程林 韓順財 蔣敬濤 李海超 彭凌飛

摘要：【目的】為荔枝蝽Tessaratorria papillosa的產(chǎn)卵繁殖行為提供分子層面的理論基礎，并為荔枝蝽防治的靶點篩選提供有益思路?！痉椒ā坎捎棉D(zhuǎn)錄組測序的方法，對荔枝蝽小同發(fā)育時期及組織進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過篩選荔枝蝽的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和分子克隆的方法獲得荔枝蝽卵黃原蛋白及其受體基因，并利用實時熒光定量PCR（ qRT-PCR）分析其在小同發(fā)育階段和組織部位的時空表達情況。【結果】獲得荔枝蝽3個卵黃原蛋白基因（Tpapi Vgl，Tpopi Vg2，Tpapi Vg3）和1個卵黃原受體蛋白基因（Tpapi_VgRs）。對4個基因進行分析，發(fā)現(xiàn)其均具有典型的保守結構域，是典型的昆蟲Vg和VgRs基因。從進化關系看，荔枝蝽的Vg和VgRs基因的分子進化與物種之問的進化關系較為匹配。qRT-PCR結果顯示Vgl基因在雌蟲各個組織中表達量都比較高，雄成蟲中儀在淋巴液中表達量較高，而Vg2和Vg3基因儀在雌蟲脂肪體中較高表達。VgRs的表達與Vg的表達部位基本一致，在雌蟲卵巢中表達量最高，其次是雌蟲、雄蟲淋巴液和若蟲的脂肪體當中，在若蟲觸角、雄蟲觸角和雄蟲精巢中也有少量表達?！窘Y論】獲得了荔枝蝽3個卯黃原蛋白基因和1個卵黃原蛋白受體基因，對其結構和進化關系進行探討，并對其時空表達情況進行分析，為后續(xù)對荔枝蝽新防治靶標的篩選奠定基礎，

關鍵詞：卵黃原蛋白;卵黃原受體蛋白;轉(zhuǎn)錄組;進化分析;表達量分析

中圖分類號：S 435

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-0793-13

Sequences and Spatiotemporal Expressions of Vitellogenin and Vitellogenin Receptor

Genes of Tessaratoma papillosa

CHENG Lin l， HAN Shuncai I. JIANG Jingtao l， LIHaichao 2， PENG Lingfei l*

（1.Biological Control Research Institute，F(xiàn)ujian Agriculture and Fores trv University/China Fruit Flv Research and C ontror

Center of FAO/IAEA/Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology，Ministy of Education/State Key Laboratory ofEcological Pest Control for Fujian and Taiwan Crops，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China：2.Key Laboratory of Insect Developmentarand Evolutionary Biology/Centerfor Excellence m Molecular Plant Sciences/lnstitute of Plant Physiology and Ecology，Chinese Acaderriy of Sciences，Shanghai 200032，China）

Abstract： 【Objective】 Molecular information associated with the oviposition and reproduction of Tessaratoma papillosawas studied for control of the pest on Iychee trees. 【Method】Transcriptome sequencing of T papillosa in various tissues anddevelopmental stages was conducted. The vitellogenin and vitellogenin receptor genes were obtained by screening thetranscriptome database and applying molecular cloning methods. Temporal and spatial expressions of the genes were analyzedusing qRT-PCR【Result】Three vitellogenin genes （i.e.，，papi_ Vg1，Vg2，and Vg3） and one receptor gene，T papi VgRs，were obtained after screening Homologous analysis showed the genes contained conserved domains typical in the Vg and VgRsof insects. The molecular evolution of Vg and VgRs of T. papillosa paralleled that of the species. The temporal and spatialexpressions of Vgl shown by qRT-PCR were relatively high in all female tissues， but only the lymphatic fluid in adult males.whereas those of Vg2 and Vg3 highly expressed only in female adipose tissue. The expression of VgRs， as well as Vg， washighest in female ovary， followed by female， male lymph fluid， nymph adipose tissue. and minute in nymph antenna， maleantenna. and male testis.【Conclusion】 The structures and evolution of the 3 vitellogenin genes and one vitellogenin receptorgene were analyzed. The information on the spatiotemporal expressions of the genes would aid target selection in study for thecontrol of T. papillosa.

Key words： Vitellogenin gene： vitellogenin receptor gene; transcriptome; evolutionary analysis; gene expression

0 引言

【研究意義】荔枝蝽Tessaratoma papillosa隸屬于半翅目Hemiptera荔蝽科Tessaratomidae，是我國及東南亞等地荔枝、龍眼產(chǎn)區(qū)的重要害蟲。荔枝蝽以成蟲和若蟲刺吸危害果樹幼枝、嫩芽、花和幼果，導致果樹嫩枝萎蔫、落花落果。成、若蟲臭腺分泌物還可灼傷植株幼嫩部位，造成枯死，同時還可傳播龍眼鬼帚病[1-2]，荔枝蝽常年危害嚴重，造成巨大的經(jīng)濟損失。在發(fā)生嚴重年份，荔枝、龍眼可減產(chǎn)20%～30%，甚至部分地區(qū)減產(chǎn)達到70%～80%，甚至絕收[3]。【前人研究進展】卵黃原蛋白（vg）是一類大分子糖脂復合蛋白，廣泛存在于非哺乳類性成熟卵生雌性動物的血淋巴、脂肪體和卵中，是幾乎所有卵生動物卵黃蛋白的前體，能為正在發(fā)育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素和微量元素等營養(yǎng)和功能性物質(zhì)[4-8]。目前已知的昆蟲卵黃原蛋白序列約30條，主要有蜚蠊目的美洲大蠊Periplanetaamericana[9]，德國小蠊Blattella gerrrianica[10];鱗翅目的柞蠶Anthereapernyi[11]，野桑蠶Bombyxmandarina[12]，眉紋天蠶蛾Samia cynthia，綠尾大蠶蛾Actiasningpoana，半目大蠶蛾Antheraea yamamai，舞毒蛾Lymantria dispar;膜翅目的意大利蜜蜂Apis mellifera[13]，蚜小蜂Aphytissp.;雙翅目的埃及伊蚊Aedes aegypti[14]，瘧蚊Anopheles sp.;半翅目的褐飛虱Nilaparvata lugens[15]等。昆蟲卵黃原蛋白一般在雌性成蟲的脂肪體合成，隨后進入血淋巴，經(jīng)血淋巴運輸?shù)铰殉?，與膜上卵黃原蛋白受體結合，經(jīng)胞吞作用，使卵黃原蛋白進入卵巢細胞，并行使功能[7-8.16-17]。昆蟲卵黃原蛋白的mRNA全長大約為6 000 bp，在整個加T過程中，經(jīng)蛋白水解，在完全變態(tài)昆蟲和不完全變態(tài)昆蟲中切割成兩段或多個小的片段[7，l7-18]。根據(jù)卵黃原蛋白前體被切割的形式，可以將其分為三類：①沒有被酶切的蛋白前體，僅含有一個大分子量亞基[7];②酶切為一個大分子量的亞基（ >180 ku）和一個小分子量的亞基（ <50 ku），絕大多數(shù)完全變態(tài)昆蟲中的vg蛋白前體屬于這一類型[7.19];③酶解為幾個分子量約為80～110 ku的多肽，大部分不完全變態(tài)昆蟲中的vg蛋白前體屬于這一類型[17]。昆蟲的卵黃原蛋白受體（ VgRs）屬于低密度脂蛋白受體家族成員，昆蟲的VgRs具有LDLR（low density lipoproteinreceptor）家族典型的保守結構域[17.20-21]。一般來說，VgRs在成蟲羽化前的卵巢中合成，隨后經(jīng)過血淋巴運輸?shù)铰殉才c卵黃原蛋白結合，昆蟲的VgRs具有卵巢特異性，是卵黃原蛋白Vg的專一性胞吞作用受體，可介導vg進入昆蟲卵母細胞，而后沉淀積累形成昆蟲生殖必需的卵黃蛋白[8.22]。VgRs與昆蟲卵巢激活，卵黃發(fā)生，卵子形成密切相關，同時在昆蟲信息交流、社會分化、行為構建以及免疫調(diào)控等行為過程中起到至關重要的作用?！颈狙芯壳腥朦c】荔枝蝽新成蟲大規(guī)模發(fā)生以后，由于抗藥性強[23]，在采取化學防治時不能產(chǎn)生較好的防治效果。而通過人T釋放平腹小蜂Anastatus fulloi進行生物防治較為可行，但平腹小蜂抗寒能力較弱，容易被農(nóng)藥殺傷，野外種群需要較多營養(yǎng)使種群復壯，需要在防治時錯峰噴灑農(nóng)藥才能產(chǎn)生較好的防治效果[24]。在愈加重視食品安全和綠色植保的今天，篩選出新的荔枝蝽防治靶標迫在眉睫。本研究通過分子生物學技術，從基因?qū)用娣治隼笾︱淼漠a(chǎn)卵過程。【擬解決的關鍵問題】通過轉(zhuǎn)錄組獲得荔枝蝽卵黃原蛋白及其受體基因序列，并分析其進化關系、結構和時空表達情況。為了解荔枝蝽產(chǎn)卵的生理過程提供分子層面的信息，同時亦可為從卵期防控荔枝蝽的發(fā)生奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1供試昆蟲

野外蟲源采白福建省福清市龍眼果園內(nèi)，將荔枝蝽雌、雄成蟲若蟲分別保存等待解剖處理。

1.2荔枝蝽的解剖與處理

荔枝蝽的解剖采用蠟盤解剖法，解剖時先用剪刀剪去翅、足、中胸小盾片和腹側板，隨后自腹部兩側剪開，再橫向在消化道上方剪斷前胸背板，并用鑷子掀開背板，用昆蟲針將剩余的組織固定在蠟盤中，注入清水至淹沒蟲體，在昆蟲雙目解剖鏡下解剖，取得荔枝蝽雌雄成蟲和若蟲的脂肪體、中腸，雌雄成蟲的卵巢和精巢、若蟲和雄成蟲觸角[25]。解剖后得到的組織置于1.5 mL離心管中，在80℃冰箱保存，樣品來源及名稱如表1所示。

1.3 RNA抽提及全長cDNA的擴增

總RNA的提取使用TRIz01.RJ Reagent（ Invitrogen）進行，并嚴格按照實驗手冊要求進行。在1 mL TRIz01中加入用研磨柱（使用前用DEPC浸泡并高溫滅菌）充分研磨的液氮速凍過的樣品，充分混勻，并室溫靜置5 min。在混合溶液中加入200 uL氯仿，充分震蕩混勻，并室溫靜置5 min（氯仿要在陰涼避光處保存，避免暴露空氣中被陽光照射產(chǎn)生毒氣）。將混合溶液用4℃低溫離心機離心15 min，12 000 r·mm-1。離心后溶液分為3層，下層為有機相、中層為白色界面、上層為水相，RNA全部在水相中溶解。將上層溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入500 uL預冷的異丙醇（無水乙醇），充分震蕩混勻，置于80℃超低溫冰箱靜置30 min，使RNA沉淀。將樣品取出后，4℃，12 000 r·mm-1，高速離心10 min，倒掉上清，注意不要將沉淀倒出。用500 uL預冷的無RNase 75%乙醇洗滌沉淀，渦旋儀震蕩10 s，充分溶解沉淀中的鹽離子。4℃，12 000 r·mm-1，高速離心5 min，小心吸取上清后在室溫下靜置5 min，使沉淀干燥，加入適量無RNase ddH20溶解沉淀，即可得到總RNA樣品。在分光光度計下檢測吸光度，1%瓊脂凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量， 80℃保存待用。

使用試劑盒ReverTra Ace?qPCR RT Master Mixwith gDNA Remover（ TOYOBO），并按照說明書進行實驗操作。初次使用時，將試劑盒中的4×DNMaster Mix與gDNA Remover按照50：1的比例混合。將2 ug RNA樣品在65℃水浴鍋中熱變性5 min，立即置于冰上冷卻。在冰上配制反應液（ RNA template，2ug;4×DN Master Mix（ gDNA Remover），4uL;Nuclease-free Water補足16 UL;在加入5×RT MasterMix II，4uL），將反應液輕輕混勻后，在37℃條件下孵育5 min。

將配置好的反應液輕輕混勻后，按照以下程序進行逆轉(zhuǎn)錄反應（37℃，15 min;50℃，5 min;98℃，5 min）。反應結束后，將樣品稀釋10倍放置在20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增

引物設計及全長序列擴增：用Geneious R11軟件設計引物，本試驗所用引物見表2。以荔枝蝽cDNA為模板進行PCR擴增，反應體系：cDNAtemplate 2uL;2×PCR MIX 25 uL; Primer F luL;Primer R luL; Nuclease-free Water 21 uL。用高保真Taq酶（Takara）擴增目標片段全長序列，反應程序為：95℃1 min. 95℃30 s，58℃30 s，72℃1 mm.72℃7 min，4℃保存，反應結束后，將樣品進行測序反應，測序委托上海鉑尚生物技術有限公司進行。

1.5基因序列的生物信息分析

利用ORF finder預測ORF全長（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/），利用SignalP5.0進行信號肽預測（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），EXPASY{十算pl/Mw（ https：//web.expasy.org/compute pi/），利用SMART軟件分析基因的蛋白結構域（http：//smart.embl-heidelberg.de/），用Clustal X v2.1軟件對荔枝蝽3個卵黃原蛋白的氨基酸序列進行同源比對分析，利用MEGAX軟件，建立NJ樹（Bootstrap值1000）進行系統(tǒng)進化分析。

1.6 實時定量PCR（Real-time quantitative PCR，qRT-PCR）

qRT-PCR反應使用試劑盒為SYBR?Premix ExTaq rM II（ Takara），所有操作過程使用的試劑均放置在冰上進行。反應所用的PCR 96孑L板或八連管為熒光定量試驗專用，引物見表3。

按如下組分配置反應液：cDNA template 2uL;SYBR? R.Premix Ex Taq rM 11 12.5 uL; PCR ForwardPrimer（ 10 umol-L-l）1uL; PCR Reverse Primer（ 10umol.L-1）1uL; Nuclease-free Water 8.5 uL。整個過程保持在冰上進行（通常模板量在100 ng以下，引物終濃度為0.4 umol·L-1時結果通常較好），輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。采用兩步法PCR程序進行實時定量PCR反應，反應體系如下：95℃30 s，95℃5s，60℃30 s，40個循環(huán)。

為了消除個體差異，每個試驗組的樣品為3個同一組織RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA等量混合，作為一個樣品池進行檢測。每個樣品3次重復，其表達水平分析選用18S rRNA的表達量進行均一化處理。反應結束后根據(jù)Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線判斷引物質(zhì)量。數(shù)據(jù)分析參照2 -△ACT法進行[26]。數(shù)據(jù)間的差異顯著性分析通過T.Test進行，通過計算均值與數(shù)據(jù)間的標準偏差（SD）得到相應結果。

2結果與分析

2.1 Vg基因全長序列CDS的獲得及分析

通過篩選荔枝蝽的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)未發(fā)表）獲得3個vg序列和1個VgRs序列，其mRNA分別為Vgl 5 764 bp，Vg2 6 216 bp，Vg3 6 278 bp和VgRs3 239 bp，將其分別命名為T papi Vgl，T papi_Vg2，T papi Vg3，T papi VgRs，將獲得的序列進行PCR擴增，隨后測序驗證，最終將獲得的序列進行ORF預測，蛋白二級結構分析，信號肽，等電點等分析，結果如表4所示。

隨后，用SMART軟件分析了4個基因的蛋白結構域，結果顯示，荔枝蝽3個vg蛋白包含了卵黃原蛋白的3個典型結構域，一個完整的Vitellogenin_NSupperfamliy domain，一個DVF1943結構域和一個VWD結構域，所不同的是，Vg2在DUF1943結構域前面，包含一個low complexity（ 774-785）結構域，而Vg3在VWD結構域之后，包含一個low complexity（ 1752-1756）結構域，卵黃原受體蛋白包含了8個LDLRA，3個EGF，7個LY和1個GRAM結構域（圖1）。

2.2序列一致性及進化分析

用Clustal X v2.1軟件對荔枝蝽3個卵黃原蛋白的氨基酸序列進行同源比對分析（圖2），結果顯示3個卵黃原蛋白之間序列一致性為59.73%，其中 T papi_Vgl與T papi_ Vg2的序列一致性為50%，T papi_Vgl與T papi_Vg3的序列一致性為42%，T papi_Vg2與T papi_Vg3的序列一致性為45%。

隨后，利用34個其他物種昆蟲vg蛋白和28個其他物種昆蟲的VgRs蛋白分別進行進化樹分析（表5、6），利用MEGAX軟件，建立NJ樹（Bootstrap值1 000）（圖3），結果顯示，在所獲得的具有全長的37個vg蛋白中序列之中，卵黃原蛋白分成3個大群，其中荔枝蝽的3個卵黃原蛋白與蝽科的豆類點蜂緣蝽Riptortus pedestris和大眼長蝽Geocorispallidipennis聚集在了一支上，其次是負蝽科的大田負蝽Lethocerus deYrolli盲蝽科的綠盲蝽Lygus lucorum和黑肩綠盲蝽Cyrtorhinus lividipennis聚集在一起。還發(fā)現(xiàn)，鱗翅目的荔枝蒂蛀蟲Conopomorphasinensis與綠盲蝽Lygus lucorum的Aluco Vg2蛋白很好地聚集在一起，隨后與其他半翅目昆蟲灰飛虱Laodelphax striatellus、褐飛虱Nilaparvata lugens和油蟬Graptopsaltria nigrofuscata聚集形成了一個大群。說明宿主可能會改變昆蟲的一些基因序列，從而產(chǎn)生進化中的相似性。其次，鱗翅目昆蟲除了荔枝蒂蛀蟲Conopomorphasinensis之外的其他昆蟲聚集形成一個大群，膜翅目昆蟲和半翅目的煙粉虱Bemisiatabaci以及脈翅目的大草蛉Chrysopa septempunctata聚集形成一個大群。

同樣，對T papi_ VgRs的進化樹分析（圖4）結果顯示，29個VgRs分別聚集，主要分為兩大類，鱗翅目與雙翅目昆蟲聚集為一個大類，而荔枝蝽與半翅目其他昆蟲煙粉虱B.tabaci、灰飛虱T.striatellus、褐飛虱Ⅳ.lugens和白背飛虱Sogatellafurcifera聚集在一起，隨后與鞘翅目、蜚蠊目和嚙蟲目昆蟲聚集形成一個大群，同目昆蟲的VgRs進化關系更為接近，E值絕大多數(shù)都在50以上，說明VgRs與物種進化一致。

2.3荔枝蝽vg及VgRs基因的時空表達分析

用實時熒光定量PCR（ qRT-PCR）檢測荔枝蝽14個不同發(fā)育階段的不同組織中的vg基因和VgRs基因的表達情況（圖5、6），結果表明，Vgl基因在各個組織中表達量相對比較高，尤其是在雄成蟲淋巴液、雌蟲、雌蟲脂肪體、雌蟲中腸和卵巢中，而Vg2和Vg3基因僅在雌蟲脂肪體中較高表達。VgRs的表達量，與vg的表達部位基本一致，在雌蟲卵巢中，表達量最高，其次是雌蟲，雄蟲淋巴液和若蟲的脂肪體當中，在若蟲觸角，雄蟲觸角和雄蟲精巢中，也有少量表達。

3討論與結論

卵黃原蛋白基因是編碼昆蟲和許多其他卵生生物卵內(nèi)的主要蛋白一卵黃蛋白前體。在昆蟲中，vg基因以性別、組織和階段特異性的方式在脂肪體內(nèi)和卵巢外表達。在生殖階段，vg蛋白mRNA大量表達，然后被翻譯，分泌到血淋巴中，并最終通過受體介導的內(nèi)吞作用被發(fā)育中的卵母細胞吸收。Vgs以卵黃蛋白（Vn）的形式儲存，卵黃蛋白（Vn）是發(fā)育中的胚胎的主要營養(yǎng)儲備[27]。

Vgs和VgRs已在許多脊椎動物和無脊椎動物中被廣泛鑒定，并且昆蟲的Vgs和VgRs得到了廣泛的研究，在蜚蠊目、直翅目、鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、半翅目和膜翅目等昆蟲中均有相關基因被報道。通常，昆蟲vg的氨基酸結構和組成高度保守[27]。它通常具有20個殘基的信號肽，N端區(qū)域的脂質(zhì)結合結構域（ LPD N），C端區(qū)域的von Willebrand因子D型結構域（ VWD）[27]，以及未知的功能域（ DUF1943）。

本研究通過篩選荔枝蝽T papillosa的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)另文發(fā)表），利用分子克隆的方法獲得了荔枝蝽3個vg基因和1個VgRs基因，在序列結構方面荔枝蝽與其他報道的昆蟲Vgs相似，3個荔枝蝽vg基因均含有20 bp左有的信號肽，并且均具有3個典型的vg蛋白的功能結構域，高度保守的卵黃蛋白原結構域LPD N和VWFD結構域[28]。以及目前僅在少數(shù)昆蟲中（例如果斑螟Cadra cautella和白背飛虱S furcifera等）被報道發(fā)現(xiàn)的未知功能的DUF1943結構域[29-32]。同時，3個荔枝蝽vg蛋白序列也具有不同的特征，例如：Vg2在DUF1943結構域N端區(qū)域包含一個low complexity（ 774-785）結構域，而Vg3在VWD結構域之后，C端區(qū)域的包含一個lowcomplexity（1752-1756）結構域。

對其他昆蟲物種的研究結果顯示，vg蛋白的基因數(shù)量因昆蟲而異[33]。例如，意大利蜜蜂A.mellifera[34]、佛羅里達弓背蟻Campotusfloridanus[35]，家蠶B.mori[36]和德國小蠊B.germanica[37]僅有1個vg基因，而美洲大蠊P.americana[38]帶有2個vg基因。最近的研究表明，褐飛虱N.lugens具有3個vg基因[39]。目前，埃及伊蚊A.aegypti[40]和阿根廷蟻Linepithema humile[35.41]中基因數(shù)最高的是5個。這些基因數(shù)差異被認為是基因復制事件的結果。本研究在荔枝蝽中發(fā)現(xiàn)的3個vg基因，序列一致性為59.73%，T.papi Vgl與其他物種的結構相似性最高，具有比價保守的3個功能結構域，與在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的幾種蝽科昆蟲的序列一致性相對較高，而T.papi Vg2與T.papi Vg3中均在不同的位置中插入了一個low complexity結構域，LCRs功能域是常見的通過減數(shù)分裂形成的重組事件，這些區(qū)域的動態(tài)多樣化和無中間的變異和多態(tài)性水平較高，被認為是物種間表型變異的重要來源[42]，這一結構特征，可能說明T papi Vg2與T.papi Vg3是在長期的進化過程中，由T papi_ Vgl基因復制及變異而來的，基因復制是基因組進化的重要機制，并且是基因表達模式和功能進化新穎的重要手段[43]。因此，這3個基因在具有類似的生理功能的同時，發(fā)生了什么樣的改變，值得進一步探討。

對荔枝蝽VgRs序列的分析表明，它由多個保守的模塊化元件組成，與其他昆蟲VgRs相似，并且是LDLR超家族的典型成員[17]。鱗翅目中的VgRs的特征是在兩個LBD結構域中存在11個富含半胱氨酸的LDLRA重復，其中在第一和第二LBD結構域中分別為4個和7個重復。但是，LDLRA重復序列的數(shù)量和排列方式與其他昆蟲順序有很大不同。蜚蠊目和雙翅目中有5和8個LDLRA重復序列，膜翅目中有2個、4個和8個重復序列，鞘翅目有8個重復序列[44-45]。與鱗翅目昆蟲VgRs相比，荔枝蒂蛀蟲C.sinensis在2個EGF前體結構域中的EGF/鈣結合樣重復序列的數(shù)量和排列都不同。通常，在第1個EGF前體結構域中出現(xiàn)了2個或3個類似EGF的重復序列，但在荔枝蒂蛀蟲VgRs中多了1個額外的重復序列[46]。本研究在荔枝蝽中發(fā)現(xiàn)，T.papi VgRs包含了8個LDLRA、3個EGF、7個LY和1個GRAM結構域，這與半翅目昆蟲的結構域較為類似。

本研究獲得的4個基因，均具有典型的保守結構域，是典型的昆蟲vg和VgRs基因，通過構建兩個系統(tǒng)進化樹，推斷了3個荔枝蝽vg基因和1個荔枝蝽VgRs基因與其他目昆蟲Vgs和VgRs的進化關系。從進化關系來看，vg和VgRs基因的分子進化與物種之間的進化關系較為匹配，不論是荔枝蝽vg基因還是荔枝蝽VgRs基因均與半翅目昆蟲較好地聚集在一起，從荔枝蝽vg基因進化樹來看，先后與蝽科、負蝽科、盲蝽科昆蟲聚集在一個大支上，荔枝蝽VgRs基因進化樹也很好地支持這一結果，這一結論也很好地說明荔枝蝽的vg和VgRs基因具有較為保守的功能。

同時，發(fā)現(xiàn)荔枝蒂蛀蟲C.sinensis的Vg2基因在分子進化水平上沒有和鱗翅目其他昆蟲顯示出更為接近的關系，反而是聚集在與荔枝蝽更為接近的半翅目分支上，其與綠盲蝽的Vg2和荔枝蝽的Tpapi Vg2在進化關系上更為接近，但在VgRs基因支序圖中并沒有和半翅目在相近的分支，根據(jù)vg基因的功能特征，推測其原因可能是在長期的進化過程中，由于昆蟲長期取食專一性宿主，在遺傳變異的過程中，對生殖相關的卵黃原蛋白造成了相應的結構變異造成的。VgRs基因由于具有極強的卵巢特異性，所以可能在昆蟲生殖系統(tǒng)的進化中由于不同目昆蟲生殖方式及轉(zhuǎn)運物質(zhì)的需求不同，從而產(chǎn)生了不同的基因結構變異。因此，這些基因可能的功能，還需要進一步的深入研究。

卵黃原蛋白的結構、合成、攝取過程與激素的調(diào)控激勵是昆蟲生理學研究的熱點之一，昆蟲卵黃原蛋白基因存在著明顯的分子多態(tài)性，同一種昆蟲也存在幾個編碼卵黃原蛋白的基因，因此，常常被作為分子進化研究的對象，同時，卵黃原蛋白作為昆蟲體內(nèi)的貯藏蛋白，為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)，這為害蟲防治提供了新的思路，4種殺蟲劑對荔枝蒂蛀蟲C.sinensis產(chǎn)卵的亞致死作用的研究結果表明，在測試的各種殺蟲劑中，對荔枝蒂蛀蟲的毒性各不相同，毒死蜱的LCso為0.23 mg·kg-l、p一氯氰菊酯的為20.00 mg·kg-l、苯甲依氨菌素（ EB）對產(chǎn)卵率，存活率和卵巢有明顯的負影響，LC30劑量下荔枝蒂蛀蟲C.sinensis的發(fā)育和交配率有顯著的影響[46]。進一步的研究表明，在EB暴露后24、48和72 h，CsVg和CsVgR的轉(zhuǎn)錄水平受到不同程度的損害，這一結果與亞致死濃度EB-下荔枝蒂蛀蟲的減少是一致的[46]。一些殺蟲劑可以通過破壞昆蟲的脂肪體，從而抑制vg的合成，如印楝素處理可以導致溪岸蚰嫂Labidurariparis脂肪體細胞解體[47]，硫丹處理也會破壞劍角蝗Poekilocerus pictus的脂肪體[48]，同樣，SfVg和SfVgR沉默抑制了白背飛虱S.furcifera的卵巢發(fā)育、產(chǎn)卵數(shù)和孵化率。噻蟲嗪LCio顯著抑制了SfVg-like和SfVgR的表達。相反，三唑磷LC 25顯著促進了白背飛虱Sfurcifera中SfVg、SfVg-1ike和SfVgR的表達，并增加了卵黃蛋白原的含量。因此，殺蟲劑可以通過改變SfVg和SfVgR的表達來調(diào)節(jié)白背飛虱的繁殖，從而影響白背飛虱Sfurcifera的種群密度。這些發(fā)現(xiàn)有助于加深對殺蟲劑對害蟲繁殖和復發(fā)的影響的分子機制的理解奠定基礎，可以說，昆蟲的vg基因，已成為潛在的害蟲控制和鑒定的新靶點[49]。

vg基因的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄水平上直接受激素控制。參與vg基因轉(zhuǎn)錄的激素是保幼激素（JH）、蛻皮類固醇和一些神經(jīng)肽?？傮w上根據(jù)vg基因轉(zhuǎn)錄的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可以將昆蟲分為3類：（i）僅使用JH進行vg基因轉(zhuǎn)錄的昆蟲，如鞘翅目和不完全變態(tài)昆蟲;（ii）同時需要JH和蛻皮類固醇來調(diào)節(jié)vg的昆蟲，如雙翅目昆蟲;（ iii）需要JH、蛻皮類固醇和其他激素來調(diào)節(jié)其生殖生物學的昆蟲，如鱗翅目昆蟲。然而為什么昆蟲物種在使用不同的激素來控制其生殖生理方面會發(fā)生分歧尚不清楚[25]。本研究獲得了vg和VgRs基因在荔枝蝽不同組織中的時空表達情況，均顯示其在卵巢和雌蟲脂肪體中的高效高表達的現(xiàn)象，這與其他的昆蟲的表達模式類似，所不同的是，T papi Vg2和T.papi Vg3在卵巢中并沒有出現(xiàn)顯著的高表達趨勢，在雌蟲脂肪體中，呈現(xiàn)特異的高表達特性。這從另一個角度說明，這兩個基因在結構域產(chǎn)生變異之后，功能亦隨之發(fā)生了變化，這些現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為更好地理解荔枝蝽Tpapillosa的產(chǎn)卵繁殖行為提供了基因?qū)用娴睦碚摶A，同時亦可為荔枝蝽防治的靶點篩選提供一些有益的思路。

參考文獻：

[1] 陳景耀，柯沖，陳菁瑛荔枝鬼帚病的初步調(diào)查及傳病試驗[J]植物病理學報，1992 （1）：26

CHEN J Y，KE C， CHEN J Y A preliininary study on the incidenceand transinission of litchi witches broom [J] Acto PhyopathologicaSinica. 1992 （1） 26 （in Chinese）

[2] 許長藩，陳景耀，夏雨華，等荔枝蝽傳播龍眼鬼帚病的研究[J]植物病理學報，1994，2（2）：60-64

xu C F，CHEN J Y，XIA Y H，et al On transmission of Longyanwitches broom byTessaratoma papillosa（Drury）[J].ActaPhytopathologico Sinica，1994，2 （2）：6064. （in Chinese）

[3] 黎榮欣，趙冬香，王玉沽，等荔枝蝽防治研究進展[J]熱帶作物學報，2013，34 （1）：195200

LI R X，ZHAO D X.WANG Y J et al Research progress ofcontrolling Tessaratoma popillosa（Drury） [J]. Chinese Journal ofTropical Crops. 2013. 34（1）：195200.（ in Chinese）

[4] AMDAM G v，PAGE JR R E，F(xiàn)ONDRK M K，et al Hormoneresponse to bidirectional selection on social behavior[J]Evolution&Development. 2010. 12（5）：428436

[5]戈林泉，吳進才.昆蟲卵黃蛋白及其激素調(diào)控的研究進展[J].昆蟲知識，2010，47 （2）：236-246

GE L Q，WU J C Research progress in insect vitellin and its hormoneregulation EJl. Chinese Bulletin of Entomology，2010，47（2）：236246. （in Chinese）

[6] MATOZZO v，GAGNEF MARIN M G，et al_Vitellogenin as abiomarker of exposure to estrogenic compounds in aquaticinve11ebrates：AreⅥew[J].Environment International，2008. 34 （4）：531-545

[7] TUFAIL M TAKEDA M Molecular characteristics of insectvitellogenins[J]Journal of Insect Physiology，2008. 54 （12）：14471458

[8] TUFAIL M TAKEDA M Insect vitellogenin/lipophorin receptors：Molecular structures. role in oogenesis， and regulatoryinechanisms[J]Journol of Insect Physiology，2009，55 （2）：87103

[9] TUFAIL M. TAKEDA M Molecular cloning. characterization andregulation of the cockroach vitellogenin receptor during oogenesis EJl .Insect Molecular Biology. 2005. 14 （4） ： 389401 .

[IO] CIUDAD L. PIULACHS M D. BELLES X Systemic RNAi of thecockroach vitellogenin receptor results in a phenotype slmllar to thatof the Drosopbila yolkless mutaIlt [J]. The FEBS Journal. 2006.273 （2） ： 325335.

[11] LIU Q N， ZHU B J. LIU C L. et al. Characterization of vitellogeninreceptor （VgR） from the Chinese oak silkworm. Antheraeo pernyi [J].Bulletin of lnsectology， 2011. 64 （2） ： 167-174

[12] QIAN C. FU W W. WEI G Q. et al. Identification and expressionanalysis of vitellogenin receptor from the wild silkworm. Bombyxmondarina [J]. Archives of Insect Biocbemistry and Physiology. 2015.89 （4） ： 181-192

[13] WEINSTOCK G M. ROBINSON G E. GIBBS R A. et al Insights intosocial insects from the genome of the honeybee Apis mellifera [J].Nature. 2006. 443 （7114）： 931-949

[14] CHO K H. RAIKHEL A S Organizanon and developmentalexpression of the mosquito vitellogenin receptor gene [J]. InsectMolecular Biology. 2001. 10 （5）： 465474

[15] LU K. SHU Y. ZHOU J. et al. Molecular characterization and RNAinterference analysis of vitellogenin receptor from Niloparvata lugens（Stal） [J]. Journol of lnsect Physiology， 2015. 73 ： 20-29

[16] BROWN M S. GOLDSTEIN J L. A receptor - mediated pathway forcholesterol hoineostasis （Nobel lecture） [J]. Angeivandte ChemieInternotional Edition in English. 1986. 25 （7）： 583602

[17] SAPPINGTON T W. RAIKHEL A S Molecular characteristics ofinsect vitellogenins and vitellogenin receptors [J]. Insect Biocbemistryand Molecular Biology. 1998. 28 （5-6） ： 277300

[18] TUFAIL M. TAKEDA M Vitellogenin of the cockroach， Leucophaeamaderae： Nucleotide sequence. structure and analysis of processing inthe fat bodv and oocytes [J]. Insect Biochemistry and MolecularBiology， 2002. 32 （ll） ： 1469-1476.

[19] HIRAI M. WATANABE D. KIYOTA A. et al Nucleotide sequence ofvitellogenin mRNA in the bean bug， Riptortus clavatus： Analysis ofprocessing in the fat bodv and ovary [J]. Insect Biochemistry andMolecular Biology. 1998. 28 （8）： 537-547

[20] RAIKHEL A S. DHADIALLA T S Accumulation of yolk proteins inmsect oocytes EJl. Annual Review of Entomology. 1992. 37： 217-251.

[21] SNIGIREVSKAYA E S. RAIKHEL A S. Receptor-mediatedendocytosis of yolk proteins iii insect oocytes[J] Progress invitellogenesis[J]. Reproductive biology of invertebrates. 2005. 12（PartB）： 199-228.

[22] ROEHRKASTEN A. FERENZ H J. Role of the lysine and arginineresidues of vitellogenin in high affmity binding to vitellogeninreceptors in locust oocyte membranes [J]. Biochimica et BiopbysicoActa. 1992. 1133 （2）： 160-166的研究[J].昆蟲學報，1973. 16 （l）： 15-24

ZHANG W Q， LIU X Q. Studies on the seasonal changes of thephysical properties and the reducing power of the haemolymph of thelvchee stinkbug，Tessorotoma papillsoa drury （Heiniptera：Pentatomidae） [J]. Acto entomologico sinica. 1973.16 （I） ： 1524. （in Chinese）

[24]佘春仁.潘蓉英 .占德祥 .等 .利用平腹小蜂防治荔若枝技術問題探時 [J].福建農(nóng)業(yè)大學學報. 1997. 26 （4）： 441-445.

SHE C R. PAN R Y. GU D X. et al. Several technological problems ofapplying Anastatus sp. to control Tessaratoma papillosa [J]. Journalof Fujion Agricultural University. 1997， 26 （4）： 441-445 （inChinese ）

[25]佘春仁，潘蓉英荔枝蝽的解剖及其在測報的應用[J].福建學院學報，1993（1）：59-63

SHE C R. PAN R Y. Svstematic dissection for forecasting the pestTessaratoma popillosa Drury [J].Journal of Fujian Agriculturalcollege. 1993 （l） ： 59-63 （in Chinese）

[26] LIVAK K J. SCHMITTGEN T D Analysis of relative gene expressiondata using real-time quantitative PCR and the 2- AACI method [J].Methods. 2001. 25 （4） ： 402-408.

[27] TUFAIL M. NAGABA Y. ELGENDY A M. et al. Regulation ofvitellogenin genes in insects [J]. Entomological Science， 2014.17（3） ： 269-282.

[28] UPADHYAY S K. sINGH H. DIXIT S. et al. Molecularcharacterization of vitellogenin and vitellogenin receptor of Bemisiatabaci [J]. PLoS One. 2016. ll （5） ： e0155306.

[29] HU K. TIAN P. TANG Y. et al. Molecular characterization ofvitellogenin and its receptor in Sogotella furcifera， and their functionm oocvte maturation [J]. Frontiers in Physiology， 2019.10： 1532

[30] ROBERTSON J L. PREISLER H K. Pesticide bioassays witharthropods[M]. CRC Press. 1992： 127

[31] THOMPSON J R. BANASZAK L J. Lipid-protem mteractions mlipovitellin [J]. Biochemistry. 2002， 41 （30） ： 93989409.

[32] HUSAIN M. RASOOL K G. TUFAIL M. et al RNAi-mediatedsilencing of vitellogenin gene curtails oogenesis in the almond mothCadra cautella [J]. PIoS one. 2021. 16（2）： e0245928.

[33] MORANDIN C. HAVUKAINEN H. KULMUNI J， et al. Not only foregg yolk -fimctional and evolutionary insights from expression.selection. and stmctural analyses of Formica ant vitellogenins [J].Molecular Biology and Evohition. 2014. 3l （S）： 2181-2193.

[34] PIULACHS M D. GUIDUGLI K R. BARCHUK A R. et al Thevitellogenin of the honey bee. Apis mellifera： Structural analysis of thecDNA and expression studies [J]. Insect Biochemistry and MolecularBiology. 2003.33（4）： 459-465

[35] CORONA M. LIBBRECHT R. WURM Y. et al. Vitellogeninunderwent subfunctionalization to acquire caste and behavioralspecific expression in the harvester ant Pogonomyrmex borbatus [J].PLoS Genetics. 2013. 9（8）：el003730.

[36] YANO K. SAKURAI M T. WATABE S. et al. Structure andexpression of mRNA for vitellogenin in Bombyx mori[J]. Biochimicaet Biophysica Acta. 1994. 1218（l）：1-10

[37] MARTIN D. PIULACHS M D. COMAS D. et al. Isolation andsequence of a partial vitellogenin cDNA from the cockroach. Blottellagermanica （L） （DicO-optera， Blattellidae）. and characterization of thevitellogenin gene expression [J]. Archives of Insect Biochemistry andPhysiology. 1998. 38 （3）：137-146

[38] TUFAIL M. HATAKEYAMA M. TAKEDA M. Molecular evidencefor two vitellogenin genes and processing of vitellogenins in theAmerican cockroach， Periplaneta americano [J]. Arcbives of InsectBiochemistry and Physiology， 2001. 48（2）： 7280

[39] SHEN Y. CHEN Y Z. LOU Y H. et al Vitellogenin and vitellogenin-like genes in the brown planthopper [J]. Frontiers in Physiology.2019. 10： 1181.

[40] ROMANS P. TU Z. KE Z. et al. Analysis of a vitellogenin gene of themosquito， Aedes aeglpti and comparisons to vitellogenins from otherorgaiusms[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 1995.25（8） ： 939-958

[41] SMITH C D. ZIMIN A. HOLT c， et al. Draft genome of the globallywidespread and invasive Argentine ant （Linepithema bumile）[J]Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011. lO8（14）：5673-5678.

[42] COLETTA A. PINNEY J W. SOLIS D Y W. et al. Low-complexityregious within protein sequences have position-dependent roles EJl .BMC Sy'stems Biology. 2010， 4 （l）： 1-13

[43] LYNCH M. CONERY J S The evolutionarv fate and consequences ofduplicate genes [J]. Science. 2000. 290（5494） ： 1151-1155

[44] CONG L. YANG W J. JIANG X Z. et al. The essential role ofvitellogenin receptor in ovary development and vitellogenin uptake inBoctrocera dorsalis （hendel）[J]. International Journal of MolecularSciences. 2015. 16 （8） ： 18368-18383.

[45] ZHANG W. MA L. XIAO H. et al Molecular characterization andfuiiction analvsis of the vitellogenin receptor from the cottonbollworm. Helicoverpa armigera （Hubner） （Lepidoptera. Noctuidae）[J]. PIoS ONE. 2016. 11 （5）： e0155785.

[46] YAO Q. XU S. DONG Y Z. et al. Characterization of vitellogenin andvitellogenin receptor of Conopomorpba sinensis Bradlev and theirresponses to sublethal concentrations of insecticide [J]. Frontiers inPhysiology. 2018. 9：1250.

[47] SAYAH F. FAYET C. IDAOMAR M. et al. Effect of azadirachtin onvitellogenesis ofLabidura riparia （Insect Dermaptera） [J]. Tissue andCell. 1996. 28 （6）：741-749

[48] AMIR M Histopathological effect of some toxicants on the femalereproductive system of Sarcophago ruficornis Fabricius （Diptera：Sarcophagidae） [J]. Cibtech Journal of Zoology ISSN， 2014. 3（2）：231938831

[49] ZHOU C. YANG X B. YANG H. et al Effects of sublethalconcentrations of insecticides on tlie fecundity of Sogatello furcifero（Hemiptera： Delphacidae） via the regulation of vitellogenin and itsreceptor [J]. Journal oflnsect Science. 2020. 20（5）： 14.

收稿日期：2021-0401初稿;2021-0505修改稿

作者簡介：程林（ 1996-），男，碩士研究生，研究方向：昆蟲生態(tài)與害蟲綜合治理（ E-mail： 76782253l@qq.com）

通信作者：彭凌飛（ 1982-），男，博士，講師，研究方向：昆蟲分類與系統(tǒng)學、害蟲防治（ E-mail： lingfeipeng@fafu edu.cn）

基金項目：福建省昆蟲生態(tài)重點實驗室開放課題（FIE201703）