王文華　劉觀成　李振亞　何曉松　劉強(qiáng)和　李思維

[關(guān)鍵詞] EGCG;MMP-2;鼻咽癌;侵襲;轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R739.63? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）23-0035-04

Inhibition effect of EGCG on expression of MMP-2 in anti-nasopharyngeal carcinoma

WANG Wenhua1? ?LIU Guancheng1? ?LI Zhenya1? ?HE Xiaosong1? ?LIU Qianghe2? ?LI Siwei3

1.Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin 541001，China; 2.Institute of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery，Guilin Medical University，Guilin? ?541001，China; 3.School of Clinical Medicine of Guilin Medical University，Guilin? ?541001，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of epigallic acid catechin gallate （EGCG） on the expression of MMP-2 gene in nasopharyngeal carcinoma cells，and to reveal the mechanism of EGCG in anti-nasopharyngeal carcinoma. Methods CNE2 cells of poorly differentiated nasopharyngeal carcinoma cell line were cultured in 5%CO2， 37°C for 48 hours， and grouped according to different concentrations of EGCG （0， 40， 80， 160 mg/L）. MTT method was used to detect the proliferation inhibition rate of cultured cells in each group. Transwell invasion assay was used to detect the invasiveness of CNE2 cells after EGCG treatment. Semi-quantitative reverse transcription PCR （RT-PCR） was used to detect the MMP-2 mRNA expression in cells. Western blot was used to detect the protein expression in cultured cells. Results The results of MTT and Transwell invasion experiments suggested that with the increase of EGCG concentration and time of action，the proliferation and invasion ability of CNE2 cells were significantly weakened， compared with the corresponding control group at three different time points after different concentrations， the difference was statisticolly significant （P<0.05）. The degree of gradual inhibition showed a dose-dependent and time-dependent relationship. Semi-quantitative reverse transcription PCR （RT-PCR） and Western-Blot test results showed that with the increase of EGCG concentration and time， MMP-2 mRNA expression and MMP-2 protein expression showed a downward trend（P<0.05）. Conclusion EGCG can reduce the invasion and metastasis of CNE2 cells by inhibiting the expression of MMP-2 in CNE2 cells， to achieve the anti-nasopharyngeal carcinoma effect.

[Key words] EGCG; MMP-2; Nasopharyngeal carcinoma; Invasion; Metastasis

鼻咽癌是我國南部省份高發(fā)的惡性腫瘤。好發(fā)于鼻咽部，位置掩蔽，早期很難發(fā)現(xiàn)，且易于轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的化療藥帶來一定療效的同時，也給人體的正常細(xì)胞和器官帶來了巨大的損害[1-3]，因此尋找一種高效低毒的藥物配合放療提高鼻咽癌患者的療效具有重要的意義。

表沒食子酸兒茶素沒食子酸酯[（-）-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]是綠茶中的主要提取物。國內(nèi)外大量的流行病學(xué)研究及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其對多種腫瘤細(xì)胞均具有抑制作用，并對正常細(xì)胞無明顯毒副作用，但其作用機(jī)制不是很清楚[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，EGCG具有抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡、提高放療效果的作用。盡管國內(nèi)外均對EGCG進(jìn)行大量研究，但其具體作用機(jī)制及相關(guān)作用靶點(diǎn)仍需要進(jìn)一步研究。本研究旨在探討不同濃度EGCG對鼻咽癌細(xì)胞CNE2增殖、侵襲和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）表達(dá)的影響。為進(jìn)一步探討EGCG的抗鼻咽癌作用機(jī)制，為鼻咽癌的防治提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

EGCG（純度≥98%）、PI、RNA酶均購自美國Sigma公司，CNE2細(xì)胞株由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，小牛血清購自杭州四季生物工程材料有限公司，胰酶-EDTA、RPMI-1640（Gibco公司），Matrigel基質(zhì)膠（BD公司），Transw Transwell小室（3428型）（Corning公司），cDNA第一鏈試劑盒及PCR試劑盒（艾德萊公司），β-actin及MMP-2引物（由Invitrogen公司設(shè)計合成）。鼠抗MMP-2單克隆抗體、鼠抗β-actin 單克隆抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（購自北京中杉金橋公司）。EGCG與PBS液配制濃度為10 mg/L，后經(jīng)微孔過濾器（0.22 μm）過濾，分裝保存于4℃冰箱中。

1.2 CNE2細(xì)胞的培養(yǎng)與EGCG作用

以含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h，取對數(shù)生長期生長旺盛的細(xì)胞，細(xì)胞混液密度調(diào)配至2.0×105/mL，接種于96孔板，每孔0.2 mL細(xì)胞混液。再于5%CO2培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)24 h后換液，再添加入EGCG（0、40、80、160 mg/L）處理板孔中的細(xì)胞，每組濃度重復(fù)5個復(fù)孔。

1.3 MTT法檢測CNE2細(xì)胞增殖抑制情況

不同濃度EGCG分別干預(yù)CNE2細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)于溫箱中培養(yǎng)4 h后棄上清，各孔依次加入DMSO 200 μL，振蕩操作10 min至充分溶解結(jié)晶，置96孔板于酶標(biāo)儀上測A490 nm處的吸光值，統(tǒng)計各組細(xì)胞作用后的增殖抑制率并繪制增殖抑制曲線。

1.4 EGCG對CNE2細(xì)胞侵襲能力的影響

室溫下向Transwell侵襲試劑盒的侵襲小室上側(cè)面加入預(yù)熱的無血清培基300 μL，水化基底膜1.5 h左右;取對數(shù)生長期的細(xì)胞，密度調(diào)整至1×106/L;吸棄上室面無血清培養(yǎng)基，下室中加入500 μL RMPI-1640培養(yǎng)基（含10%小牛血清），然后上室面中加入300 μL含0 mg/L、40 mg/L、80 mg/L、160 mg/L EGCG的細(xì)胞懸液，于5%CO2培養(yǎng)箱37°C孵育60 h后，無菌棉簽擦拭去小室里Matrigel膠及未穿透的細(xì)胞，在24孔板中加入 0.1%的結(jié)晶紫500 μL，染色20 min，去離子水清洗2遍后自然晾干。倒置熒光顯微鏡下察看、照片，10×光鏡下統(tǒng)計穿透每個小室膜背面的細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取四周和中間共5個視野計數(shù)。

1.5 RT-PCR檢測EGCG處理后CNE2細(xì)胞MMP-2的表達(dá)

EGCG（0、40、80、160 mg/L）分別作用CNE2細(xì)胞24 h、48 h、后，Trizol試劑裂解細(xì)胞提取其中總RNA，凝膠電泳檢測其完整性。然后逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA第1鏈，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增MMP-2基因。MMP-2引物設(shè)計的上游序列為：5c-GAATGCCATCCCCGATA ACC-3c，下游序列為：5c-GCCAGCTCAGCAGC CTA-3c，產(chǎn)物大小是160 bp;內(nèi)參β-actin引物設(shè)計的上游序列為5c-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3c，引物設(shè)計的下游為5c-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3c，產(chǎn)物大小是416 bp，為美國Invitrogen公司設(shè)計并合成。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的組建，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：取2 μL cDNA 樣本，依次加入12.5 μL Mix，8.5 μL ddH2O，1 μL Forward Primer，1 μL Reverse primer。慢速離心進(jìn)行混勻后，按下列步驟進(jìn)行設(shè)置：94℃預(yù)變性處理5 min后，94℃變性處理30 s，55℃退火處理30 s，72℃延伸處理45 s，以上步驟共循環(huán)35次，最后72℃延伸操作 7 min。選擇β-actin作為內(nèi)參對照，EGCG不同濃度組產(chǎn)物各取5 μL于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳檢測。凝膠分析系統(tǒng)掃描檢測各帶灰度值，測定各組細(xì)胞中MMP-2的相對表達(dá)水平。

1.6 Western-Blot檢測 EGCG處理后CNE2細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)

不同濃度EGCG（0、40、80、160 mg/L）處理CNE2細(xì)胞48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入第1抗體（MMP-2 1∶500，β-actin 1∶500）4℃過夜，PBST洗膜后加入1∶5000稀釋的兔抗鼠第2抗體孵育1 h，PBST洗膜后，ECL顯色曝光，經(jīng)自動電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描并測定蛋白條帶積分密度值（IDV），以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將目的蛋白IDV/β-actin IDV平均值作為MMP-2蛋白水平表達(dá)值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（x±s）表示，多樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素（One-ANOVA）方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，兩兩組間比較分析采用q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGCG作用后CNE2細(xì)胞的增殖抑制情況

EGCG（0、40、80、160 mg/L）干預(yù)CNE2細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，不同EGCG濃度的三個不同時間點(diǎn)與相應(yīng)的對照組相比，鼻咽癌CNE2細(xì)胞增殖明顯抑制（P<0.05）;且隨著EGCG作用濃度的增高和作用時間增加，其增殖抑制作用越明顯，并呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。見封三圖3。

2.2 EGCG對CNE2細(xì)胞侵襲作用的影響

隨著EGCG作用濃度的增加，CNE2細(xì)胞侵襲穿透的能力顯著下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見封三圖4。

2.3 EGCG作用后CNE2細(xì)胞MMP-2 mRNA與蛋白的表達(dá)變化

加入EGCG（0、40、80、160 mg/L）于CNE2細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h后，隨著EGCG作用濃度和時間的增加，MMP-2 mRNA表達(dá)趨勢性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。EGCG作用48 h后，MMP-2的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的隨EGCG濃度的增加而下降的趨勢（P<0.05）。見圖2、表2。

3 討論

茶多酚作為生活中最常見的綠茶提取物，其主要活性成分便是EGCG。大量研究證實(shí)，EGCG具有抗多種腫瘤的作用[4-7]，且對正常組織細(xì)胞無明顯毒害作用[8]。其抗腫瘤的作用機(jī)制尚未明晰，可能與阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡、抑制相關(guān)信號通路的激活等有關(guān)[9-11]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度的EGCG對低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的生長增殖的影響后證實(shí)，EGCG能抑制CNE2生長增殖，并發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的增加和時間的增長呈抑制增強(qiáng)趨勢;通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠抑制CNE2細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，抑制作用隨著EGCG濃度的升高呈正相關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrixmetal-loproteinase，MMPs）是鋅離子依賴性內(nèi)切酶性蛋白酶家族，能夠通過降解細(xì)胞外基質(zhì)（Extra cellular matrix，ECM），在腫瘤細(xì)胞的侵襲破壞及轉(zhuǎn)移過程中起到至關(guān)重要的作用[12]。在體內(nèi)，MMPs主要通過降解間質(zhì)溶素、明膠酶、間質(zhì)膠原酶等細(xì)胞外基質(zhì)的成分，促使腫瘤細(xì)胞越過由細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的組織結(jié)構(gòu)屏障，向周邊組織結(jié)構(gòu)、血管及淋巴管等其他區(qū)域侵襲轉(zhuǎn)移[13]。目前發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶家族有二十多個種類，MMP-2是目前研究的最為廣泛且最重要的一種侵襲性因子[14]，其在腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移、新生血管等惡性特征中發(fā)揮著十分重要的作用[15-16]。有研究顯示[17]，MMP-2的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后，并誘導(dǎo)了鼻咽癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。蘇勇等[18]通過檢測229例鼻咽癌患者的石蠟標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，MMP-2在鼻咽炎癥組織中陰性表達(dá)，而在鼻咽癌組織中的總表達(dá)率為52.0%;其中，T3～4高于T1～2（P<0.01），且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P<0.01），N2～3高于N1（P<0.05），N2、N3與M1相當(dāng)（P>0.05），提示MMP-2的表達(dá)與鼻咽癌浸潤轉(zhuǎn)移及嚴(yán)重程度密切相關(guān)。另有研究證實(shí)[19]，利用小分子干擾RNA技術(shù)，通過降低PI3K/AKT信號通路下調(diào)MMP-2的表達(dá)后，從而抑制了鼻咽癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。另有研究提示，EGCG經(jīng)信號通路下調(diào)EGFR的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移[20]。在證實(shí)EGCG呈濃度依賴性減弱CNE2細(xì)胞的浸潤作用后，利用RT-PCR及West-Blot技術(shù)檢測了CNE2細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著EGCG濃度的增高和時間的增長，MMP-2 mRNA與蛋白的表達(dá)呈劑量-效應(yīng)、時間-效應(yīng)性下降（P<0.05），提示EGCG抑制CNE2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與抑制MMP-2的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，EGCG抑制CNE2細(xì)胞的增殖、減弱其侵襲轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮其抗鼻咽癌的作用機(jī)制與下調(diào)MMP-2 的表達(dá)相關(guān)。EGCG的抗癌作用機(jī)制的探索是一個復(fù)雜并持續(xù)探索的過程，其具體通過哪些信號通路的調(diào)節(jié)從而影響MMP-2及其他相關(guān)基因及蛋白表達(dá)，還需要進(jìn)一步的研究。這些結(jié)果將會進(jìn)一步增加EGCG作為抗癌藥物的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-04-23）