線圖

4 展望

污水處理廠的污泥和動物糞便經(jīng)常被用于農(nóng)田施肥，但是吸附在污泥中的PCPs和動物糞便中代謝不完全的PCPs會給土壤造成的一定的污染。目前關(guān)于土壤中PCPs遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究很少。而土壤酶活性作為檢測土壤肥力的重要指標之一，給土壤中PCPs遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律的發(fā)展提供了新的方向和素材。現(xiàn)有的處理工藝并不能完全去除PCPs[]，也為以后如何治理土壤中的PCPs提供了新的分析?？ㄋ勺鳛橐环N新型殺菌劑，具有高效、低毒、藥效持續(xù)時間長、對環(huán)境安全等優(yōu)點，在海洋防污、工業(yè)循環(huán)冷卻水處理、工業(yè)產(chǎn)品防腐、農(nóng)用殺菌等方面具有廣泛應(yīng)用，通過本次研究卡松對植物生長影響行為及生態(tài)毒性來引起人們的高度重視，使它作為產(chǎn)品能在生產(chǎn)生活中朝日漸流行的綠色趨勢發(fā)展，也將更加有利于規(guī)范PCPs在工業(yè)生產(chǎn)方面的使用。一直以來，對羥基苯甲酸乙酯都被認為是一類安全、有效的防腐抗菌劑，在化妝品、個人護理產(chǎn)品和醫(yī)藥產(chǎn)品等多種消費品中被廣泛使用。然而研究表明該類物質(zhì)具有一定的雌激素效應(yīng)，對人體有一定的生殖毒性。通過本次實驗對羥基苯甲酸乙酯對植物生長影響行為及生態(tài)毒性，為進一步研究該類物質(zhì)對生態(tài)環(huán)境的毒性機制以及對土壤微生物、植物毒性影響等提供實驗數(shù)據(jù)，為該類物質(zhì)的安全性評價提供實驗支撐。