張聲峰 陳碩昌 梁文鳳 嚴祥 馮藝峰 李桂珍 楊輝

摘要：【目的】從自然狀態(tài)下的油茶殼堆肥產(chǎn)品中篩選功能芽孢桿菌，為油茶殼堆肥高效生產(chǎn)、飼料發(fā)酵等應用提供菌劑?！痉椒ā坷酶咄繙y序技術(shù)測定廣西某油茶殼堆肥中微生物群落分布，篩選適宜堆肥微生物生長的培養(yǎng)基以獲得多樣性較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群，經(jīng)平板稀釋涂布法分離純化菌株，使用水解圈法和酶活測定方法進行水解酶功能分析，利用菌株形態(tài)特征觀察、16S rDNA分子鑒定法明確菌株的種屬，并運用分子生物學軟件MEGAX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用重鉻酸鉀法測定腐殖酸含量?！窘Y(jié)果】芽孢桿菌科（Bacillaceae）是優(yōu)勢菌科，占比達55.58%;分離到15株芽孢桿菌，同時具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶3種水解酶活性的菌株有6株;同時具有淀粉酶和纖維素酶活性的有1株;儀具有蛋白酶或纖維素酶一種酶活性的有2株。其中菌株Bacillus sp.YXI1的蛋白酶活力達到27 07±3.28 U-mL-1，淀粉酶活力達123 97±3.19 U-mL-1，纖維素酶活力達15 75±0.23 U-mL-1。含有這15株菌的復合菌制劑有利于腐殖酸的生成，提高了堆肥品質(zhì)?！窘Y(jié)論】鑒定出的Bacillus cereus YX02和Bacillusflexus FYF01等菌株具有進一步研究丌發(fā)的價值，可用于開發(fā)油茶殼堆肥微生物菌制劑。

關(guān)鍵詞：油茶殼堆肥;芽孢桿菌;功能性;篩選;應用

中圖分類號：X 712;X53

文獻標志碼：A

文章編號：1008-03 84（ 2021） 07-0843-12

Functional Bacillus Species in Camellia Seed Shell Compost

ZHANGShengfeng 1， CHENShuochang 1， LIANGWenfeng 1， YANXiang 1. FENGYifeng 1， LIGuizhen 2. YANGHui 1*

（ I. College ofLife Science and Technology， Guangxi UniTJersity. Nanning， Guangxi 530004. China;

2. Guangxi Academy ofForestry Sciences， Nanning， Guangxi 530000， China ）

Abstract：【Objective】Bacillus spp that contribute to the fermentation of Camellia oleifera seed shells were isolated foreffective composting of the waste material. 【Method】 The microbial community in natural camellia seed shell compostfound in Guangxi was studied using the high-throughput sequencing technology. Suitable culture medium to foster the growthof richly diverse Bacillus spp from the compost was selected. Flora isolation by dilution with a streaking plate methodfollowed. The hydrolase activities of the isolates were determined by using the hydrolysis circle method and enzyme activityanalysis， the species identified by a 16S rDNA analysis， and the phylogeny constructed by MEGAX. The content of humic acidin the compost was measured by a potassium dichromate method. 【Result】 Bacillaceae was the dominant family in thecompost. It accounted for 55.58% of all isolated flora. Among the 15 Bacillus isolates. 6 exhibited activities of amylase，cellulase， and protease， one of amylase and cellulase. and 2 0f protease or protease. Strain YXI I showed a protease activity of27.07+3.28 U·mL-1. an amylase activity of 123.971- 3.19 U·mL-1. and a cellulase activity of 15.75+0.23 U·mL-1 In thepresence of numerous Bacillus spp that secreted varieties of hydrolases， formation of humic acid in the compost was enhanced.【Conclusion】 Some of the isolated strains. such as B. cereus YX02 and B. flexus FYFOI， might warrant further investigationto develop microbial inoculants for efficient composting camellia seed shells.

Key words： camellia seed shell compost; bacillus; functional; screening; application

0 引言

【研究意義】油茶是我國特有的木本食用油料樹種。油茶殼是油茶果實加工茶油的副產(chǎn)品，隨著油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，每年都有大量油茶殼產(chǎn)生。油茶殼占整個油茶果實質(zhì)量的60%以上，其主要成分是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素[1]，已經(jīng)在有機肥料、鉀鹽、活性炭的生產(chǎn)中得到利用，具有廣闊的發(fā)展空間與市場空間‘糾。以油茶殼為主要原料的堆肥，可以把儲量豐富、價格低廉的油茶殼資源充分利用。油茶殼堆肥產(chǎn)品的生產(chǎn)和使用，不僅減少對大氣、土壤、水質(zhì)的污染，也減少化肥投入，增加農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量，提高了農(nóng)民收入?！厩叭搜芯窟M展】微生物在堆肥生產(chǎn)中有重要的作用，添加微生物加速農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品堆肥的研究開發(fā)已經(jīng)比較普遍。如Shrestha等[3]進行微生物強化牛瘤胃內(nèi)容物堆肥的研究。Song等[4]開發(fā)一種協(xié)同降解有機酸的微生物聯(lián)合體（ MCDOA），加速蛋白質(zhì)類化合物的降解和復雜的類腐殖質(zhì)物質(zhì)的形成，并改善醋酸、丙酸降解菌和木質(zhì)素降解菌的原生菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，有效縮短餐廚垃圾堆肥周期。Yu等[5]將嗜熱芽孢桿菌接種于污泥堆肥中，提高了堆肥的質(zhì)量和效率。由于芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品堆肥生產(chǎn)中有重要作用，其現(xiàn)已成為應用最多的微生物菌制劑[6.7]，如：可以從堆肥中分離出降解纖維素的嗜熱芽孢桿菌[8];將松樹皮制成堆肥，接種芽孢桿菌屬等有益的微生物，可以增強對樹木根病菌的抑制作用，減少在苗圃使用殺菌劑[9];以蘿卜細菌性葉斑病為例，探討堆肥對植物葉面病害的抑制作用，并對堆肥中可能起抑制作用的根際細菌進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)抑制病害最顯著的是芽孢桿菌屬[1O];利用芽孢桿菌研制固體菌制劑可促進園林廢棄物堆肥過程中木質(zhì)素、纖維素的降解和腐殖質(zhì)的合成[ll];從完全腐熟的餐廚垃圾有機肥中篩選出芽孢桿菌復合菌劑，能夠明顯縮短堆肥周期和提高餐廚垃圾降解率[12]。這些研究表明芽孢桿菌具有降解纖維素、抑制致病菌、提高餐廚垃圾降解率和縮短堆肥周期等功能。【本研究切入點】目前，油茶殼堆肥存在生產(chǎn)效率低和品質(zhì)不高等問題，對油茶殼堆肥的研究報道[13-15]還比較少，且對油茶殼堆肥中功能性芽孢桿菌的研究有待進一步深入?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用高通量測序技術(shù)[16]探究廣西某農(nóng)場自然狀態(tài)下的油茶殼堆肥產(chǎn)品中的微生物多樣性組成，再通過選擇合適的培養(yǎng)基，獲得實驗室環(huán)境下物種多樣性相對比較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群。從中篩選具有水解酶功能特性和其他功能特點的芽孢桿菌，并應用16S rDNA鑒定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分類學地位，最終完成應用效果試驗。為今后開發(fā)油茶殼堆肥微生物菌制劑、提升油茶殼堆肥的生產(chǎn)效率和品質(zhì)，以及飼料發(fā)酵等應用方面提供了菌種資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品來源 堆肥樣品來自廣西某農(nóng)場自然狀態(tài)下的油茶殼堆肥，呈褐色固體顆?；驁F狀，pH7.96，含水率37.35%。

1.1.2試劑 EazyTaq酶，北京聚合美生物科技有限公司生產(chǎn)，XDNA/HindⅢDNA Marker、DL2000 DNAMarker、dNTPMix，TaKaRa試劑（大連）公司生產(chǎn);柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒，上海生工生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);革蘭氏染色液，購白廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;酵母粉和蛋白胨，均購白Oxoid（英國）公司;MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒，購白美國Illumina公司;biowest agArose瓊脂糖，購白西班牙biowest公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基 采用的4種常規(guī)培養(yǎng)基：（1） LB培養(yǎng)基[17]。（2）淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10 9.L 1，NaC15g·L-l，牛肉膏5 g·L-l，可溶性淀粉10 g·L-l，瓊脂15 g·L-l，pH 7.0～7.2。（3）脫脂乳培養(yǎng)基：用于蛋白酶活性的鑒定試驗，分別配制A液和B液。A液：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 h，NaC1 0.5 g，瓊脂2 g，pH7.0～7.2，共50 mL;B液：脫脂奶粉3 g，pH 7.0～7.2，50 mL。A、B單獨滅菌，使用時混合。（4）剛果紅纖維素培養(yǎng)基：K2HP04 0.5 g·L-l，MgS04 0.25g·L-l，剛果紅0.2 g·L_1，CMC-Na 2 g·L-l，NaC11.0g·L-l，瓊脂20 g·L-l，pH 7.0-- 7.2。通過參考適宜芽孢桿菌生長的培養(yǎng)基[18-20]，設定堆肥微生物生長的6組篩選培養(yǎng)基：M1：紅糖6 g·L-l，酵母粉1 g·L-l，豆粕1 g·L_1，硫酸銨4 9.L_1，MgS04 1 9.L 1，MriS040.03 g·L_1，蛋白胨4 g·L-1，pH 7.0～7.2; M2：葡萄糖6 g·L-l，酵母粉1 g·L-l，豆粕1 g·L-l，硫酸銨4 g·L-l，MgS04 1 g·L-l，MnS04 0.03 g·L-l，蛋白胨4 g·L_1，pH 7.0-- 7.2; M3：紅糖5 g·L-l，酵母粉3 g.L-l，NaC1 2 g·L-l，乙酸鈉5 g·L-l，L一半胱氨酸鹽0.5 g·L-l，可溶性淀粉1 g·L-l，蛋白胨5 g·L-l，pH7.0—7.2;M4：葡萄糖20 9.L-1，酵母粉4 g·L_1，乙酸鈉5 g·L_1，硫酸銨2 g·L-1，MgS04 0.5 g·L-1，MnS04 0.2 g·L-1，蛋白胨12 g·L-1，檸檬酸氫二胺2 g·L-1，吐溫一80 1 g·L-1，CaC03 2 g·L-1，K2HP040.5 g·L-1，pH 7.0～7.2;M5：紅糖5 g·L-1，F(xiàn)eS040.2 g·L-1，KC1 0.5 g·L-1，硫酸銨3 g·L-1，MgS040.5 g·L-1，MnS04 0.06 g·L-1，K2HP04 4 g·L-1，pH7.0～7.2;M6：紅糖10 g·L-1，酵母粉2 g·L-1，豆粕2 g·L-1，尿素10 g.L-1，pH 7.0～7.2。

1.2試驗設計

1.2.1油茶殼堆肥微生物多樣性分析 采集適量油茶殼堆肥樣品，送至Shanghai Majorbio Bio—pharmTec11110109y Co.Ltd完成16S rDNA高通量測序，細菌的通用引物序列為：806R（5'一GGACTACHVGGGTWTCTAAT一3 '）與338F（5 '一ACTCCT—ACGGGAGGCAGCAG一3 '）;測序區(qū)域V3～V4區(qū)，測序平臺為IIIumina MiSeq。使用UPARSE軟件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），以97%的相似度對序列進行0TU聚類，以UCHIME軟件剔除嵌合體。通過RDP classifier對測定的序列完成物種分類注釋，然后比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU128），設置70%的比對閾值最終確定堆肥中微生物的種群結(jié)構(gòu)。

1.2.2堆肥微生物培養(yǎng)基的篩選 比較Ml—M6共6組培養(yǎng)基對堆肥微生物生長的影響，每組培養(yǎng)基設3個試驗組，代表3種培養(yǎng)條件：膠塞封口厭氧靜置培養(yǎng)，按M1～M6編號為1一Y，2一Y，3一Y，4一Y，5一Y，6一Y;紗布封口好氧靜置培養(yǎng)，按M1～M6編號為1一HJ，2一HJ，3一HJ，4一HJ，5一HJ，6一HJ;紗布封口好氧搖床培養(yǎng)（100 r.min-1），按M1～M6編號為1一HY，2一HY，3一HY，4一HY，5一HY，6一HY。初始pH均為7.0～7.2。將新鮮堆肥樣品的無菌生理鹽水洗滌液以1%的量接種于各培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度37℃。于培養(yǎng)后的第1、2、3、5、7、15、22、30 d，使用紫外分光光度計測定0D600值。培養(yǎng)后的第3、7、15、30 d，使用平板計數(shù)法統(tǒng)計原核微生物菌數(shù)，并使用光學顯微鏡觀察培養(yǎng)液的微生物形態(tài)。

1.2.3芽孢桿菌平板初篩 堆肥樣品經(jīng)最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)后，使用十倍稀釋法[21]涂布平板，分離單菌落。

1.2.4菌株的形態(tài)學鑒定 在平板上觀察菌株的菌落形態(tài)、菌落顏色和質(zhì)地等，并挑取菌落進行革蘭氏染色[22]。

1.2.5菌株的16S rDNA鑒定 分別提取菌株基因組DNA[23]，通過PCR擴增其16S rDNA'2]，送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。結(jié)果進行核酸BLAST[25]分析比對，利用MEGAX構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[26]。

1.2.6菌株的水解酶功能的初篩和測定

（1）水解酶活性的平板初篩

蛋白酶活性的初篩：將經(jīng)純化菌株點種在脫脂乳培養(yǎng)基上，觀察培養(yǎng)基的周圍是否產(chǎn)生透明的水解圈[27]。淀粉酶活性的初篩：使用Elamary等[28]的方法對菌株淀粉酶水解活性進行了篩選，水解圈的出現(xiàn)作為菌株產(chǎn)淀粉酶的依據(jù)。纖維素酶活性的初篩：使用剛果紅纖維素培養(yǎng)基法，進行纖維素酶活性鑒定[29]。

（2）菌株的基礎發(fā)酵

將菌株接種到LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)24h后測定水解酶活性。

（3）水解酶活力的測定

粗酶液的制備：將初篩菌株的發(fā)酵液于4℃、8000 r·mm-1條件下離心10 min，除菌體后上清液即為粗酶液。蛋白酶活力檢測采用福林酚法[30]，蛋白酶活力單位定義為：在37℃、pH 7.8的條件下，每分鐘催化酪蛋白水解生成1 ug酪氨酸的酶量。淀粉酶活力檢測采用曹丹等[31]使用的方法，淀粉酶活力單位定義為在37℃、pH 6.0的條件下，每分鐘催化可溶性淀粉水解生成1 ug還原糖的酶量。纖維素酶活力檢測采用DNS法[32]，酶活定義為在37℃、pH5.5的條件下每分鐘催化羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生1 ug葡萄糖的酶量。

1.2.7菌株在油荼殼堆肥中的應用試驗 將篩到的15株菌使用LB發(fā)酵培養(yǎng)基單獨培養(yǎng)24 h，然后各取l mL混合，制成微生物菌制劑。設置一個添加菌制劑的試驗組，不添加菌制劑的對照組，每個組3個平行。使用250 mL三角瓶，各試劑按表1的配方添加，初始pH 7.2，紗布封口，于37℃下，搖床轉(zhuǎn)速120 r.mm_1培養(yǎng)。使用重鉻酸鉀法[33]測定培養(yǎng)15 d的腐殖酸含量。

2結(jié)果與分析

2.1微生物群落分析結(jié)果

利用高通量測序技術(shù)對油茶殼堆肥中微生物的多樣性進行測定，結(jié)果顯示（圖1），芽孢桿菌科（Bacillaceae）是堆肥中的優(yōu)勢菌科，其占比達到55.58%，表明芽孢桿菌在油茶殼堆肥微生物中占主導地位。

2.2堆肥微生物在不同培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果

采用M1—M6六組培養(yǎng)基在不同條件下培養(yǎng)堆肥微生物，培養(yǎng)液的OD600和菌數(shù)變化結(jié)果如圖2所示，結(jié)合鏡檢菌株形態(tài)多樣性分析，表明M2培養(yǎng)基最佳：在厭氧培養(yǎng)下菌數(shù)可達到（ 1.91±0.10）×108CFU·mL-1;好氧靜置培養(yǎng)下，菌數(shù)最高可達到（ 33.3±0.59）×lOs CFU.mL-l;好氧搖床培養(yǎng)下，菌數(shù)最高可達到（ 1.19±0.13）×lO 8 CFU·mL-l。且鏡檢結(jié)果表明，M2培養(yǎng)基培養(yǎng)的微生物多樣性更豐富。

2.3菌株形態(tài)學鑒定結(jié)果

經(jīng)平板劃線純化，分離到15株菌。它們在LB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、菌落顏色和質(zhì)地等如表2所示。經(jīng)過染色后在光學顯微鏡下放大4 000倍觀察到的菌體形態(tài)，如圖3所示。

2.4菌株的分子生物學鑒定結(jié)果

2.4.1 PCR擴增驗證結(jié)果 將篩到的15株菌提取基因組DNA，通過PCR擴增其16S rDNA序列，使用瓊脂糖凝膠電泳驗證，如圖4所示，結(jié)果顯示擴增片段大小約為1.5 kb，與16S rDNA預期大小相符，可以用于測序分析。

2 .4.2菌株的16S rDNA序列分析 將分離到的菌株的16S rDNA測序結(jié)果在NCBI上比對后與相似性高的菌株共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)相似性和系統(tǒng)發(fā)育樹進化距離，鑒定YX02為蠟狀芽孢桿菌（Bacilluscereus[34]）.YX15為海洋短桿菌（Brevibacteriumoceani[35]）.FYFOI為彎曲芽孢桿菌（Bacillusflexus[36]）。其他菌株由于在單獨比對時有多個芽孢桿菌屬內(nèi)不同種的芽孢菌株與其相似性都很高且進化距離非常接近，單純依賴16S rDNA序列比對尚不能準確鑒定到種，只能初步鑒定到芽孢桿菌屬。從油茶殼堆肥中分離出的15菌株16S rDNA序列比對結(jié)果見表3。

構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，從發(fā)育樹可以看到，有12株菌暫時鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）的不同菌株。比如菌株YX03、YX16、YX11和YX13，以及菌株FYF07、FYF04和FYFlO，在進化距離上非常接近，但根據(jù)菌落形態(tài)特征不同以及水解酶活性的差異，可推斷是同一屬內(nèi)的不同菌株。在今后的研究中，將通過生理生化、DNA分子雜交技術(shù)鑒定等方式，進一步確定這些菌株的菌種類別。

2.5酶學水解酶活性的初步鑒定結(jié)果

2.5.1蛋白酶活性分析 將各菌株點種在脫脂乳培養(yǎng)基上，平板初篩蛋白酶的結(jié)果見表4所示。有7株菌產(chǎn)生蛋白酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株FYF04，其次是菌株FYF07。D/d值一定程度上說明了菌株產(chǎn)蛋白酶能力的大小，但還需要測定發(fā)酵液中酶的活性，以進一步驗證菌株的產(chǎn)酶能力。

2.5.2淀粉酶活性分析 將各菌株點種在淀粉培養(yǎng)基上，平板初篩淀粉酶的結(jié)果如表4所示，共有7株菌產(chǎn)生淀粉酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株YXI1，其次是菌株FYF01。D/d值一定程度上說明了菌株產(chǎn)淀粉酶能力的大小，但還需要測定發(fā)酵液中酶的活性，以進一步驗證菌株的產(chǎn)淀粉酶的能力。

2.5.3纖維素酶活性分析 將各菌株點種在剛果紅培養(yǎng)基上，平板初篩纖維素酶的結(jié)果如表4所示，共有8株菌產(chǎn)生纖維素酶水解圈，其中，透明圈和菌落直徑比值（ D/d）最大的是菌株FYFOI，其次是菌株FYF04。D/d值一定程度上說明了菌株產(chǎn)纖維素酶能力的大小，但還需要測定發(fā)酵液中酶的活性，以進一步驗證菌株的產(chǎn)纖維素酶的能力。

2.5.4三種水解酶活力的測定 將各菌株進行液體發(fā)酵，測定粗酶液的水解酶的活力。最終初步測定初篩菌株的各酶活力的結(jié)果如圖6所示。其中，蛋白酶活力最高菌株是Bacillus sp.YX11，27 07±3.28U·mL-l; Bacillus sp.FYFlO次之， 為13.67±3.18U·mL-1。淀粉酶活力最高菌株是Bacillus sp.YX13，達144.10±2.65 U-mL-l; Bacillus sp.YXlI次之，為123.97±3.19 U·mL-l。纖維素酶活力最高菌株是Bacillus sp.YXI1，達15.75±0.23 U·mL-l; Bacillus sp.YX03次之，為13.83±0.10 U·mL-l。

這些芽孢桿菌有9株菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，其中同時具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶三種水解酶活性的菌株有6株，同時具有淀粉酶和纖維素酶活性的有1株，僅具有蛋白酶或纖維素酶一種酶活性的有2株。表明這些菌株在油茶殼堆肥中具有促進纖維素向小分子葡萄糖轉(zhuǎn)化、促進蛋白質(zhì)向小分子肽和氨基酸轉(zhuǎn)化以及促進淀粉向小分子麥芽糖和葡萄糖轉(zhuǎn)化的功能性作用。

2.6菌株在油茶殼堆肥中的初步應用

腐殖酸是堆肥過程中生成的最具代表性的次生產(chǎn)物，對于肥料的發(fā)酵腐熟程度具有一定的表征性，是衡量堆肥品質(zhì)的重要指標。培養(yǎng)15 d后，測定添加15株菌菌制劑的試驗組腐殖酸平均含量是7.08%，是對照組腐殖酸平均含量（5.68%）的1.25倍，如圖7所示。試驗組高于對照組，添加15株菌的菌制劑有利于油茶殼堆肥腐殖酸的生成，提高了堆肥品質(zhì)。

3討論

目前，研究農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品堆肥中微生物的影響和作用機理的研究報道已經(jīng)比較普遍。其中有關(guān)微生物水解酶的研究已經(jīng)成為研究的熱點之一，且已有很多研究證實，芽孢桿菌分泌的水解酶對纖維素或蛋白質(zhì)的降解尤為關(guān)鍵。如Liu等[37]研究了城市固體廢物堆肥中不同堆肥階段產(chǎn)纖維素酶的關(guān)鍵微生物種群，發(fā)現(xiàn)纖維素的有效分解依賴于細菌和真菌的協(xié)同作用。聶文翰等[38]將含有芽孢桿菌的復合菌劑添加到秸稈堆肥中，施加這種秸稈堆肥后，土壤纖維素酶活性提高了30.8%，普通白菜產(chǎn)量比對照組提高46.4%。從高溫堆肥中分離到1株芽孢桿菌（Geobacillus stearotherrriophilus），在最適條件下能分泌大量的降解木質(zhì)纖維素的酶，被認為是一種潛在的提高堆肥效率的菌種[39]。在農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品豆粕微生物發(fā)酵中添加蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）和糞腸球菌，抗原蛋白降解率達到90%以上[40]。本研究探索了自然狀態(tài)下油茶殼堆肥中的芽孢桿菌，9株芽孢桿菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，其中同時具有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶3種水解酶活性的菌株有6株。因此，在后續(xù)研究中，利用微生物發(fā)酵工藝條件優(yōu)化以及酶活測定方法，集中對產(chǎn)酶活性較強的菌株的研究，以期獲得高產(chǎn)纖維素酶或蛋白酶的微生物，有助于提升油茶殼堆肥的生產(chǎn)效率和提高堆肥品質(zhì)，并將在飼用酶制劑中具有較大的應用潛力。

此外，利用微生物來消除農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的農(nóng)藥污染是一種非常安全、經(jīng)濟、有效的方法[41]。本研究從油茶殼堆肥中篩選到蠟狀芽孢桿菌，即菌株Bacilluscereus YX02。關(guān)于蠟狀芽孢桿菌的報道已有很多，如研究了對重金屬鉛、鋅、鉻有強吸附能力的一株蠟狀芽孢桿菌[42]，完成了蠟狀芽孢桿菌吸附鉛的研究[43]，分離鑒定了強抗鎘蠟狀芽孢桿菌[44]，發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌對毒死蜱有很高的降解率[45]。也有研究證實，利用植物高羊茅與羊茅共植，結(jié)合蠟狀芽孢桿菌，可顯著修復被重金屬與十溴二苯醚BDE-209共污染的土壤[46];從礦山尾礦中分離到的蠟狀芽孢桿菌（ TIB3），具有促進植物生長的特性，并可以提高植物修復重金屬污染的效率[47]。這些結(jié)論表明了本研究發(fā)現(xiàn)的菌株（Bacillus cereus YX02）可能具有處理重金屬、促進植物生長和消除農(nóng)藥污染的應用價值。另外，本研究中篩選到的菌株FYF01是彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）。已有研究表明某些彎曲芽孢桿菌具有促進植物生長、處理造紙廢水、殺滅害蟲等應用價值。如彎曲芽孢桿菌在鹽脅迫下能促進寄主植物生長，在鹽漬土的植物修復中具有潛在的應用前景[48];一株彎曲芽孢桿菌能夠降解堿木質(zhì)素，利用該菌能夠處理復雜的造紙廢水，是一種很有前途的微生物修復劑[49];一種彎曲芽孢桿菌對蒽醌類染料有脫色和脫毒作用，可用于染料廢水的生物處理[50];彎曲芽孢桿菌可以成為生物殺蟲劑，用作合成殺蟲劑的環(huán)境安全替代品[51]。在今后的研究中，將繼續(xù)挖掘菌株上述方面的功能，或?qū)橛筒铓ざ逊十a(chǎn)品增加改善生態(tài)環(huán)境的作用提供理論依據(jù)和菌種資源。

當今世界常年大量使用化學農(nóng)藥和肥料，土壤結(jié)構(gòu)被嚴重污染和破壞，這給生態(tài)環(huán)境帶來災難性后果。因此，各國競相研究和開發(fā)微生物資源，希望研制出高效、無毒、無污染的微生物肥料和農(nóng)藥。開發(fā)微生物復合菌制劑，利用群落協(xié)同作用以增強微生物的處理能力已經(jīng)成為一種發(fā)展趨勢。比如韓國蔚山的B3（Bio-Best Bacillus）工藝，是先進的污水處理系統(tǒng)。它的主要原理是利用一個以芽孢桿菌占優(yōu)勢的微生物群落處理污水，能夠有效地去除氮、磷和有機物[52]。本研究中這些功能性芽孢桿菌，在今后的研究中，將繼續(xù)探究它們在促進植物生長、處理重金屬、消除污染或殺滅害蟲等方面的功能。以這些功能微生物作為優(yōu)勢菌種，進行復合培養(yǎng)，提高它們的產(chǎn)酶能力和菌密度，充分利用功能性芽孢桿菌種群的協(xié)同作用。在油茶殼堆肥中發(fā)現(xiàn)的這些獨特功能的芽孢桿菌，或?qū)﹂_發(fā)出一種既可以消除土壤污染，又能同時殺死農(nóng)業(yè)害蟲的生物肥料有所啟發(fā)。

4結(jié)論

本研究通過高通量測序技術(shù)，確認芽孢桿菌科（Bacillaceae）是油茶殼自然堆肥中的優(yōu)勢菌科，其占比達到55.58%，對油茶殼堆肥中微生物的群落結(jié)構(gòu)有了進一步了解。通過6組培養(yǎng)基的堆肥微生物培養(yǎng)試驗，篩選出相對最佳的生長培養(yǎng)基，獲得了實驗室環(huán)境下物種多樣性相對比較豐富的堆肥芽孢桿菌菌群。最終分離出15株芽孢桿菌，其中有3株菌明確了種屬，分別是Bacillus cereus YX02，Brevibacteriumoceani YX15，和Bacillus flexus FYF01，它們有促進植物生長、消除污染和殺滅農(nóng)業(yè)害蟲的潛在應用價值。這些芽孢桿菌有9株菌初步顯示具有一定的水解酶功能特性，包括Bacillus sp.YXI1等6株菌同時具有3種水解酶的特性。如菌株Bacillus sp. YXIl的蛋白酶活力達到27.07±3.28 U·mL-I，淀粉酶活力達123.97±3.19 U·mL-l，纖維素酶活力達15.75±0.23U·mL-l。這表明這些菌株在油茶殼堆肥和飼用酶制劑等方面有較大的應用潛力。將分離到的15株芽孢桿菌制備復合菌劑，在油茶殼堆肥中獲得較好的初步應用效果，促進腐殖酸的生成，提高了堆肥品質(zhì)。

參考文獻：

[1] HU J B，SHI Y，LIU Y，et al Anatomical strcture of Camelliaoleifera shell[J].Protoplasma. 2018. 255（6）：1777-1784

[2]覃佐東，謝吉勇，黃生輝，等油茶殼綜合利用研究進展[J]生物加工過程，2016. 14 （5）：74-78

QINZ D，XIE J Y，HUANG S H，et al Progress in utilization ofcamellia shells[J]Chinese Journal of Bioprocess Engineering， 2016，14 （5）：7478 （in Chinese）

[3] SHRESTHA K，SHRESTHA P，WALSH K B，et al Microbialenhancement of compost extracts based on cattlerumen contentcompost - characterisation of a systein EJl Bioresource Technology.2011. 102（17）： 8027-8034

[4]SONG c，ZHANG Y，XIA x，et al Effect of inoculation with ainicrobial consortium that degrades organic acids on the compostingefficiency of food waste [J]. Microbial Biotechnology， 2018.11 （6）：1124-1136

[5] FANGY，JIAxB，CHENL J，et al Effect of thennotolerant bacterialinoculation on the microbial conummity during sludgecoinposting [J] Canadian Journal of Microbiology. 2019. 65（lO）750-761

[6] THATOI H，BEHERA B c，MISHRA R R，et al Biodiversity andbiotechnoloeical potential of microorganisms froin mangroveecosvstems：A review [J]. Annals of Microbiology， 2013. 63（1）：1-19

[7] 胡亞杰，韋建玉，盧健，等枯草芽孢桿菌在農(nóng)作物生產(chǎn)上的應用研究進展[J]作物研究，2019. 33 （2）：167-172

HU Y J WEI J Y，LU J， et al Research prog ress of Bocillus subtilisapplication in crops production [J]. Crop Research， 2019. 33（2）167-172. （in Chinese）

[8] MAYENDE L. WILHELMI B， PLETSCHKE B Cellulases（CMCases） and polyphenol oxidases froin thennophilic Bacillus sppisolated from coinpost [J]. Soil Biology and Biochemistry. 2006.38（9）： 29632966

[9] JOSEv c Inoculating coinposted pine bark with beneficial organismsto inake a disease suppressive conipost for container production ininexican forest nurseries[J]Plonts Journal. 2004.2（5）：181-185

[10] KRAUSE M s，DE CEUSTER T J J，TIQUIA s M，et al. Isolation andcharacterization of thizobacteria from composts that suppress theseverity of bacterial leaf spot of radish [J]. Phytopathology， 2003.93（lO）：1292-1300

[11]付冰妍，孫向陽，余克非，等芽孢桿菌BOl固態(tài)發(fā)酵及其對園林廢棄物堆肥的影響[J]環(huán)境科學研究，2020 （2）：450-457

FU B Y. SUN X Y. YU K F.et al Solid state fermentation of BacillusBOl and its effect on green waste composting [J] Research ofEnvironmentol Sciences. 2020（2）：450-457.（ in Chinese）

[12]余培斌，杜晶，陳建新高溫好氧堆肥過程中芽孢桿菌的篩選、鑒定及應用[J]食品與發(fā)酵工業(yè)，2020. 46（12）：199205. 212

YU P B，DU J， CHEN J X Study on screening and identification ofBocillus in the process of high-temperature aerobic composting and itsapplication [J] Food and Fermentotion Industries. 2020. 46（12）：199205. 212. （in Chinese）

[13] ZHANG JP，YING Y. LIxB，et al Physical and chemical propertiesof Camellia oleifera shell composts with different additives and itsinaturity evaluation system [J] Environmental Science and PollutionResearch. 2020. 27（ 28）：35294-35302

[14]詹孝慈，羅在柒，武忠亮，等小同氮源及微生物菌劑能提高油茶殼堆肥效果[J]分子植物育種，2019. 17（12）：41534160

ZHAN X C，LUO Z Q，WU Z L，et al Different nitrogen sources andmicrobial inoculants could improve the composting of Camelliaoleifera shell [J] Fen：i Zhiwu Yuzhong （Molecular Plant Breeding）.2019. 17（12）： 4153-4160 （in Chinese）

[15] ZHANG JP，YING Y. YAOxH Effects of turning frequency on thenutrients of Camellia oleifera shell co-compost with goat dung andevaluation of co-compost maturity EJl PLoS One. 2019. 14 （9）：e0222841

[16]秦楠，栗東芳，楊瑞馥高通量測序技術(shù)及其在微生物學研究中的應用[J]微生物學報，2011. 51 （4）：445-457

QIN N. LI D F，YANG R F Next-generation sequencing technologiesand the application iii microbiology-A review [J]. ActoMicrobiologica Sinica. 201l， 51（4）：445-457.（ in Chinese）

[17]葛慈斌，藍江林，劉波，等解淀粉芽胞桿菌FJAT-8754產(chǎn)纖維素酶和淀粉酶發(fā)酵動力學模型的構(gòu)建[J]福建農(nóng)業(yè)學報，2019.34 （6）：697-704

GE C B，LAN J L，LIU B， et al. Kinetics of cellulase and amylase-producing fermentation of Bocillus amylolique faciens FJAT-8754[J] Fujian Journal of Agricultural Sciences. 2019. 34 （6）：697-704 （in Chinese）

[18]趙國群，牛夢天，盧士康，等梨渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)多粘類芽孢桿菌的工藝[J]農(nóng)業(yè)工程學報，2016. 32 （7）：303308

ZHAO G Q，NIU M T，LU S K，et al Cultivation of Paenibacilluspolymyxa by solid-state fennentation of pear residues EJlTronsactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering（Transoctions of the CSAE），2016. 32（7）：303-308.（ in Chinese）

[19]崩瑞萍，丁賢，李來好，等響應而法優(yōu)化枯草芽孢桿菌NHSl產(chǎn)芽孢發(fā)酵培養(yǎng)[J]生態(tài)學雜志，2018. 37 （2）：605-612

HU R P，DING X. LI L H，et al Optimization of fermentation mediumcomposition by response surface methodology for the spore productionof Bacillus subtilis [J]， Chinese Journal of Ecology. 2018. 37（2）：605-612 （in Chinese）

[20]董佩佩，汪祥燕，劉元香，等 ‘株凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoogulans）發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中圍釀造，2018. 37 （4）：28-32

DONG P P，WANG X Y. LIU Y X，et al Optimization offermentation medium of Bacillus coagulans [J]. China Brewing.2018. 37 （4）： 28-32. （in Chinese）

[21] MATHAKIYA R A. ROY A， NANDASANA K N. et al Evaluationof a rapid molecular method for detection of Listeria monocytogenesdirectly from broth culture[J]. Veterinary World. 2009. 2（5）： 177-178 [22]何深宏，程方俊，羅干，等解淀粉芽孢桿菌高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與鑒定[J]福建農(nóng)業(yè)學報，2020. 35 （7）：781-787

HE S H. CHENG F J，LUO G，et al Screening and identifvingcellulase-producing Bacillus amyloliquefociens [J] Fujian Journal ofAgricultural Sciences. 2020. 35（7）：781-787（ in Chinese）

[23] YU D， TONG W. CHEN Y.et al Inprovement of bacterial genomicDNA extraction iii clinical specimens [J]. Chinese Journal ofMicroecology. 2007.6（19）： 519520

[24]王佳楠，石妍云，鄭力燕，等石油降解菌的分離鑒定及4株芽胞桿菌種間效應[J]環(huán)境科學，2015. 36 （6）：2245-2251

WANG J N. SHI Y Y. ZHENG L Y. et al Isolation and identificationof petroleuin degradation bacteria and interspecific interactions amongfour Bacillus strains [J]. Environmentol Science. 2015. 36（6）：2245-2251 （in Chinese）

[25] DUNLAP c A，SCHISLER D A，PERRY E B，et al Bacillus swe：eyisp. nov. and Bacillus baynesii sp nov.. isolated froni desert soil EJ'International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.2017. 67 （8）：2720-2725

[26] ADAWAREN E o，DU PLESSIS M. SULEMAN E，et al Thecomplete mitochondrial genome of Gyps coprotheres （Aves.Accipitridae. Accipitrifomes）： Phylogenetic analvsis of mitogenoineamong raptors [J] Peerj. 2020.8： el0034

[27] QIAN Y. SUN Y. ZHONG L， et al The GATA-Type TranscriptionalFactor Arel Modulates the Expression of Extracellular Proteases andCellulases in Tricbodema reesei [J] International Journal ofMolecular Sciences. 2019. 20（17）：4100

[28] ELAMARY R， SALEM w M. Optimizing and purifying extracellularamvlase from soil bacteria to inhibit clinical biofilm-formingbacteria [J] Peerj. 2020.8： el0288

[29] HAJIABADI s，MASHREGHI M. REZA BAHRAMI A，et al'Isolation and molecular identification of cellulolytic bacteria from DigRostam hot spring and study of their cellulase activity [J].BIOCELL.2020. 44 （1）：63-71

[30] WU c L，LIU D， YANG x H. et al Improving production of proteasefrom Pseudoalteromonas sp CSN423 by random mutagenesis [J]Marine Biotechnology （New York.N Y）. 2016. 18（5）：610-618

[31]曹丹，彭浩，蘭阿峰，等一株a一淀粉酶產(chǎn)生菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶條件研究[J]食品研究與開發(fā)，2020. 41 （6）：169-174

CAO D. PENG H LAN A F et al_Isolation. identification andenzyme production conditions of an a-amylase producing strain[J]Food Research And Developmen. 2020. 41（6）：169-174（inChinese）

[32]馮紅梅，秦永勝，李筱帆，等高溫纖維素降解菌群篩選及產(chǎn)酶特性[J]環(huán)境科學，2016. 37 （4）：1546-1552

FENGH M. QINY S，LIXF，et al ScreeniIlg aIld enzym.productioncharactellstlcs of thel11lopllilic cellulase—producmg strains[J]Environmental Science.2016.37（4）：l546-1552（ln Chlnese）

[33]附錄B（規(guī)范性附錄）總腐植酸含量的測定方法[J]腐植酸，2016（2）：47-48

AppendiX B（normative 8ppendix）detelmlnation method of totalhumlc acld coment[J].Humic acid，2016（2）：47-48（1n Chinese）

[34]JAI S，SALuJA B，GuPTA A，et al valldatlon ofarsenlc reslstancein Bacillus cereus strain AG27 by comparatlv.proteln modelmg ofarsC gene product[J].The Protein Journal.2011，30（2）：91-10l

[35]BHADRA B，RAGHuKuMAR c，PINDI P K，et al Brevibactriumoceami sD.nov.isolated from deep—sea sedilnent of the Chagos

Tlench，Indlan Ocean[J] International Journal of Systematic andEvolutionary Microbilogy，2008，58（1）：57-60

[36]JEBELI M A，MALEKI A，AMoozEGAR M A，et al Bacillus fiexusstraiIl As—l2.a new arsenlc transfbrnler bactenum isolated fromcomammated water resources[J].Chemosphere，2017，169：636 64l

[37]LIUD，LI M，xI B，et al Met8proteomlcs reeals maJor mlcroblalpl8yers and thelr blod.gradatlon functions ln a large—scale aerobl.compostmg plaIlt[J].Microbial Biotechnology 2015，8（6）：950960

[38]聶文翰，戚志萍，馮?，|，等復合菌劑秸稈堆肥對上壤碳氮含量和酶活性的影響[J]環(huán)境科學，2叭7，38（2）：783-79l

NIE W H，QI Z P，F(xiàn)ENG H W，et al_Steaw composts wnh composltemoculants aIld theie effects on soil caebon and nlteogen conteIns andenzyme actlvlty[J] Enuironmental Science 2017，38（2）：78379l（in Chinese）

[39]wANG M，MIAo J，wANG x，et al Genomlc and n'anscrlptomeanalyses of a thermophllic bactermm Geobacillus stearothermophilusB5 1solated from colupost leveal lts en2ymatlc basls for llgnocellulosedegradatlon[J] Microaganisms，2020，8（9）：1-18

[40]王騰浩，潘岳龍，沈煒，等蠟樣芽孢桿菌與糞腸球菌協(xié)同發(fā)酵豆粕工藝條件優(yōu)化[J]飼料研究，2020，43（3）：74-77

WANG T H，PAN Y L，SHEN W，et al The optmllzanon offermentation condltlons of soybean meal by usmg Bacillus Gereus andEntteracaccus Faecalls[J].Feed Research，2020、43（3）：74-77（in Chinese）

[41]LI Y，cHI M，GE x，et al Identifcatlon of a novel hydrolase encodedby hy一1 flom Bacillus amyloliquefaciens for bloremediatlon ofcalbendazll11 contalI11nated soil and food[J].International iournal ofagricultural and biological engineering，2019，l2（2）：218 224

[42]闞洪媛，楊世鑫，孫粱倫，等一株耐鉛、鋅、鉻菌株的分離鑒定及其吸附能力[J]微生物學通報、2020（12）：3974-3986

KAN H Y，YANG S X，SUN L L，et al Isolatlon，ldentification andadsorption c8paclty of a straiIl reslstaIlt to lead， zmc andcbromlum[J] Microbiology China，2020（12）：3974-3986（inChinese）

[43]潘建華，劉瑞霞蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus吸附鉛的研究[J]環(huán)境科學，2004，25（2）：166 169

PAN J H.LIU R X Biosorptlon of Pb 2+by Bacillus cereusB10mass[J] Enuironmental Science，2004，25（2）：166 169（1nChinese）

[44]呼慶，齊鴻雁，竇敏娜，等強抗鎘蠟狀芽孢桿菌的分離鑒定及其抗性機理[J]環(huán)境科學，2007. 28 （2）：427-430

HU Q， QI H Y. DOU M N. et al Isolation. molecular characterizationand resistance mechanism studv on a cadmium hyperresistant Bacilluscereus EJlEnvironmental Science. 2007. 28 （2）： 427-430（ in Chinese）

[45]段海明兩株蠟狀芽孢桿菌對毒死蜱的降解動力學研究[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報，2013. 21 （2）：207-211

DUAN H M Kinetics of chlorpyrifos degradation by Bacillus cereusstrains[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture， 2013. 21 （2）：207211. （in Chinese）

[46] LU M. ZHANG z z Phvtoremediation of soil co-contaminated withheavv nietals and deca-BDE by co-planting of Sedum alfredii with tallfescue associated with Bocillus cereus JPl2 [J] Plant and Soil. 2014.382（ 1/2）：89-102

[47] NAYAK A K. PANDA s s，BASU A. et al' Enhancement of toxic Cr（VI. Fe. and other heavy metals phytoremediation bv the svnergisticconibination of native Bacillus cereus strain and Vettveria zizanioidesL [J] International Journal of Phytoremediation. 2018. 20（7）：682-691

[48] XIONG Y W. LI x W. WANG T T，et al Root exudates-driventhizosphere recmitment of the plant growth-promoting thizobacteriumBocillus flexus KLBMP 4941 and its growth-promoting effect on thecoastal halophyte Limoniium sinense under salt stress [J]Ecotoxicology and Environmental Safety. 2020. 194： 1 10374

[49] KUMAR A. PRIYADARSHINEE R. SINGHA S. et alBiodegradation of alkali lignin by Bacillns flexus RMWW II：Analyzing perfonnance for abatement of rice mill wastewater [J] .Woter Science and Technology， 2019， 80 （9） ： 1623-1632.

[50] MOHANTY S S. KUMAR A Response surface Inethodologymediated optiinization of Indanthrene Blue RS bv a novel isolatedbacterial strain Bacillus flexus TS8 [J] .Water Environment Research.2020. 92 （4） ： 569-578

[51] REDA F M. HASSANEIN W A. MOABED S. et al. Potentialexploitation of Bacillus flexus biofilni against the cowpea weevil.Callosobruchus maculotus （F） （Coleoptera： Bruchidae） [J]. EgyptianJournal ofBiological Pest Control. 2020. 30 （l） ： 1-7

[52] NAM J H. BAE W. LEE D H. Oceanobocillus caeni sp nov， isolatedfrom a Baci//us-dominated wastewater treatment system in Korea [J] .International Journol of Systematic and Evolutionary Microbiology.2008. 58： 1109-1113

（責任編輯 ：林海清 ）

收稿日期：2021-0302初稿：2021-0425修改稿

作者簡介：張聲峰（ 1990-），男，碩士研究生，研究方向：微生物工程（E-mail： 1908391037@st.gxu.edu.cn）

通信作者：楊輝（ 1972-），男，博士，高級工程師，研究方向：食品發(fā)酵和酶工程（E-nlail： huiy422@gxu.edu.cn）

基金項目：廣西科技重大專項（桂科AA20302021-7）;百色市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃（百科20192129）：廣西特色經(jīng)濟林培育與利用重點實驗室自主課題（JA-20-04-02）