王孟麗，布冠好,*，陳復(fù)生，李盤欣，黃亞男

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

2.河南省南街村(集團(tuán))有限公司，河南 漯河 462600

鈣在人體生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著極其重要的作用，人體吸收充分的鈣可以降低患骨質(zhì)疏松、佝僂病的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。目前補(bǔ)鈣制品分為無機(jī)鈣、有機(jī)鈣和螯合鈣，前兩類鈣產(chǎn)品容易在腸道中形成鈣沉積，嚴(yán)重降低了鈣的吸收利用率[4-6]。相比前兩類離子鈣來說，以螯合形式存在的肽鈣具有生物利用率高、穩(wěn)定性高、低生物毒性等優(yōu)點(diǎn)[7-12]，而且其在轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、穩(wěn)定性等方面都要優(yōu)于氨基酸螯合鈣[13-15]，是一種相對(duì)理想的鈣補(bǔ)充劑。

花生是我國(guó)六大油料作物之一，同時(shí)也是非常值得開發(fā)的植物蛋白資源[16-18]。但是目前我國(guó)花生主要用于榨油，花生蛋白資源未得到充分利用，為了減少蛋白質(zhì)資源的浪費(fèi)[19-20]，加強(qiáng)開發(fā)花生蛋白深加工產(chǎn)品成為當(dāng)務(wù)之急?；ㄉ氖腔ㄉ鞍椎纳罴庸ぎa(chǎn)品，其穩(wěn)定性優(yōu)于花生蛋白，可直接被小腸吸收，增強(qiáng)免疫力[21-23]。

關(guān)于肽-鈣螯合物的研究，已有報(bào)道以動(dòng)物性肽-鈣螯合物較多，植物源肽-鈣螯合物有大豆肽-鈣螯合物、玉米肽-鈣螯合物及核桃肽-鈣螯合物等相關(guān)研究，而花生肽-鈣螯合物的研究鮮見報(bào)道。目前肽鈣產(chǎn)品主要是酪蛋白磷酸肽螯合鈣、乳清蛋白肽螯合鈣，產(chǎn)品單一且價(jià)格較高，另外存在螯合率不高且風(fēng)味不佳的問題。如何挖掘高效、低成本的多肽基料來開發(fā)多肽螯合鈣制劑具有十分重要的意義。

作者以富含蛋白且價(jià)格低廉的花生粕為原料，通過復(fù)合酶解控制技術(shù)及螯合反應(yīng)條件的優(yōu)化，制備具有雙重營(yíng)養(yǎng)功能的含鈣量高且風(fēng)味佳的花生肽-鈣螯合物，并利用光譜學(xué)以及熱力學(xué)分析等方法對(duì)其進(jìn)行表征。既可實(shí)現(xiàn)花生蛋白的高值化利用，又為人體補(bǔ)鈣提供了新的途徑，為開發(fā)成本低且易吸收的新型補(bǔ)鈣產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

花生粕：實(shí)驗(yàn)室自制；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶：上海源葉生物科技有限公司；EDTA、鈣指示劑、無水氯化鈣等均為分析純。

L550離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LGJ-10C真空冷凍機(jī)：四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司；HSHZ-B恒溫水浴振蕩器：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；UV-1901紫外光譜儀：北京普析通用儀器有限公司；WQF-510傅里葉紅外光譜儀：北京瑞麗分析儀器有限公司；DSCQ熱重分析儀：美國(guó)TA儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 花生分離蛋白的提取

取一定量花生粕，按照質(zhì)量比10∶ 1加入去離子水并調(diào)節(jié)pH至9.0，50 ℃水浴攪拌1 h，5 000 r/min離心20 min，取上清液繼續(xù)調(diào)節(jié)pH至4.5左右，5 000 r/min離心20 min，棄掉上清液，收集沉淀，冷凍干燥即得到花生分離蛋白(蛋白含量86.95%)。

1.2.2 花生肽的制備

1.2.2.1 單酶酶解

取一定量的花生分離蛋白，按照質(zhì)量比20∶ 1加入去離子水，調(diào)整pH值為添加酶制劑的最適pH值，分別加入不同種類的酶進(jìn)行酶解，酶解后在95 ℃條件下滅酶，酶解液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，過濾后取上清液冷凍干燥即為花生肽。

1.2.2.2 雙酶酶解

從1.2.2.1中選取螯合率和水解度最高的酶作為主要的最佳水解酶，在此基礎(chǔ)上復(fù)配風(fēng)味酶，水解酶與風(fēng)味酶復(fù)配最佳比例為3∶ 2，以雙酶同步和雙酶分步2種方式進(jìn)行酶解，酶解液以5 000 r/min離心20 min，收集上清液，冷凍干燥得到花生肽。

1.2.3 花生肽-鈣螯合物的制備

稱取一定量的花生肽加入去離子水配成一定濃度的多肽溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度、pH值后加入一定量的無水氯化鈣混勻進(jìn)行螯合，反應(yīng)結(jié)束后加入無水乙醇溶液，5 000 r/min離心20 min，取沉淀，將其置于冷凍干燥機(jī)中凍干得花生肽-鈣螯合物粉末。

1.2.4 鈣含量及螯合率的測(cè)定

鈣含量測(cè)定：參照GB/T 5009.92—2016中的EDTA滴定法。

螯合率測(cè)定：采用EDTA絡(luò)合滴定法[24]。

1.2.5 酶解產(chǎn)物水解度的測(cè)定

利用茚三酮比色法測(cè)定水解度(DH)[25]。

式中：N1為酶解樣品的游離氮含量，mol/L；N0為花生分離蛋白的游離氮含量，mol/L；N總為總氮含量，mol/L。

1.2.6 單因素試驗(yàn)

分別考察肽鈣質(zhì)量比1∶ 2、2∶ 1、4∶ 1、6∶ 1、8∶ 1、10∶ 1，pH 4、5、6、7、8、9，溫度30、40、50、60、70 ℃，時(shí)間30、40、50、60、70 min條件下花生肽-鈣螯合物的螯合率。

1.2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以螯合率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.2.8 紫外光譜分析

取適量的花生肽及花生肽-鈣螯合物，配制成1 mg/mL的溶液，用紫外分光光度計(jì)在190～400 nm進(jìn)行掃描，測(cè)定花生肽以及花生肽-鈣螯合物的紫外吸收光譜。

1.2.9 紅外光譜分析

取干燥的花生肽及花生肽-鈣螯合物2 mg與適量KBr混勻壓片至透明，利用紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1，測(cè)定花生肽以及花生肽-鈣螯合物的紅外光譜。

1.2.10 熱重分析

分別稱取花生肽及花生肽-鈣螯合物10 mg于坩堝中，將坩堝置于熱重分析儀中，測(cè)定溫度25～600 ℃，升溫速度10 ℃/min，N2流速30 mL/min，記錄樣品實(shí)時(shí)質(zhì)量，計(jì)算并繪制質(zhì)量損失率曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類對(duì)花生蛋白水解度的影響

由圖1可知：花生蛋白的水解度均隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且在水解前期(30～120 min)增加幅度較大，這與酶的高效性有直接關(guān)系；在水解后期(120 min以后)5種蛋白酶水解度的增長(zhǎng)速率都有所下降，但堿性蛋白酶的水解度仍高于其他4種蛋白酶。故選擇堿性蛋白酶為水解花生蛋白的最佳蛋白酶。

2.2 蛋白酶種類對(duì)花生肽-鈣螯合率的影響

由圖2可知，花生肽的鈣螯合率隨著螯合時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降，主要是因?yàn)殡S著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，剛開始水解的肽鏈較多，暴露出來較多的末端氨基酸，能夠促進(jìn)螯合反應(yīng)的進(jìn)行。隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，螯合率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，可能是因?yàn)橐恍┗ㄉ谋焕^續(xù)水解生成更小分子的肽段，而這些小分子肽段不利于與鈣離子的結(jié)合，從而造成螯合率下降。5種蛋白酶中堿性蛋白酶的螯合率最高，因此選擇堿性蛋白酶作為制備花生肽的水解酶。

2.3 酶解方式對(duì)花生肽-鈣螯合率和水解度的影響

由圖3可知，雙酶酶解時(shí)，花生肽-鈣螯合率和水解度有一定的提高，且分步酶解法的花生肽-鈣螯合率和水解度顯著提高。說明加入風(fēng)味蛋白酶后，雙酶酶解可以提升花生肽-鈣螯合率和水解度，此外風(fēng)味蛋白酶能剪切苦肽末端的疏水氨基酸，對(duì)苦味肽進(jìn)行降解以達(dá)到脫苦的目的[26]。因此，采用堿性酶復(fù)配風(fēng)味酶酶解進(jìn)行后續(xù)螯合研究。魏新顏等[13]以淘汰蛋雞為原料，利用木瓜蛋白酶復(fù)配風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物的鈣螯合能力優(yōu)于單酶酶解。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 肽鈣質(zhì)量比

由圖4可知，隨著肽鈣質(zhì)量比的增加，螯合率先增加后基本趨于穩(wěn)定，螯合物中的鈣含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)肽鈣質(zhì)量比為1∶ 2時(shí)，肽未得到充分利用，此時(shí)鈣離子含量過剩，鈣含量較大，但螯合率較低；當(dāng)肽鈣質(zhì)量比為10∶ 1時(shí)螯合率最大，此時(shí)鈣含量較低；當(dāng)肽鈣質(zhì)量比為6∶ 1時(shí)，螯合率基本已增加到最大值，且鈣含量下降趨勢(shì)不顯著，螯合反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。因此，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)將肽鈣質(zhì)量比的中心試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)為6∶ 1。

圖4 肽鈣質(zhì)量比對(duì)花生肽-鈣螯合率、鈣含量的影響

2.4.2 pH值

由圖5可知，隨著反應(yīng)pH值的不斷增大，螯合率和鈣含量均先上升后下降，在pH 8時(shí)，螯合率和鈣含量均達(dá)到最大值。pH值較小時(shí)，過多氫離子會(huì)與肽的氨基結(jié)合，與Ca2+形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系進(jìn)而阻礙肽和鈣離子的配位[27]，不利于形成肽鈣螯合物。pH值過大時(shí)，氫氧根可與鈣離子反應(yīng)產(chǎn)生氫氧化鈣沉淀，也不利于肽鈣螯合物的形成。因此，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)將pH的中心試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)為8。

圖5 pH值對(duì)花生肽-鈣螯合率、鈣含量的影響

2.4.3 螯合時(shí)間

由圖6可知，反應(yīng)30 min后螯合率和鈣含量變化不顯著， 50 min時(shí)螯合率和鈣含量均達(dá)到最大值，時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)螯合率和鈣含量小幅度下降，原因是反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，螯合物可能不穩(wěn)定而發(fā)生分解[14]。說明螯合反應(yīng)是快速反應(yīng)，因此，選定螯合時(shí)間為50 min，在響應(yīng)面試驗(yàn)中不再研究螯合時(shí)間對(duì)花生肽-鈣螯合率的影響。

圖6 時(shí)間對(duì)花生肽-鈣螯合率、鈣含量的影響

2.4.4 螯合溫度

由圖7可知，隨著溫度的升高，螯合率和鈣含量均先上升后下降，在50 ℃時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)溫度升高時(shí)，分子之間發(fā)生碰撞，鈣離子與氨基酸殘基結(jié)合概率增大，螯合率上升。溫度繼續(xù)升高，花生肽的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子之間會(huì)產(chǎn)生團(tuán)聚，使可參與鈣螯合的基團(tuán)減少，螯合率下降，因此，在響應(yīng)面設(shè)計(jì)時(shí)將溫度的中心試驗(yàn)點(diǎn)設(shè)為50 ℃。

圖7 溫度對(duì)花生肽-鈣螯合率、鈣含量的影響

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.5.1 響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。對(duì)肽鈣質(zhì)量比、pH值、溫度3個(gè)因素進(jìn)行線性回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程模型。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=73.32+7.67X1+1.7X2-1.6X3-1.77X1X2+0.77X1X3+0.32X2X3-5.68X12-3.02X22-0.56X32。

表3 回歸模型方差分析

2.5.2 響應(yīng)面分析

由圖8可知，兩個(gè)因素之間交互作用的等高線曲面形狀為橢圓形，表明肽鈣質(zhì)量比與pH值之間存在顯著的交互作用。肽鈣質(zhì)量比和pH值沿著曲面上升的斜率是陡峭的，且肽鈣質(zhì)量比對(duì)螯合率的影響要大于pH值。結(jié)合Design Expert試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件分析得到最佳螯合條件為肽鈣質(zhì)量比7.185∶ 1、pH 7.547、溫度46.839 ℃，此時(shí)螯合率預(yù)測(cè)值為75.75%。實(shí)際應(yīng)用中調(diào)整肽鈣質(zhì)量比7.2∶ 1、pH 7.5、時(shí)間50 min，溫度47 ℃，得到的螯合率為75.26%， 與預(yù)測(cè)值相差0.5%，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值較為吻合。

圖8 肽鈣質(zhì)量比和pH值交互作用的響應(yīng)面和等高線

2.6 花生肽-鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.6.1 紫外光譜分析

由圖9可知，在螯合反應(yīng)前后，樣品最大吸收波長(zhǎng)的位置以及吸收強(qiáng)度均有所改變。在205 nm處有最大的吸收峰，這是肽中羰基的振動(dòng)引起的一個(gè)特征吸收峰，與鈣螯合后，吸收峰紅移至208 nm，這可能是鈣離子與肽鍵上的羰基發(fā)生了反應(yīng)，影響了電子躍遷，導(dǎo)致吸收峰位置和強(qiáng)度發(fā)生改變[14]。另一個(gè)吸收峰出現(xiàn)在270 nm左右，這主要是多肽中的芳香族氨基酸構(gòu)象變化所引起的紫外吸收特性[28]。鈣離子與肽中的芳香族氨基酸反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)色基團(tuán)的改變以及電子的躍遷使吸收峰位置和強(qiáng)度發(fā)生改變。由紫外掃描光譜可知，肽與鈣離子作用后形成了一種不同于多肽的新化合物。

圖9 花生肽與花生肽-鈣螯合物的紫外光譜圖

2.6.2 紅外光譜分析

圖10 花生肽與花生肽-鈣螯合物的紅外光譜圖

2.6.3 TG熱重分析

由圖11可知，花生肽及肽-鈣螯合物都出現(xiàn)2個(gè)失重區(qū)，從50～150 ℃為吸附水揮發(fā)階段?；ㄉ募半?鈣螯合物在這一階段質(zhì)量損失大約為6%。溫度繼續(xù)升高，會(huì)使肽及螯合物上的化學(xué)鍵在高溫下斷裂，分解花生肽-鈣螯合物的溫度明顯高于花生肽。表明花生肽-鈣螯合可能生成了穩(wěn)定的化學(xué)鍵，分解螯合物需要更多的能量，表明螯合物結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。

圖11 花生肽與花生肽-鈣螯合物的熱重曲線

3 結(jié)論

將花生肽與鈣離子進(jìn)行螯合，研究了不同的酶解方式以及肽鈣質(zhì)量比、pH值、時(shí)間和溫度對(duì)螯合率的影響，并采用光譜學(xué)及熱力學(xué)方法分析螯合前后結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明：堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶雙酶分步酶解的螯合率優(yōu)于單酶及同步酶解；通過響應(yīng)面優(yōu)化的螯合工藝條件為肽鈣質(zhì)量比7.2∶ 1、pH 7.5、時(shí)間50 min，溫度47 ℃，實(shí)際得到的螯合率為75.26%；光譜分析證明了多肽中氨基和羧基參與了螯合反應(yīng)，形成了不同于花生肽的新物質(zhì)。熱重分析表明，花生肽與鈣離子螯合后，生成的花生肽-鈣螯合物具有更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。本研究為新型肽鈣制劑的開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論和技術(shù)指導(dǎo)。