戴純純，陳曉明

（淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇淮安 223300）

蛋白酶是一類能有效催化蛋白質(zhì)水解成蛋白胨、多肽和氨基酸的水解酶，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于肉制品[1-2]、皮革[3]、水產(chǎn)品[4-5]、茶飲[6]等生產(chǎn)領(lǐng)域，其數(shù)量占全球酶制劑銷售總量的60%左右[7]。蛋白酶既可以從動(dòng)植物中獲得，也可以從微生物中獲得。宗紅等人[8]通過硫酸銨鹽析及凝膠層析法從米曲霉中分離純化出蛋白酶，并對該米曲霉所產(chǎn)的蛋白酶的特性進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)該蛋白酶對疏水性氨基酸表現(xiàn)出較強(qiáng)的選擇性，這對于米曲霉在食品中的利用提供了一定的參考意義。王鑫等人[9]利用黑曲霉基因在畢赤酵母進(jìn)行基因重組，并通過優(yōu)化培養(yǎng)獲得高活性的蛋白酶，提高了黑曲霉蛋白酶的pH值及熱穩(wěn)定性，為蛋白酶制劑工業(yè)提供了新的研究思路。鄭麗等人[10]通過芽孢桿菌在豆粕中發(fā)酵獲得蛋白酶，并根據(jù)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得蛋白酶產(chǎn)量達(dá)到約520 U/g。紅曲霉是人類傳統(tǒng)使用的有益菌，不僅可以產(chǎn)天然色素，還具備較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，但研究多為糖化酶[11-13]和酯化酶[14-16]，對其產(chǎn)蛋白酶方面的研究甚少。實(shí)驗(yàn)室從商品紅曲米中分離出高糖化酶活力的紫色紅曲霉MD10，為了挖掘其應(yīng)用潛力，對其產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并探究其部分酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種紫色紅曲霉MD10，實(shí)驗(yàn)室菌保藏。

1.1.2 原料

麩皮，購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)產(chǎn)品市場。

1.1.3 試劑與儀器

試劑：乳酸、乳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硼砂、氫氧化鈉、三氯乙酸、碳酸鈉、酪氨酸、酪蛋白、氯化鈉、氯化鉀、六水合硫酸亞鐵銨、六水合氯化鐵、無水硫酸鎂、無水硫酸銅、一水合硫酸錳、七水合硫酸鋅，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

儀器：UV2550型紫外分光光度計(jì)，上海旦鼎國貿(mào)有限公司產(chǎn)品；GHP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；KG-SX-500型高壓蒸汽滅菌器，KAGOSHIMA SEISAKUSYO（Japan）公司產(chǎn)品；HHS-8S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上?？德穬x器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SPH-2102型立式大容量恒溫培養(yǎng)搖床，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基

（1）平板培養(yǎng)基。改良的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），取46 g于1 000 mL蒸餾水溶解混勻，加入乳酸1 mL。

（2）種子液培養(yǎng)基。葡萄糖60 g/L，蛋白胨30 g/L，硫酸鎂1.5 g/L，硝酸鈉2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，pH值自然。

（3）初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。麩皮30 g，水30 mL，乳酸0.06 mL，置于500 mL錐形瓶中混合均勻。

以上培養(yǎng)基于121℃下滅菌30 min。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

（1）種子液培養(yǎng)。刮取試管斜面中的紅曲霉菌株MD10于已滅菌的種子液中，置于搖床中，30℃下，以轉(zhuǎn)速150 r/min培養(yǎng)2 d至菌絲干重7 g/L。

（2）固態(tài)發(fā)酵基培養(yǎng)。以麩皮固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)量為基準(zhǔn)，吸取一定量的種子液于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)5 d。

1.3.2 蛋白酶活力的測定

參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》中的蛋白酶活力的測定方法[17]。

蛋白酶活力：以1.0 g固體干曲在40℃和pH值3.0條件下，1 min內(nèi)將酪蛋白水解產(chǎn)生1μg氨基酸為1個(gè)酶活單位，以U/g表示。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵參數(shù)條件的優(yōu)化

選擇發(fā)酵溫度、乳酸添加量和接種量進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，培養(yǎng)5 d后檢測樣品的蛋白酶活力，確定該菌株產(chǎn)蛋白酶的最佳參數(shù)。

固態(tài)發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)見表1。

表1 固態(tài)發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)

1.3.4 部分酶學(xué)性質(zhì)的探究

（1）粗酶液制備。稱取10 g干曲，加入pH值3.0的乳酸-乳酸鈉緩沖液200 mL，于4℃下攪拌浸提30 min，過濾后即為粗酶液。

（2）最適溫度。取1 mL酶液（pH值3.0）分別置于25，35，45，55，65，75，85℃條件下與1 mL質(zhì)量濃度為10 g/L的酪蛋白反應(yīng)30 min，酶活最高值對應(yīng)的溫度為最適溫度，以其為100%計(jì)，計(jì)算其他各溫度下的相對酶活。

（3）熱穩(wěn)定性。分別將酶液置于35~75℃的不同溫度下保溫，分別在保溫的不同時(shí)間（30，60，90，120 min）取出酶液，冰浴冷卻，測定其蛋白酶活力，以4℃下放置的同批粗酶液的酶活為對照，計(jì)算不同溫度和時(shí)間下的相對酶活。

（4）最適pH值。用乳酸-乳酸鈉配制pH值為2.5，3.5，4.5，5.5的緩沖液；磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉配制pH值為6.5，7.5，8.5緩沖液；硼砂-氫氧化鈉配制pH值為9.5，10.5，11.5的緩沖液，分別用不同pH值緩沖液配制質(zhì)量濃度為10 g/L的酪蛋白溶液。取1 mL粗酶液與1 mL不同pH值配制的底物反應(yīng)，測定其蛋白酶活力，以最高值對應(yīng)的pH值為最適pH值，以最高酶活為100%，計(jì)算其他各pH值下酶液的相對酶活。

（5）pH值穩(wěn)定性。用不同pH值（3.5~7.5）的緩沖液稀釋等量酶液為不同pH值的酶液，置于55℃下保溫，分別在保溫30，60，90，120 min的時(shí)間取出酶液，冰浴冷卻，測定蛋白酶活力，于4℃下放置的同批酶的活性為100%，計(jì)算不同時(shí)間保溫后的酶的相對活性，用相對酶活評價(jià)pH值對酶穩(wěn)定性的影響。

（6）金屬離子對酶活的影響。在測定蛋白酶活力的體系中，分別加入終濃度為3 mmol/L的金屬離子（Na+，K+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Mg2+，Cu2+，Mn2+，Zn2+）的鹽溶液，以沒有加金屬離子的酶活為100%計(jì)，計(jì)算各金屬離子存在時(shí)酶的相對活性[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，極差RA>RC>RB，說明發(fā)酵溫度（A）對紫色紅曲霉MD10產(chǎn)蛋白酶的影響最大，其次是接種量（C）和乳酸添加量（B）。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果

29℃的發(fā)酵物狀態(tài)見圖1，32℃的發(fā)酵物狀態(tài)見圖2，35℃的發(fā)酵物狀態(tài)見圖3。

圖1 29℃的發(fā)酵物狀態(tài)

圖2 32℃的發(fā)酵物狀態(tài)

圖3 35℃的發(fā)酵物狀態(tài)

2.2 酶學(xué)性質(zhì)的分析

2.2.1 最適溫度溫度對MD10蛋白酶活性的影響見圖4。

圖4 溫度對MD10蛋白酶活性的影響

由圖4可見，該蛋白酶的最適反應(yīng)溫度為55℃。在25~55℃內(nèi)酶活力隨著溫度的升高而逐漸升高，由50%上升到100%；當(dāng)溫度從65℃上升至75℃時(shí)，相對酶活從81%快速降低為22%，說明溫度對該酶的影響較大，85℃時(shí)，僅為5%，基本失活。

2.2.2 熱穩(wěn)定性

MD10蛋白酶的熱穩(wěn)定性見圖5。

圖5 MD10蛋白酶的熱穩(wěn)定性

由圖5可見，在分別保溫了30，60，90，120 min后，各個(gè)溫度的酶活均有下降。當(dāng)溫度在35，45℃時(shí)，該蛋白酶穩(wěn)定性較好，保溫120 min后，酶活分別為80%，70%以上；55~75℃下該蛋白酶不穩(wěn)定，伴隨時(shí)間的增加，酶活持續(xù)降低；75℃保溫120 min后酶活約為7.1%，表明該蛋白酶不適合高溫條件的應(yīng)用場合。

2.2.3 最適pH值

pH值對MD10蛋白酶活性的影響見圖6。

pH值對微生物的生長影響顯著，不同的紅曲霉所產(chǎn)生的蛋白酶的特性均有所差異。由圖6可知，MD10蛋白酶的最適pH值為4.5。在pH值3.5~6.5內(nèi)，酶活保持在80%以上；當(dāng)pH值低于3.5后，酶活急速下降；pH值大于7.5后，酶活下降加快，在pH值9.5~11.5內(nèi)，保持10%左右的活性。結(jié)果可推測，MD10蛋白酶主要是酸性蛋白酶。Masaaki Y等人[20]進(jìn)行了紅曲霉3403菌株酸性蛋白酶的純化并對其性質(zhì)做了探究，其蛋白酶的最適pH值為3.0。

圖6 p H值對MD10蛋白酶活性的影響

2.2.4 pH值穩(wěn)定性

MD10蛋白酶的pH值穩(wěn)定性見圖7。

圖7 MD10蛋白酶的p H值穩(wěn)定性

由圖7可知，在保溫30，60，90，120 min后，pH值3.5、pH值4.5 2個(gè)條件下，酶活較穩(wěn)定，保溫120 min后能保持70%左右的活性；pH值5.5時(shí)，酶活穩(wěn)定性減弱，保溫120 min后，酶活為51%；當(dāng)pH值6.5、pH值7.5時(shí)，隨保溫時(shí)間的延長，酶活持續(xù)降低，保溫120 min后，相對酶活分別為32%和11%。

2.2.5 金屬離子對酶活的影響

金屬離子對酶活的影響見圖8。

圖8 金屬離子對酶活的影響

由圖8可看出，Na+，K+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Mg2+及Zn2+對該蛋白酶酶活有一定的抑制作用，其中Zn2+，Mg2+抑制作用最強(qiáng)；Cu2+，Mn2+對其有促進(jìn)作用，且Mn2+比Cu2+的促進(jìn)效果明顯。

3 結(jié)論

對紫色紅曲霉MD10產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并且對其部分酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測定，得到最佳發(fā)酵條件為溫度32℃，乳酸添加量1‰，種子液接種量9%，在此條件下，其蛋白酶產(chǎn)量達(dá)到338.15 U/g，是優(yōu)化前的2.3倍。其酶學(xué)測定結(jié)果表明，最適溫度為55℃，最適pH值為4.5，酶在35~45℃保持較好的穩(wěn)定性；pH值3.5~5.5內(nèi)保溫120 min后，酶活能保持在68%以上；Na+，K+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，Mg2+及Zn2+對酶活有一定的抑制作用，其中Zn2+，Mg2+抑制作用最強(qiáng)；Cu2+，Mn2+對其有促進(jìn)作用。該研究結(jié)果為紫色紅曲霉MD10在釀酒行業(yè)及酶制劑行業(yè)的應(yīng)用提供一定的科學(xué)數(shù)據(jù)。