王雪飛, 孫慶業(yè)

室內(nèi)模擬試驗銅銹環(huán)棱螺及其體表周叢生物對水中氮形態(tài)及含量的影響

王雪飛, 孫慶業(yè)*

安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院, 安徽省濕地生態(tài)保護與恢復(fù)重點實驗室, 合肥 230601

銅銹環(huán)棱螺及附著于其體表的周叢生物在水體氮循環(huán)過程中均扮演著重要角色。此次試驗以銅銹環(huán)棱螺及其體表周叢生物為研究對象, 通過室內(nèi)模擬試驗探討銅銹環(huán)棱螺及周叢生物對水中氮形態(tài)和含量的影響。試驗分無螺對照組CK、處理1(具有周叢生物的螺殼)、處理2(去除周叢生物的活體螺)和處理3(具有周叢生物的活體螺)。結(jié)果表明, 試驗結(jié)束時, 處理2和處理3水中總氮(TN)含量分別為CK的25倍和44倍, 活體螺顯著增加了水中總氮含量(<0.05)。與處理2相比, 具有周叢生物的處理1和處理3氨氮(NH3-N)和亞硝氮(NO2--N)轉(zhuǎn)化效率更快; 與CK相比, 處理組水中硝氮(NO3--N)占比顯著增加(<0.05), 且具有周叢生物的處理1和處理3比無周叢生物的處理2更早到達(dá)硝氮占比峰值; 螺體表面周叢生物中較高的氨氧化和亞硝氮氧化功能基因(AOB-、AOA-和)豐度促進(jìn)了水中NH3-N和NO2--N向NO3--N的轉(zhuǎn)化。

銅銹環(huán)棱螺; 周叢生物; 氮形態(tài); 氮含量; 氨氧化功能基因

0 前言

廣泛分布于淡水水域中的螺類在水生生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動過程中扮演著重要角色。首先, 螺類可通過牧食藻類, 刺激底棲藻類生長等方式提高水體透明度, 促進(jìn)沉水植物生長[1-2]; 其次, 螺類的排泄物可為初級生產(chǎn)者提供一定量的營養(yǎng)元素(N和P)[3]; 再者, 生活于沉積物表面的螺類, 可通過擾動作用促進(jìn)元素在沉積物與上覆水之間的交換與轉(zhuǎn)運[4]。

近些年來, 由于化肥的使用和污水排放等, 導(dǎo)致大量氮素進(jìn)入水中, 進(jìn)而引發(fā)水體富營養(yǎng)化[5]。研究發(fā)現(xiàn), 螺類在控制水體富營養(yǎng)化方面擁有較大潛力[6]。通過生物擾動, 進(jìn)食以及與微生物互作等方式, 螺類可以直接或間接影響水體中硝化和反硝化等反應(yīng)[7]。更為重要的是, 通過濾食和與大型沉水植物相互作用, 螺類能夠降低水體的總氮含量[8-9], 進(jìn)而改善水體富營養(yǎng)化程度。

附著于巖石、枯枝落葉以及螺、蚌等水中固體表面的周叢生物(Periphyton, 在污水處理中稱為生物膜)是底棲生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的重要場所[10-11]。研究發(fā)現(xiàn), 周叢生物(生物膜)中包含大量細(xì)菌[12], 這些細(xì)菌為周叢生物生態(tài)功能的發(fā)揮奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)[13]。通過吸附有機碎屑, 周叢生物對氮有顯著去除作用, 進(jìn)而可以降低水中營養(yǎng)元素含量[14-15]。

銅銹環(huán)棱螺()是淡水中常見螺類, 廣泛分布于湖泊與河流中, 其螺殼表面常附著周叢生物。本研究以銅銹環(huán)棱螺及其體表周叢生物為研究對象, 進(jìn)行為期8周的室內(nèi)模擬試驗, 探討活體螺、周叢生物及二者所組成的復(fù)合體對水中氮形態(tài)和含量的影響, 揭示螺-周叢生物復(fù)合體參與水體氮轉(zhuǎn)化的初步機理, 為螺類在富營養(yǎng)化水體修復(fù)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計和分析方法

2019年6月于巢湖趙家河統(tǒng)一采集試驗所需銅銹環(huán)棱螺, 將螺置于爆氣的水中暫養(yǎng)48 h(室溫25 ℃), 以確保螺類體表附著的周叢生物種類及數(shù)量較為一致, 挑選個體一致(殼口長1 cm), 健康的螺體用于試驗[16]。每個試驗玻璃桶(半徑10 cm, 高34 cm, 內(nèi)含5 L水)放置30個螺[1], 水總氮含量以用氯化銨溶液調(diào)控在1.5 mg·L-1左右[17], 每桶添加25 mL羊角月牙藻()培養(yǎng)液(3.44×103個·L-1), 供螺取食。

試驗設(shè)置見表1, 試驗持續(xù)8周, 每組4個重復(fù), 期間水一直處于爆氣狀態(tài)(曝氣量 3.5 L·min-1)。隨時移除死亡螺體(結(jié)束時平均每桶死亡4.6個)。為排除死亡個體影響, 試驗設(shè)置密度較高, 且對不同形態(tài)氮的日變化量進(jìn)行了校正。

1.2 水樣采集及水質(zhì)氮素指標(biāo)測定

每周每桶抽取100 mL水樣, 測定氨氮(NH3-N)、亞硝氮(NO2--N)、硝氮(NO3--N)和總氮(TN)。水樣采集后, 每桶均添100 mL去離子水, 保證體積不變。

硝氮(NO3--N)和氨氮(NH3-N)分別采用紫外分光光度法[18]和苯酚-次氯酸鈉分光光度法[18]。亞硝氮(NO2--N)和總氮(TN)分別采用分光光度法[19]和過硫酸鉀消解-紫外分光光度法[18]。

1.3 水及螺體表面周叢生物DNA提取和定量PCR

試驗后, 每桶抽取100 mL水, 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾, 濾膜于?20 ℃儲存, 用于水體DNA提取。

處理組中, 每桶選擇3個螺殼或活螺, 放入含40 mL滅菌水的燒杯中, 震蕩30 min(200 r·min-1), 25 ℃下超聲1 h, 使附著的周叢生物與螺體分離。隨后, 將懸浮液離心10 min(6000 r·min-1)。沉淀物儲存于?20 ℃, 上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾, 濾膜儲存于?20 ℃, 沉淀與濾膜均用于周叢生物DNA提取。

參照Zhou[20]的方法進(jìn)行DNA提取, 周叢生物沉淀物和濾膜DNA合并為一個樣品的DNA。

對固氮基因()及硝化反應(yīng)基因(AOB-、AOA-和)進(jìn)行定量分析, 細(xì)菌AOB-與古菌AOA-均編碼氨單氧合酶,編碼亞硝酸鹽氧化還原酶。定量PCR在ABI step-one system (Applied Biosystems, USA)系統(tǒng)下進(jìn)行?；旌戏磻?yīng)物體積為10 μL: 5 μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 0.02 μL 引物(表2), 2 μL 樣本 DNA(樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)粒DNA), 添加無菌水至10 μL。PCR程序: 95 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min循環(huán)40次, 進(jìn)行熔融曲線分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線R2大于0.99。

表1 模擬試驗設(shè)計

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 不同形態(tài)氮日變化量計算公式

式中: R為水中氮素日變化量(mg·L-1);C為t時水中氮素濃度(mg·L-1);C+1為t時一周后水中氮素濃度; V為水總體積(5 L); M為校正系數(shù), M=o/(o-N), 式中o為t=0時活體螺個數(shù),N為t時螺體死亡個數(shù); T為兩次采樣時間間隔(7 d)。

1.4.2 統(tǒng)計分析

Excel 2007 用于計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤; 單因素方差分析(ANOVA)用于檢驗不同處理間差異, 隨后用Duncan 法檢驗差異是否顯著, 以上檢驗均在SPSS17.0中進(jìn)行; Origin 2017用于繪制圖表。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 水中不同形態(tài)氮含量變化

試驗期間, 處理1硝氮和總氮含量顯著高于CK (<0.05), 有活體螺的處理2和處理3各形態(tài)氮含量均顯著高于無活體螺的CK和處理1(圖1)(<0.05)。試驗最后, 處理2與處理3, 亞硝氮分別升高了0.447和0.674 mg·L-1, 含量分別為CK組的32倍和48倍; 硝氮含量分別升高了51.475和54.819 mg·L-1, 為CK的78倍和82倍; 總氮含量分別升高了59.893和61.391 mg·L-1, 為CK的25和44倍。以上的結(jié)果表明, 活體螺能顯著增加水中各氮素含量。

2.2 水中不同形態(tài)氮日變化量

圖2顯示, CK不同形態(tài)氮日變化量較小, 含量基本穩(wěn)定。處理組氨氮與亞硝氮均先增加后降低, 最終處于穩(wěn)定狀態(tài), 但有周叢生物的處理1和處理3只于前14 d變化明顯, 隨后到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài), 相較于無周叢生物的處理2, 波動幅度更小, 變化時間更短; 無活體螺的處理1硝氮和總氮只于前期變化明顯, 而有活體螺的處理2和處理3二者含量則持續(xù)增加(圖2)。表明, 周叢生物縮短了氨氮與亞硝氮的轉(zhuǎn)化周期, 加速了二者轉(zhuǎn)化進(jìn)程, 而活體螺則可以持續(xù)增加水中硝氮與總氮含量。

圖3顯示, CK組硝氮占總氮比率呈波動態(tài)勢, 處理組則呈上升態(tài)勢, 直至占比呈90%左右時, 達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。處理組之間, 覆有周叢生物的處理1最早到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài), 其次為覆有周叢生物的活螺組處理3, 最后為無周叢生物的處理2。除最初外, 處理組硝氮占比均高于CK(<0.05)。結(jié)合圖2, 可以看出, 處理組水中氮形態(tài)主要為硝態(tài)氮, 而周叢生物則促進(jìn)了氨氮和亞硝氮向硝氮的氧化。

2.3 水及周叢生物的固氮和硝化功能基因豐度

圖4顯示, 水中, 固氮基因()與硝化基因()各組間均無明顯差異, 但處理組硝化基因(AOA)顯著高于對照組(<0.05)。周叢生物中, 各組間基因豐度無顯著差異, 但硝化基因則顯示出較大差異, 處理1 AOA基因顯著高于處理3 (< 0.05), 有螺的處理2和處理3其AOB基因顯著高于處理1 (<0.05), 處理1基因豐度顯著大于處理2 (<0.05)。以上結(jié)果表明, 螺類及周叢生物的存在提高了培養(yǎng)體系中的氮轉(zhuǎn)化基因, 促進(jìn)了水中氮轉(zhuǎn)化。

表2 目標(biāo)基因引物

注: 不同字母表示在P<0.05水平上差異顯著, 下同。

Figure 1 Changes in content of nitrogen in different forms in water

圖2 水中不同形態(tài)氮日變化量

Figure 2 Daily variation of nitrogen in different forms in water

圖3 水中硝態(tài)氮占總氮的比率

Figure 3 The ratio of nitrate nitrogen to total nitrogen in water

3 討論

結(jié)果顯示, 有活體螺的處理2和處理3硝氮和總氮含量顯著高于CK和處理1, 且含量持續(xù)升高(圖1和圖2)。表明在培養(yǎng)條件下, 活體螺提高了水中的氮含量。此外, 相比于無周叢生物CK和處理2, 周叢生物的存在(處理1、處理3)縮短了氨氮與亞硝氮向硝氮氧化的進(jìn)程。

3.1 螺類提高水中氮含量

淡水生態(tài)系統(tǒng)中, 水生動物能夠以分泌和排泄的方式分別釋放出無機氮和糞便, 可溶性的無機氮可直接被水生植物、藻類和細(xì)菌等利用[3], 而不可溶的糞便則需要通過細(xì)菌的分解和再礦化才可被利用[25]。此次培養(yǎng)體系中的細(xì)菌和藻類由于缺乏競爭, 再生速度加快[16]。死亡藻類被微生物分解, 在缺少沉積物儲存[26]和水生植物吸收的情況下, 大量氮溶解于水中, 總氮含量增加。此外, 增加的細(xì)菌會加快對螺類糞便的分解, 同時細(xì)菌呼吸作用產(chǎn)生的二氧化碳也會促進(jìn)藻類的生長[27], 進(jìn)一步加劇水中總氮的積累。反硝化會導(dǎo)致25%—60%的氮流失, 是水體中氮移除的主要途徑之一[28], 但本次試驗一直處于爆氣條件下, 充足的氧氣為硝化反應(yīng)提供了有利環(huán)境的同時, 也抑制了厭氧的反硝化反應(yīng), 使得水中的硝氮無法轉(zhuǎn)移。

固氮生物可將空氣中的氮氣轉(zhuǎn)化為生物可利用的氮形態(tài), 基因是其多度和豐度的標(biāo)志基因[29]。周叢生物中的固氮生物包括固氮菌和藍(lán)藻[12], 二者可被螺類的分泌物滋養(yǎng)[3], 在體系內(nèi)增殖。因此, 銅銹環(huán)棱螺可增加體系中的基因(圖4), 使得處理2和處理3總氮含量持續(xù)增高。所以, 可將螺類應(yīng)用于人工濕地, 以修復(fù)貧氮廢水, 減緩氮缺乏, 并為細(xì)菌提供持續(xù)氮源[30]。

處理1雖擁有較高的基因豐度, 但相較于處理2和處理3, 總氮含量只在前期有所增加(圖2和圖4)?？赡茉驗? 短時內(nèi)細(xì)菌分解凋亡藻類, 增加了氮含量, 但隨時間推移, 養(yǎng)分耗盡, 細(xì)菌活性降低, 死亡藻類和周叢生物不能被分解, 水體中氮含量不再增加[31]。

注: 周叢生物功能基因豐度為基因總拷貝數(shù)與螺殼質(zhì)量之比

Figure 4 Abundance of functional genes for nitrogen fixation and nitrification in water and periphyton

3.2 周叢生物促進(jìn)氨氮的氧化

硝化和反硝化是水中氮轉(zhuǎn)移的主要途徑, 而周叢生物是硝化和反硝化作用的主要場所之一[32]。螺類的硬體外殼常被周叢生物所附著[7], 其中含有大量的硝化細(xì)菌和古菌, 這些微生物在被宿主分泌或排出的銨和二氧化碳所滋養(yǎng)的同時, 其硝化活動也有利于整體底棲動物的硝化速率的提高[33]。此外, 附著式生活可以為微生物提供免受外界打擾的微環(huán)境[34-35], 且與外界的自由生活狀態(tài)相比, 附著狀態(tài)下, 細(xì)菌的相互作用, 代謝, 繁殖和遺傳交換等顯著增強[10]。因此, 與CK相比, 周叢生物顯著提高了水中的硝化反應(yīng)。雖然無周叢生物, 但試驗后期, 處理2硝氮占總氮比率依舊明顯高于CK(圖3), 其可能原因為, 隨著試驗時間的延長和螺體分泌營養(yǎng)的供給, 使得螺殼表面又有新的微生物附著其上并生長。

溶解氧是限制硝化過程的主要因素[36], 爆氣能保證水體充分的氧環(huán)境, 促進(jìn)硝化反應(yīng)?；駻OB和AOA作用氨氧化[21-22],作用亞硝酸鹽氧化[24]。與水相比, 周叢生物AOA、AOB和更為豐富(圖4), 擁有更多的硝化細(xì)菌以促進(jìn)水中的硝化反應(yīng)。

許多大湖都面臨水體富營化問題, 富營養(yǎng)化對水生生態(tài)系統(tǒng)造成的改變之一就是大型沉水植物的減少[37]。雖然在此次培養(yǎng)體系中, 高密度的銅銹環(huán)棱螺增加了水中的氮含量, 但在適當(dāng)?shù)拿芏葪l件下, 這些無機氮可以被直接吸收利用[38], 促進(jìn)沉水植物生長。同時螺類體表周叢生物可加速氨氮氧化, 降低水體修復(fù)時, 高含量銨對水生植物的傷害[39]。

水體富營養(yǎng)化的另一危害為藻類過量繁殖, 其凋亡會增加水底有機質(zhì), 導(dǎo)致微生物活動加強使氧含量降低[40]。低氧阻礙了水底硝化反應(yīng), 進(jìn)而降低反硝化, 影響水體的氮轉(zhuǎn)運。在水體富營化治理時加入螺類, 一方面可以通過螺類的擾動[7], 增加水底孔隙水的氧含量, 促進(jìn)氧化反應(yīng)。另一方面, 體表的周叢生物可加速硝化反應(yīng), 增加水中硝氮含量, 有效促進(jìn)水底反硝化, 加速水體氮轉(zhuǎn)運。此外, 螺類體表周叢生物還可用于人工濕地, 緩解前期對氨氮處理不足的問題[41]。

培養(yǎng)體系中, 銅銹環(huán)棱螺分泌物及周叢生物中的固氮生物使總氮含量持續(xù)增加, 而周叢生物中的氨氧化和亞硝酸氧化菌群則促進(jìn)了氨氮和亞硝態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化。雖然活螺增加了水中氮含量, 但周叢生物促進(jìn)了氮轉(zhuǎn)化, 因此螺-周叢生物復(fù)合體在水體富營化治理方面依舊擁有很大潛力。

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Laboratory simulation of the effects ofand its attached periphyton on form chemical valence and content of nitrogen in water

WANG Xuefei, SUN Qingye*

School of Resources and Environmental Engineering, Anhui University, Key Laboratory of Wetland Ecological Protection and Restoration, Hefei 230601, China

Bothand its attached periphyton play an important role in nitrogen cycle in water. In this study, the effects ofand its attached periphyton on the form and content of nitrogen in water were investigated through an indoor experiment. CK control group (without), treatment 1 group (spiral shell with periphyton), treatment 2 group (livingwithout periphyton) and treatment 3 group (livingwith periphyton) were set. The results showed that at the end of the experiment, total nitrogen (TN) content in the water of the treatment 2 and treatment 3 groups was 25 times and 44 times of that of the CK group respectively, and livingsignificantly increased TN content in the water (< 0.05). Compared with the treatment 2 group, the conversion efficiency for ammonia nitrogen (NH3-N) and nitrite nitrogen (NO2--N) was higher in the treatment 1 and treatment 3 groups with periphyton. Compared with the CK group, the ratio of NO3--N in the water in the treatment groups increased significantly (< 0.05), and the NO3--N ratio reached the peak earlier in the treatment 1 and treatment 3 groups with periphyton than in the treatment 2 group without periphyton. The abundance of AOB-, AOA-and, functional genes for ammoxidation and nitrous oxidation that were highly expressed in periphyton attached to, promoted the conversion of NH3-N and NO2--N to NO3--N in the water.

; periphyton; nitrogen formation; nitrogen concentration; ammonia oxidation function gene

10.14108/j.cnki.1008-8873.2021.05.005

S917

A

1008-8873(2021)05-033-07

2020-02-20;

2020-04-08基金項目:國家水體污染控制與治理科技重大專項(2011ZX07103-1002-101)

王雪飛(1993—), 女, 碩士研究生, 主要從事生態(tài)修復(fù)研究, E-mail: 1051289375@qq.com

通信作者:孫慶業(yè), 教授, 主要從事生態(tài)工程與環(huán)境修復(fù)技術(shù)研究, E-mail: sunqingye@ahu.edu.cn

王雪飛, 孫慶業(yè). 室內(nèi)模擬試驗銅銹環(huán)棱螺及其體表周叢生物對水中氮形態(tài)及含量的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2021, 40(5): 33-39.

WANG Xuefei, SUN Qingye. Laboratory simulation of the effects ofand its attached periphyton on formchemical valence and content of nitrogen in water[J]. Ecological Science, 2021, 40(5): 33-39.