陳自宏 陳 凱 謝琪敏

（1.保山學院 高黎貢山生物資源研究所；2.云南省高校滇西昆蟲資源保護與利用重點實驗室，云南 保山 678000）

綠僵菌（Metarhizium）一種在生防上應用較廣泛的昆蟲病原真菌[1]。綠僵菌生物制劑具有致病力強、易生產(chǎn)、持效期長、應用效果好、安全性好等優(yōu)點，具有廣闊的應用前景[2,3]。

利用綠僵菌來防治農(nóng)林害蟲的研究與實踐已逾百年[4]，近年來對綠僵菌生防研究的報道較多[2,5]，但很多都是室內(nèi)毒力測定效果很好，室外推廣應用效果卻受到自然環(huán)境因素的限制，故其真菌制劑的商品化進展十分緩慢[6]。昆蟲病原真菌在實際應用過程中，田間自然環(huán)境因素難于人為控制，多種環(huán)境脅迫因子可影響真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，從而降低其殺蟲毒力[7,8]。綠僵菌對逆境因素的耐受能力在種間、種內(nèi)，甚至不同菌株間都存在較大差異[9]。綠僵菌菌劑研發(fā)中應選用耐逆性能優(yōu)良的菌株，增加其生防制劑的防效穩(wěn)定性。

本研究通過測定來自高黎貢山的不同綠僵菌菌株的耐逆性，篩選耐逆性好的優(yōu)良菌株，為綠僵菌的田間應用提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：來自高黎貢山的綠僵菌菌株：BUM 2（海拔3 300 m）、BUM 2360（海拔2 360 m）、BUM 2600（海拔2 600 m）、BUM 225（海拔800 m）、BUM 66.1（海拔1 700 m），保存于保山學院真菌實驗室。

1.2 耐鹽性測定

將PPDA固體培養(yǎng)基配制成3個NaCl濃度梯度（0、0.3、0.6 mol/L），各菌株制備106個/mL的孢子懸液，分別取5 μL涂布接種于不同鹽濃度培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)。設(shè)3次重復。

1.3 耐酸堿性測定

將PPDA固體培養(yǎng)基的pH值配制為3個梯度（5、7、10），各菌株制備106個/mL的孢子懸液，分別取5 μL涂布接種在不同pH梯度的培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)。設(shè)3次重復。

1.4 高溫耐受性測定

參考馬麗娟等[10]的方法，各菌株的孢子懸浮液（106個/mL）分別取1.5 mL至2.0 mL的離心管中，分別置于35℃和45℃的恒溫水浴鍋內(nèi)水浴，處理時間為3 h，然后分別取5 uL涂布于PPDA培養(yǎng)基上。對照不進行水浴。25℃培養(yǎng)。設(shè)3次重復。

1.5 紫外線耐受性測定

取各菌株的孢子懸浮液（106個/mL）1.5 mL至2.0 mL的離心管中，置于紫外燈管（30 W）下40 cm處，照射時間分別為30 min、60 min。對照不進行紫外照射（即處理時間為0 min）。分別取5 μL涂布于PPDA平板上，25℃培養(yǎng)。設(shè)3次重復。

1.6 產(chǎn)孢量測定

各處理培養(yǎng)相同時間后（8～10 d），刮下孢子粉后，用體積分數(shù)為0.1%的吐溫-80無菌水將分生孢子制成懸浮液，并加入3-5粒玻璃珠，振蕩均勻后，顯微鏡下用血球板計數(shù)，并計算各菌株的產(chǎn)孢量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度對綠僵菌菌株產(chǎn)孢量的影響

用不同鹽濃度的培養(yǎng)基來培養(yǎng)綠僵菌菌株，結(jié)果（表1）顯示，不同鹽濃度處理下各菌株的產(chǎn)孢量差異很大。鹽濃度從零增加為0.3 mol/L時，各菌株的產(chǎn)孢量變化不大，有的菌株產(chǎn)孢量略有提高（BUM 2360、BUM 225、BUM 2600），有的略有下降（BUM 2、BUM 66.1）；而鹽濃度繼續(xù)增加到0.6 mol/L時，各菌株的產(chǎn)孢量都顯著降低，說明高濃度鹽處理對綠僵菌菌株的產(chǎn)孢量有明顯的抑制作用。高鹽（0.6 mol/L）處理下，菌株BUM 225的產(chǎn)孢量最高（7.60×106），其次為BUM 66.1（5.43×106）；其它3個菌株的產(chǎn)孢量都下降到較低水平（菌株BUM 2360為2.10×106，菌株BUM 2600為1.63×106，菌株BUM 2為1.13×106）。綜上所述，在高鹽脅迫條件下，菌株BUM 225的產(chǎn)孢能力最優(yōu)，其次為菌株BUM 66.1。

表1 不同鹽濃度處理下各菌株的產(chǎn)孢量（個/mL）

2.2 不同pH值對綠僵菌菌株產(chǎn)孢量的影響

用不同pH值的培養(yǎng)基來培養(yǎng)綠僵菌菌株，結(jié)果（表2）顯示，pH值對各菌株的產(chǎn)孢量影響很大。相對于中性培養(yǎng)基（pH=7），酸性（pH=5）和堿性培養(yǎng)基（pH=10）中各菌株的產(chǎn)孢量都顯著降低，尤其是高pH（10）條件下各菌株的產(chǎn)孢量降低幅度較大。菌株BUM 66.1和BUM 225在各pH條件下產(chǎn)孢量都顯著高于其它菌株。這2個菌株在pH=5的培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量仍能維持在較高的水平，BUM 225的產(chǎn)孢量（14.38×106）略高于BUM 66.1（13.60×106）；但在pH=10的培養(yǎng)基中，這2個菌株與其它菌株一樣，產(chǎn)孢量降低幅度很大（分別為3.56×106和3.12×106），說明它們對高pH的耐受性也較差，而對弱酸性條件（pH=5）有相對較好的耐受性，以BUM 225的耐受性能最好。

表2 不同酸堿性培養(yǎng)基中各菌株的產(chǎn)孢量（個/mL）

2.2 不同溫度對綠僵菌菌株產(chǎn)孢量的影響

在不同溫度下水浴處理綠僵菌菌株后正常培養(yǎng)至產(chǎn)孢，結(jié)果（表3）顯示，隨著處理溫度增加，綠僵菌菌株的產(chǎn)孢量有降低的趨勢，但不同菌株產(chǎn)孢量降低的程度不同。35℃處理后，菌株BUM 2360、BUM 66.1、BUM 225和BUM 2600的產(chǎn)孢量都顯著降低，而菌株BUM 2的產(chǎn)孢量變化不顯著；45℃處理后，所有菌株的產(chǎn)孢量都有顯著降低。35℃和45℃高溫處理后，菌株BUM 66.1的產(chǎn)孢量都為最高（分別為1.43×106和1.25×106），說明在高溫脅迫條件下，此菌株的產(chǎn)孢量最優(yōu)；其次為BUM 225（分別為1.21×106和1.05×106）和BUM 2（分別為1.20×106和1.01×106）。

表3 不同酸堿性培養(yǎng)基中各菌株的產(chǎn)孢量（個/mL）

2.1 紫外線不同照射時長對綠僵菌菌株產(chǎn)孢量的影響

綠僵菌菌株在紫外線（UV）下照射不同時長后培養(yǎng)至產(chǎn)孢，結(jié)果（表4）顯示，UV處理后各菌株的產(chǎn)孢量都有不同程度的下降趨勢。與對照（處理0 min）相比，UV照射30 min，BUM 2360、BUM 225和BUM 2600的產(chǎn)孢量都顯著降低，而BUM 2和BUM 66.1的產(chǎn)孢量下降程度不顯著。UV照射60 min，BUM 2360和BUM 2600的產(chǎn)孢量進一步顯著下降；BUM 2、BUM 66.1和BUM 225與照射30 min相比變化不顯著，但與對照相比還是顯著降低。UV不同處理時長下，菌株BUM 66.1的產(chǎn)孢量都處于最高水平，說明在紫外線脅迫條件下，此菌株的產(chǎn)孢量為最優(yōu)，其次為BUM 225。

表4 紫外線處理后各菌株的產(chǎn)孢量（個/mL）

3 結(jié)論與討論

作為生物殺蟲制劑，綠僵菌具有很多優(yōu)點，但野外環(huán)境因素巨大地限制了其實際應用。加強菌株抗逆特性研究對綠僵菌的生產(chǎn)應用具有重要的作用，篩選抗逆性能好的菌株可提高其菌劑的環(huán)境適應性[6]。環(huán)境溫度和濕度是影響真菌殺蟲劑效果的主要因素[6,11]，紫外線照射也可降低綠僵菌分生孢子的活孢率，導致菌株的毒力下降[7]。對于地下害蟲的生物防治，土壤的酸堿度也會影響真菌的生活力和毒力。

本研究測定了來自高黎貢山的5株綠僵菌菌株對高鹽、高溫、酸堿性和紫外線輻射的耐逆性能，篩選到對幾種逆境條件具有較高耐受能力的2株綠僵菌菌株。菌株BUM 66.1在高溫脅迫和紫外線輻射條件下產(chǎn)孢能力為最優(yōu)；菌株BUM 225在高鹽（0.6 mol/L）和酸性條件（pH=5）下的產(chǎn)孢能力最優(yōu)；這2個菌株在高pH（10）條件下的產(chǎn)孢量降低幅度都很大，說明它們都不耐受高堿性條件。這2個菌株具有較大的實際應用潛力。

高黎貢山不同海拔地理條件差異大、生態(tài)環(huán)境復雜多樣[12]，其中蘊藏著多樣性的綠僵菌物種和大量的綠僵菌菌株資源[13]，可能存在很多耐逆或殺蟲性能高的優(yōu)良菌株。在以后的研究過程中，進一步擴大高黎貢山綠僵菌菌株耐逆性的測定范圍，可能會獲得更多的耐逆優(yōu)良菌株。