張潤(rùn) 司士輝 扶梅 馮浪霞

中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410083

0 前言

石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM）是一種常用的檢測(cè)負(fù)載質(zhì)量的聲波傳感器，其生物傳感器在應(yīng)用中一直存在非特異性結(jié)合的干擾問(wèn)題，雜質(zhì)附著位點(diǎn)導(dǎo)致對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)存在較大誤差，而分子鍵裂方法可以有效解決這個(gè)問(wèn)題[1]。調(diào)幅調(diào)頻分子鍵裂方法可實(shí)現(xiàn)不同強(qiáng)度分子鍵的差異性斷裂，甩脫掉表面結(jié)合強(qiáng)度較弱的非特異性吸附干擾物，提高生物檢測(cè)的抗干擾性及檢測(cè)精度，可實(shí)現(xiàn)親和性生物傳感界面的原位再生[2]。DULTSEV F N等[3]首次提出了通過(guò)電噪聲監(jiān)測(cè)抗原抗體鍵裂的方法，分別對(duì)聚苯乙烯與金、鏈霉親和素與生物素以及酰胺鍵進(jìn)行了鍵裂實(shí)驗(yàn)，不同強(qiáng)度的相互作用隨著電壓變化幅值升高依次斷裂。COOPER M A等[4]提出了鍵裂掃描概念（rupture event scanning，REVSTM），通過(guò)鍵裂的方法檢測(cè)細(xì)菌并定量樣品中的細(xì)菌數(shù)，增加QCM的振蕩幅度檢測(cè)細(xì)菌與表面相互作用破裂時(shí)的聲噪聲，可定量至少超過(guò)6個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)10種細(xì)菌。DULTSEV F N等[5]利用QCM快速檢測(cè)乙型肝炎病毒，通過(guò)病毒從QCM表面振蕩脫離的電壓，可檢測(cè)大約140～150個(gè)單獨(dú)的病毒。YUAN Y J等[6]設(shè)計(jì)了生物素和鏈霉親和素相互作用的鍵裂實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)QCM的基頻及3次諧波附近的窄帶頻率響應(yīng)和“噪聲”信號(hào)監(jiān)測(cè)鍵裂過(guò)程，并根據(jù)鍵能大小區(qū)分抗原。KHOBRAGADE S等[7]通過(guò)在石英晶體諧振器固定抗大腸桿菌適體在非線(xiàn)性范圍內(nèi)檢測(cè)大腸桿菌（E. coli），得到3次傅立葉諧波（3f）電流的變化與大腸桿菌濃度定量相關(guān)性，靈敏度為105～108 cfu/mL。通過(guò)諧振調(diào)幅引起分子鍵裂得到頻率響應(yīng)和電噪聲響應(yīng)，可以檢測(cè)晶體表面負(fù)載質(zhì)量并區(qū)分不同生物分子附著親和力，得到相應(yīng)的力學(xué)參數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)。本研究基于DDS數(shù)字信號(hào)發(fā)生器開(kāi)發(fā)了一種調(diào)幅調(diào)頻石英晶體微天平頻率檢測(cè)系統(tǒng)，與文獻(xiàn)中應(yīng)用的方法不同，采用了差頻的方法得到分子鍵裂時(shí)的頻率信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)諧振調(diào)幅后的信號(hào)變化，并通過(guò)頻率信號(hào)和激勵(lì)電壓區(qū)分不同生物分子間相互作用的強(qiáng)弱。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

9.98 MHz石英晶體（深圳市仁路科技有限公司）；AD 9854信號(hào)發(fā)生器（美國(guó)Analog Devices公司）；PID控溫系統(tǒng)（日本株式會(huì)社），流動(dòng)注射泵（南京潤(rùn)澤流體控制設(shè)備有限公司）。KCl、NaCl、Na2HPO4、KH2PO4等試劑為分析純，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；免疫球蛋白IgG、蛋白質(zhì)A等為分子生物學(xué)級(jí)，購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

1.2 分子鍵裂型QCM生物傳感系統(tǒng)原理及構(gòu)造

1.2.1 儀器原理

分子鍵裂型石英晶體微天平生物傳感系統(tǒng)工作原理是通過(guò)Arduino單片機(jī)控制數(shù)字信號(hào)發(fā)生器DDS 9854產(chǎn)生頻率可調(diào)的正弦波，并激勵(lì)9.98 MHz鍍金電極的壓電石英晶體。本系統(tǒng)采用了石英晶體自主諧振電路法和被動(dòng)激勵(lì)振蕩法兩種方式。運(yùn)行過(guò)程中，在低振幅（2 V）下以自主諧振電路法測(cè)定晶體頻率；在諧振調(diào)幅模式時(shí)，通過(guò)高速繼電器切換到被動(dòng)調(diào)幅激勵(lì)電路，由數(shù)控放大器調(diào)節(jié)不同激勵(lì)電壓實(shí)現(xiàn)諧振調(diào)幅，增大石英晶體表面剪切動(dòng)量，使晶體表面物質(zhì)搖擺速度增快，從而實(shí)現(xiàn)分子鍵裂。儀器原理圖如圖1所示。

1.2.2 DDS信號(hào)發(fā)生器

采用美國(guó)ADI公司AD 9854高度集成的芯片，由Arduino控制產(chǎn)生頻率和相位都非常穩(wěn)定、幅度編程可調(diào)的正弦信號(hào)。通過(guò)直接數(shù)字頻率合成（direct digital synthesis，DDS）技術(shù)以數(shù)控振蕩的方式產(chǎn)生頻率和相位可控的正弦波，并激勵(lì)壓電石英晶體，通過(guò)信號(hào)發(fā)生器中的D/A轉(zhuǎn)換器將數(shù)字信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)槟M信號(hào)，產(chǎn)生高分辨率、低噪聲、高精度的頻率信號(hào)。DDS信號(hào)發(fā)生器原理圖如圖2所示。

1.2.3 差頻方法

分子鍵裂型石英晶體微天平生物傳感系統(tǒng)采用了差頻方法來(lái)獲得諧振頻率，以DDS信號(hào)發(fā)生器內(nèi)可調(diào)的頻率信號(hào)作為參考頻率源，不斷調(diào)節(jié)使其與測(cè)量晶體頻率值在一定范圍內(nèi)，通過(guò)差頻電路得到測(cè)量晶體頻率值與基準(zhǔn)頻率源的差值，即差頻信號(hào)值，從而提高測(cè)量精度。參考頻率信號(hào)和檢測(cè)頻率信號(hào)經(jīng)混頻電路，輸出即為差頻值。在相同電路中得到差頻值，可有效減小溫度、電容、晶體老化、閾值電壓等對(duì)檢測(cè)的影響。

1.2.4 傳感系統(tǒng)構(gòu)造

諧振調(diào)幅壓電石英晶體分子鍵裂生物傳感系統(tǒng)包括軟件部分和硬件部分，實(shí)物和內(nèi)部結(jié)構(gòu)如4圖所示。軟件部分包括信號(hào)放大模塊、數(shù)據(jù)處理模塊、頻率存儲(chǔ)模塊；硬件部分包括差頻電路板、調(diào)幅電路板、易拆卸檢測(cè)池（9.98 MHz晶振）、流動(dòng)注射泵、SD卡存儲(chǔ)器、7英寸液晶顯示觸摸屏、PID控溫模塊、USB電腦串口。石英晶體工作頻率為5～90 MHz，頻率分辨率為±1 Hz?？?倍、5倍調(diào)幅諧振。10 MHz以下電壓可達(dá)21.00 V，分辨率為1 V，激勵(lì)電壓調(diào)節(jié)精度為±10 mV。

根據(jù)傳感系統(tǒng)的要求，以及目前的微電子技術(shù)，諧振調(diào)幅傳感系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)為圖5所示的電源、DDS信號(hào)發(fā)生、QCM、信號(hào)采集處理及其他5個(gè)模塊。

諧振調(diào)幅生物傳感系統(tǒng)主要分為5個(gè)模塊，各模塊功能為：（1）電源模塊：在室外，通過(guò)兩個(gè)12 V的移動(dòng)電源供電；在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，通過(guò)電源適配器給儀器供電并使用LM 2596電源調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)電源，保證儀器電壓穩(wěn)定正常；（2）DDS信號(hào)發(fā)生模塊：?jiǎn)纹瑱C(jī)Arduino控制DDS 9854產(chǎn)生可調(diào)正弦波，以振蕩法激勵(lì)QCM使其振蕩，信號(hào)放大經(jīng)過(guò)低通濾波器（LPF）之后相敏檢波，得到參考頻率差，通過(guò)數(shù)控放大器（AMP）調(diào)節(jié)不同激勵(lì)電壓；（3）QCM模塊：采用AT切型9.98 MHz雙面金電極石英晶體，設(shè)計(jì)了方便拆卸的石英晶體檢測(cè)池和配套的電極底座，如圖6所示；（4）信號(hào)采集處理模塊：QCM響應(yīng)信號(hào)由濾波器濾波處理后，經(jīng)過(guò)模數(shù)轉(zhuǎn)換器（ADC）后，再經(jīng)放大器（AMP）并聯(lián)電路增益電壓信號(hào)；（5）其他模塊，包括流動(dòng)注射系統(tǒng)，如圖6（c）所示、PID控溫系統(tǒng)，如圖6（d）所示、散熱系統(tǒng)、數(shù)據(jù)顯示存儲(chǔ)模塊等。

1.2.5 軟件系統(tǒng)

本系統(tǒng)采用C++語(yǔ)言，對(duì)Arduino、PID控溫系統(tǒng)和流動(dòng)注射系統(tǒng)進(jìn)行編譯。打開(kāi)儀器后，在選擇面板選擇等幅（2 V）模式和調(diào)幅電壓模式，設(shè)置溫度及流速，采集并自動(dòng)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器性能測(cè)試

參考頻率默認(rèn)為10.00 MHz。使用9.98 MHz的壓電石英晶振，開(kāi)機(jī)進(jìn)行自主等幅諧振（振蕩電壓2 V）頻率檢測(cè)，待初始頻率穩(wěn)定，選擇5.00～12.00 V電壓調(diào)幅。先以3 min的等幅模式測(cè)基準(zhǔn)頻率，再自動(dòng)調(diào)至5.00 V激勵(lì)模式，調(diào)幅30 s，按中斷鍵后記錄調(diào)幅后的頻率信號(hào)3 min；之后為30 s的12.00 V調(diào)幅模式，記錄調(diào)幅后的頻率信號(hào)，檢測(cè)儀器在氣相、液相（純水、PBS中）調(diào)幅后頻率的變化穩(wěn)定性。

2.1.1 儀器的穩(wěn)定性

在空氣中，儀器在等幅模式的差頻響應(yīng)值見(jiàn)圖7（a），頻率信號(hào)大致為一條直線(xiàn)。在檢測(cè)50 min內(nèi)，以基頻為參考，頻率相對(duì)偏差為0.981 Hz，波動(dòng)不超過(guò)±1 Hz，頻率變化值為0.08 Hz/min。在調(diào)幅模式下，頻率響應(yīng)見(jiàn)圖7（b），5.00 V和12 .00 V電壓激勵(lì)30 s后，頻率變化在10 s內(nèi)迅速恢復(fù)穩(wěn)定。不同調(diào)幅電壓激勵(lì)后的差頻值見(jiàn)圖7（c），總的頻率變化為11 Hz，平均變化0.65 Hz/V，說(shuō)明在氣相中儀器在不同調(diào)幅電壓下頻率響應(yīng)稍有波動(dòng)，但在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定。在純水中，儀器在等幅模式的差頻響應(yīng)見(jiàn)圖7（d），頻率響應(yīng)幾乎為一條直線(xiàn)，在檢測(cè)的30 min內(nèi)，頻率變化相對(duì)偏差為1.756 Hz，變化值為0.33 Hz/min。儀器在調(diào)幅模式下的頻率響應(yīng)見(jiàn)圖7（e），在5.00 V和12.00 V電壓激勵(lì)30 s后，頻率迅速升高，但在30 s內(nèi)恢復(fù)基頻。在不同調(diào)幅電壓激勵(lì)后的差頻值見(jiàn)圖7（f），總的頻率變化為24 Hz，平均變化1.41 Hz/V。在純水環(huán)境中，儀器測(cè)定的頻率波動(dòng)較氣相中更大，主要是受溫度和激勵(lì)電壓變化的影響。以上實(shí)驗(yàn)表明，儀器在氣相和液相中晶體都能正常起振，穩(wěn)定性良好。

2.1.2 流動(dòng)注射條件下的穩(wěn)定性

在等幅模式下，轉(zhuǎn)動(dòng)流速選擇旋鈕，通過(guò)流動(dòng)注射泵以不同流速注入磷酸緩沖溶液（PBS），3 min內(nèi)不同流速下的頻率信號(hào)響應(yīng)如圖8（a）所示，在同流速下，頻率信號(hào)幾乎為一條直線(xiàn)，調(diào)節(jié)不同流速后頻率稍有變動(dòng)，但仍穩(wěn)定。不同流速下注入PBS的頻率信號(hào)變化的相對(duì)偏差如圖8（b）所示，不同流速下頻率相對(duì)偏差小于4 Hz，在500 mL/min流速下相對(duì)偏差最小為1.625 Hz，說(shuō)明儀器在流動(dòng)注射PBS溶液下，晶體正常起振且信號(hào)穩(wěn)定。

在等幅條件下，以500 mL/min流速流動(dòng)注入PBS溶液，差頻變化如圖9（a）所示，頻率響應(yīng)大致為一條直線(xiàn)，在0～17 Hz的范圍內(nèi)波動(dòng)，在22 min內(nèi)，頻率平均變化值為0.766 Hz/min。頻率波動(dòng)較氣相和純水中更大，主要原因是晶體頻率變化與粘度和密度相關(guān)，PBS的粘度和密度比純水大，且頻率信號(hào)容易受溫度的影響。儀器在調(diào)幅模式下流動(dòng)注入PBS的差頻值見(jiàn)圖9（b），在5.00 V電壓激勵(lì)30 s后，頻率幾乎無(wú)變化。在12.00 V電壓激勵(lì)30 s后，頻率迅速升高，在50 s內(nèi)恢復(fù)穩(wěn)定，受調(diào)幅電壓的影響，頻率變化較大，主要是由于溶液粘度和密度的影響，使晶體剪切振動(dòng)加劇，但在短時(shí)間內(nèi)可恢復(fù)穩(wěn)定，不會(huì)影響鍵裂實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在不同調(diào)幅電壓激勵(lì)后的差頻值見(jiàn)圖9（c），頻率變化為28 Hz，平均變化1.65 Hz/V，隨著激勵(lì)電壓升高，頻率變化升高，這主要受溫度及PBS溶液本身性質(zhì)的影響。在流動(dòng)注入PBS溶液下，調(diào)幅電壓激勵(lì)后，晶體可正常起振，且在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 鍵裂實(shí)驗(yàn)

2.2.1 調(diào)幅電壓激勵(lì)抑制蛋白質(zhì)A和IgG結(jié)合過(guò)程

將晶體固定于流動(dòng)注射系統(tǒng)配套檢測(cè)池，打開(kāi)儀器，檢測(cè)初始頻率；待頻率穩(wěn)定，打開(kāi)流動(dòng)注射泵，以500 μL/min的流速注射0.1 mg/mL PBS溶液，當(dāng)溶液流過(guò)晶體，頻率急劇下降；待頻率穩(wěn)定，記錄基本頻率f0，將準(zhǔn)備好的2 mL，包含0.01 mg/mL蛋白質(zhì)A的PBS溶液（pH=7.4）注入流通池中并孵育1 h；將蛋白質(zhì)A固定在導(dǎo)電層表面，然后把不同濃度的IgG的PBS溶液注射到流通池中，以0.1 mg/mL的IgG和0.01 mg/mL蛋白質(zhì)A的相互作用進(jìn)行鍵裂實(shí)驗(yàn)；待結(jié)合穩(wěn)定后開(kāi)啟不同電壓的調(diào)幅模式，激勵(lì)30 s后記錄調(diào)幅后的頻率數(shù)據(jù)。

每次注射IgG后頻率有所降低，說(shuō)明IgG分子與蛋白質(zhì)A結(jié)合被吸附在了QCM的表面。不同濃度下存在吸附和平衡兩個(gè)階段，其中，不同濃度下的頻率變化值如圖10（a）所示，QCM的頻率變化隨著IgG濃度的增大而增大。在不同調(diào)幅電壓下抑制IgG和蛋白質(zhì)A相結(jié)合，結(jié)果如圖10（b）所示，隨著調(diào)幅電壓升高而抑制增加，從5.00 V電壓到20.00 V其抑制率在12.83%到42.78%之間，說(shuō)明在蛋白質(zhì)A和IgG相互作用時(shí)，施加的調(diào)幅電壓越高，抑制二者結(jié)合的效果越明顯。

2.2.2 蛋白質(zhì)A和IgG結(jié)合后的鍵裂響應(yīng)

將蛋白質(zhì)A固定于晶體表面，依次注入0.01 mg/mL的BSA和IgG的PBS溶液，頻率分別下降54 Hz和233 Hz，其頻率變化如圖11（a）所示。待頻率穩(wěn)定后開(kāi)啟調(diào)幅模式，在不同調(diào)幅電壓激勵(lì)下的頻率響應(yīng)如圖11（b）所示。在低電壓調(diào)幅下頻率幾乎無(wú)變動(dòng)，隨著電壓升高，在13 V時(shí)頻率上升了91 Hz，比BSA的結(jié)合下降頻率高，因?yàn)锽SA與蛋白質(zhì)A層結(jié)合較弱，由頻率值可得，BSA和未結(jié)合牢固的IgG被振蕩甩脫。在20.00 V電壓激勵(lì)后，頻率上升153 Hz，在高調(diào)幅電壓下甩脫了65.67%結(jié)合了的IgG。說(shuō)明IgG與蛋白質(zhì)A的相互作用較BSA強(qiáng)，即本傳感系統(tǒng)在不同調(diào)幅電壓下可區(qū)分不同蛋白之間相互作用的強(qiáng)弱。

3 結(jié)論

本文研制的諧振調(diào)幅石英晶體微天平分子鍵裂型傳感系統(tǒng)可實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子鍵裂的過(guò)程，通過(guò)諧振調(diào)幅可抑制分子間的結(jié)合過(guò)程，在短時(shí)間內(nèi)可獲得分子鍵裂前后的差頻信號(hào)，區(qū)分不同強(qiáng)弱的相互作用，簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，可應(yīng)用于表面固定化親和性生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。