郭 莉，談安群，譚 祥，黃學(xué)根，竇華亭，黃林華，張 玉

1. 西南大學(xué) 柑桔研究所，重慶 400712； 2. 西南大學(xué) 食品科學(xué)與工程國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，重慶 400715

果膠酶廣泛存在動(dòng)植物和微生物中，其中聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是最早發(fā)現(xiàn)且應(yīng)用廣泛的一種果膠水解酶，可通過水解作用切斷果膠酸分子的α-1，4糖苷鍵，將果膠降解為小分子[1]．微生物由于生長速度快，常用于酶的生產(chǎn)．已報(bào)道的產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的菌種主要為曲霉[1-2]、 木霉[3]和青霉[4-5]，也有細(xì)菌[6]和酵母菌[7]等．PG可用于果汁和果酒生產(chǎn)，Patil等[8]用分離的擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)PG，顯著降低了果汁樣品的黏度，在果汁澄清中有重要作用．柑桔加工會(huì)產(chǎn)生大量的皮渣，產(chǎn)果膠酶和纖維素酶的菌株可以用于降解柑桔皮渣[9]以及發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸[10]．柑桔果皮因富含果膠被較多用于提取柑桔果膠[11]．柑桔果膠可以通過果膠酶酶解生產(chǎn)果膠低聚糖[12]，也可利用PG通過水解作用切斷果膠酸分子的α-1，4糖苷鍵，將果膠降解為分子量較小的低聚糖類，得到果膠低聚糖．果膠低聚糖具有低熱量、 抗腫瘤、 抗氧化、 抑菌等作用[13]，具有較好的應(yīng)用價(jià)值．Olano-martin等[14]、 丁長河等[15]用PG分別水解柑桔果膠、 蘋果果膠等可得到果膠低聚糖．雖然PG產(chǎn)酶菌種和酶學(xué)性質(zhì)研究較多，但聚焦于挖掘適用于利用柑桔皮渣果膠制備果膠低聚糖的新型耐酸性PG及其產(chǎn)酶菌株的研究較少．

根際土壤中富含微生物[16]，本研究從柑桔果園土壤中篩選到能產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的一株真菌GYS-6，經(jīng)分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定為皮落青霉，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以充分發(fā)揮菌株的產(chǎn)酶性能，對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)及酶譜特性進(jìn)行研究，并將該酶用于酶解柑桔果膠，經(jīng)薄層層析和高效液相色譜分析確定可得到果膠低聚糖，以期為聚半乳糖醛酸酶和果膠低聚糖的生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 菌 株

菌株GYS-6，從柑桔的土壤中分離篩選獲得，中國微生物菌種保藏中心登記號(hào)為CGMCC 3.15886．

1.2 試劑與培養(yǎng)基

試驗(yàn)用到的試劑與培養(yǎng)基主要有： D-半乳糖醛酸、 聚半乳糖醛酸，美國sigma； 柑桔果膠，上海阿拉??； PDA培養(yǎng)基、 酵母膏、 NaCl、 KH2PO4、 K2HPO4、 MgSO4、 蔗糖、 葡萄糖、 硫酸銨、 氯化銨、 硝酸銨、 尿素、 Tris、 HCl、 SDS、 考馬斯亮藍(lán)R-250、 甲醇、 冰乙酸，均為國產(chǎn)分析純； 乙腈，Sigma-Aldrich．

菌種的鑒定采用麥芽汁培養(yǎng)基，菌種的活化采用PDA培養(yǎng)基，菌種的發(fā)酵采用發(fā)酵培養(yǎng)基： 桔皮粉10 g/L、 酵母膏10 g/L、 NaCl 2.0 g/L、 KH2PO40.3 g/L、 K2HPO41.0 g/L、 MgSO40.3 g/L，自然pH值．

1.3 儀器與設(shè)備

光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司生產(chǎn)； PCR儀easycycler 96，德國耶拿分析儀器股份公司生產(chǎn)； 紫外分光光度計(jì)TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)； 高速冷凍離心機(jī)TGL-20M，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司生產(chǎn)； 電泳儀Bio-Rad，美國伯樂公司生產(chǎn)； 透析袋： MD1425-5m 8000-14000，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)； 高效液相色譜儀，美國DIONEX公司生產(chǎn)．

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 聚半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以D-半乳糖醛酸含量(μmol)為橫坐標(biāo)x，吸光值為縱坐標(biāo)y，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.586 3x-0.366，R2=0.996 6．

1.4.2 聚半乳糖醛酸酶活力測(cè)定方法

發(fā)酵后產(chǎn)物過濾后經(jīng)冷凍離心機(jī)1 000 r/min離心20 min，取上清液測(cè)定聚半乳糖醛酸酶活力[17]．

酶活力測(cè)定[18-19]： 采用改良后的DNS法，以D-半乳糖醛酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線； 以滅菌后酶液作為對(duì)照，540 nm比色，每分鐘催化底物產(chǎn)生1 μg半乳糖醛酸所需酶量定義為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示．

1.4.3 菌種的鑒定

將菌種在麥芽汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d，觀察菌落形態(tài)、 菌絲、 分生孢子等，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定[20]．

β-微管蛋白(TUB)測(cè)定基因序列．上游引物： 5’-AATI’GGTGCCGCTTTCTGG-3’，下游引物： 5’-AGTTGTCGGGACGGAATAG-3’．PCR體系： 總體積30 μL，其中2×easyTaqSuperMix 15 μL，上、 下游引物各1 μL (10 pmol/μL)，模板(提取的真菌DNA)3 μL(100～120 ng/μL)，加雙蒸水補(bǔ)至30 μL．反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min預(yù)變性，然后94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min．?dāng)U增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并切取目標(biāo)片段，送華大基因測(cè)序，將測(cè)序所得序列在NCBI上進(jìn)行BLASTS比對(duì)分析[21-22]．

1.4.4 酶的初步純化及酶譜分析

酶的初步純化采用硫酸銨分級(jí)沉淀及鹽析[23]．將粗酶液緩緩加入硫酸銨粉末至飽和度0%～20%，20%～40%，40%～60%，60～80%．沉淀過夜后冷凍離心機(jī)12 000 r/min離心30 min，收集沉淀，用0.2 mol/L醋酸(pH值5.0)緩沖液復(fù)溶，用透析袋(8 000～14 000)透析，緩沖液做透析液，定期更換透析液，直至氯化鋇檢測(cè)透析液中無沉淀為止，透析袋內(nèi)液體即為初步純化酶，測(cè)定其聚半乳糖醛酸酶活力，計(jì)算鹽析后各段酶活占總酶活的比例．

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[24]，酶譜樣品不加熱，并且在分離膠中加入0.1%聚半乳糖醛酸．電泳完成后，用2.5%的Triton X-100緩沖液浸泡1 h，再37 ℃緩沖液孵化24 h，用蒸餾水漂洗后，用0.05%釕紅染色1 h，蒸餾水漂洗．

1.4.5 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性[25]

將初步純化聚半乳糖醛酸酶在不同溫度(25～70 ℃)下測(cè)定酶活，以酶活最大值時(shí)酶活力定義為100%，計(jì)算不同溫度下的相對(duì)酶活力(即不同溫度條件下的酶活性占最高酶活性的百分比)．將酶液在不同溫度(25～55 ℃)條件下保溫30 min后立即冰浴，待冷卻后測(cè)定酶活，計(jì)算剩余酶活性與未處理時(shí)酶活性比值作為相對(duì)酶活力．

1.4.6 酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性[25]

在溫度45 ℃時(shí)，將酶液置于不同pH值緩沖液(pH值 3.0～8.0)下測(cè)定酶活，以酶活最大值時(shí)酶活定義為100%，計(jì)算不同pH值條件下相對(duì)酶活力(即不同pH值條件下的酶活性占最高酶活性的百分比)．將酶液置于不同pH值緩沖液(pH值2.2～10.86)下保持30 min后，測(cè)定酶活，計(jì)算剩余酶活性與未處理時(shí)酶活性比值作為相對(duì)酶活力．

1.4.7 金屬離子及其濃度對(duì)酶的活力影響[26]

在0.1 mmol/L，0.5 mmol/L，1 mmol/L，5 mmol/L和10 mmol/L下，測(cè)定金屬離子(K+，Na+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Mn2，Cu2+，Co2+，Pb2+，Al3+)對(duì)聚半乳糖醛酸酶活性的影響，以不添加金屬離子時(shí)的酶活計(jì)為100%，計(jì)算添加金屬離子后的相對(duì)酶活力．

1.4.8 果膠水解制備低聚糖應(yīng)用

酶解果膠生產(chǎn)果膠低聚糖： 用醋酸緩沖液(pH值4.5)配置2.0%的果膠溶液和1 U/mL初步純化酶液，體積比按2∶3，在40 ℃恒溫水浴磁力攪拌下進(jìn)行酶解，分別酶解0 min，5 min，10 min，30 min，60 min，90 min，270 min后，立即取出沸水浴滅活15 min，流動(dòng)水冷卻．

酶解產(chǎn)物經(jīng)氮吹儀濃縮后進(jìn)行薄層色譜分析(TLC)，在距離薄層板0.5 cm高度處點(diǎn)樣，展開劑為正丁醇-乙酸-水(體積比4∶3∶1)混合液，展至距上沿0.5 cm處停止．染色劑為乙醇-硫酸(體積比9∶1)，薄層板吹干后，放入110 ℃烘箱烘烤5 min，冷卻觀察．

將果膠酶解270 min后樣品，用80%乙醇沉淀多糖，上清液真空濃縮后進(jìn)行真空冷凍干燥，得到果膠低聚糖樣品，并進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，示差檢測(cè)器，色譜柱為氨基柱，流動(dòng)相為70∶30(乙腈∶水)，流速1.3 mL/min，柱溫44 ℃，進(jìn)樣量10 μL．

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所有樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示．?dāng)?shù)據(jù)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間采用One way ANOVA進(jìn)行Duncan法比較，p<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．折線圖和柱狀圖用origin 8.5進(jìn)行繪制．

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶條件及菌種鑒定結(jié)果

通過單因素優(yōu)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)最佳碳源為柑桔皮果膠，說明該菌株產(chǎn)酶為誘導(dǎo)型，優(yōu)化后聚半乳糖醛酸酶活力從0.79 U/mL提高至3.59 U/mL．菌種在麥芽汁培養(yǎng)基上生長較快，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d，菌落直徑35～40 mm，邊緣白色，中部灰綠色，平鋪，氣生菌絲稀少； 分生孢子結(jié)構(gòu)大量產(chǎn)生，質(zhì)地絨兼粉末狀或近顆粒狀，后期層狀脫落； 背面淺黃褐色，色素不溶于培養(yǎng)基中．分生孢子結(jié)構(gòu)大量，帚狀枝多見3輪生，排列緊密．分生孢子梗壁粗糙，無色； 瓶梗柱狀，頸部明顯，(7.5～12.3) μm×(2.0～3.5) μm； 分生孢子球形或近球形，光滑，串生，2.8～4.0 μm(圖1)．

β-微管蛋白(TUB)測(cè)定基因序列，基因序列測(cè)定結(jié)果為： 5’AAAGCTTGCCGAAGGGACCGGAGCGGACAGCGTCCATGGTACCAGGCTCCAAATCGACGAGAACGGCACGGGGAACGTACTTGTCACCGCTGGCCTAGATTATCAAGGAAAACATCCGATCAGATGATGCACTATTATTCGGTTTCCTGTCGTTGGACTCACATGGTTGAAGTAGACGTTCATACGCTCGAGCTGGAGGTCGGAGGTACCATTGTACCTAGGAAGATATCAGATGTGTAATCCACCGGAAACCCCTATCACTGTTAAAACTTACTGTCCATCGCCATCGAGACCGTGCTCGCCAGAGATGGTTTGCCTGTAATCCAGTTAGGAACCTGTCAATTGATACCCAACGCGAAAAAAAAAAGCTCGGCACTTACCAGAAAGCAGCACC-3’．將序列在NCBI上進(jìn)行BLASTS比對(duì)分析[21-22]，結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)[20]，該產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的菌種鑒定為皮落青霉(Penicilliumcrustosum)．

圖1 皮落青霉的菌落形態(tài)及顯微特征

2.2 硫酸銨分級(jí)沉淀及酶譜分析

硫酸銨百分比在0%～20%，20%～40%，40%～60%，60%～80%時(shí)，酶活比例分別為(2.58±0.02)%，(2.89±0.01)%，(30.46±1.04)%，(64.06±1.01)%； 可見硫酸銨比例低于40%時(shí)，聚半乳糖醛酸酶酶活所占比例很低，僅占總酶活的5.47%，聚半乳糖醛酸酶活力以硫酸銨沉淀40%～80%較高，尤其是比例為60%～80%時(shí)表現(xiàn)為更高的活力．皮落青霉產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶與商業(yè)果膠酶在48 kDa處有明顯聚半乳糖醛酸酶活性(圖2)．Kester等[27]從黑曲霉中發(fā)酵分離得到的2種多聚半乳糖醛酸酶分子量分別為55 kDa和38 kDa，倪鴻靜[28]從皮落青霉發(fā)酵液中分離得到的聚半乳糖醛酸酶分子量為38 kDa．

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，1為商業(yè)果膠酶，2，3為60%～80%硫酸銨沉淀，4為40%～60%硫酸銨沉淀．圖2 聚半乳糖醛酸酶的SDS-PAGE及酶譜分析

2.3 酶的最適溫度和熱穩(wěn)定性、 最適pH值和穩(wěn)定性

從圖3a可知，皮落青霉產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃．從圖3b可知，在25～40 ℃下，穩(wěn)定性較好，40 ℃保溫30 min仍能保持85.79%的酶活，45 ℃下保溫30 min能保持67.53%的酶活．從圖3c可知聚半乳糖醛酸酶最適pH值為5.0，其次為4.5．張名愛等[29]從草酸青霉中分離的PG酶最適溫度40 ℃，最適pH值 5.0．Kester等[27]研究發(fā)現(xiàn)黑曲霉產(chǎn)生的5種聚半乳糖醛酸酶的最適pH值在 4.3～4.9 的范圍內(nèi)．從圖3d可知在 pH值 2.2～8.0保持30 min，聚半乳糖醛酸酶酶活保留率都在80%以上，表明此酶耐酸性好，可適用于蘋果、 柑桔等酸性果汁加工生產(chǎn)．

圖3 溫度和pH值對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響

2.4 金屬離子對(duì)酶活的影響

在0.1 mmol/L，0.5 mmol/L下，K+，Na+，Mg2+，Ba2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Mn2+對(duì)聚半乳糖醛酸酶有激活效果，K+激活作用最強(qiáng)，0.1 mmol/L，0.5 mmol/L相對(duì)酶活力為118.70%，115.72%．在1 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L下，各金屬離子均呈抑制作用，其中Fe2+在10 mmol/L呈現(xiàn)激活表現(xiàn)，分析可能跟Fe2+在高濃度有顏色有關(guān)(圖4)．唐湘華等[30]對(duì)米曲霉產(chǎn)果膠酶添加金屬離子濃度5 μg/g，50 μg/g，500 μg/g，1 000 μg/g，發(fā)現(xiàn)Pb2+和Ag+嚴(yán)重抑制該酶活力，Cu2+抑制此酶，Mg2+、 K+、 Na+對(duì)酶無明顯激活或抑制作用，Ca2+有較弱的激活作用．Kanga等[31]從蝸牛消化液中提取純化出的2種多聚半乳糖醛酸酶(46 kDa和86 kDa)發(fā)現(xiàn)Ba2+是PG2的激活劑，Mn2+，Ca2+，Zn2+是抑制劑．

圖4 金屬離子對(duì)酶活性的影響

1表示單糖半乳糖； 2表示雙糖蔗糖； 3～8號(hào)樣品酶解時(shí)間分別為5 min，10 min，30 min，60 min，90 min，270 min； A，B為不同分子量的果膠低聚糖．圖5 果膠酶酶解果膠獲得的果膠低聚糖薄層色譜

2.5 聚半乳糖醛酸酶酶解果膠

分子量越小，在薄層板上移動(dòng)越快，試驗(yàn)結(jié)果看出，A和B的分子量高于半乳糖和蔗糖，判斷其為低聚糖，表明皮落青霉所產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶可用于生產(chǎn)果膠低聚糖．1號(hào)為單糖半乳糖，2號(hào)為雙糖蔗糖，3～8號(hào)樣品為低聚糖，酶解時(shí)間分別為5 min，10 min，30 min，60 min，90 min，270 min．隨著酶解時(shí)間延長，A和B顏色也逐漸加深，表明隨著酶解時(shí)間的延長，低聚糖的產(chǎn)量逐漸增加(圖5)．

鼠李糖、 阿拉伯糖、 半乳糖為單糖，蔗糖為雙糖，在氨基柱上，隨著分子量的增大，流出時(shí)間延長．4種標(biāo)樣的流出時(shí)間分別為： 1-鼠李糖4.252 min，2-阿拉伯糖4.664 min，3-半乳糖5.241 min，4-蔗糖5.901 min，見圖6a．柑桔果膠經(jīng)270 min PG酶酶解，除去多糖后液相色譜圖見圖6b，有3個(gè)單糖小峰，其余峰主要集中在5.634 min后，雙糖蔗糖的峰在5.901 min，表明所得糖主要為二糖以上的低聚糖．

a為標(biāo)準(zhǔn)品，其中1為鼠李糖，2為阿拉伯糖，3為半乳糖，4為蔗糖； b為水解后果膠低聚糖樣品．圖6 果膠酶酶解果膠獲得的果膠低聚糖液相色譜

3 結(jié)論與討論

本研究通過菌種的產(chǎn)酶篩選、 菌種鑒定、 發(fā)酵條件優(yōu)化、 酶學(xué)特性、 酶譜分析及酶的應(yīng)用等分析，獲得一株新型產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶菌株皮落青霉GYS-6，經(jīng)過柑桔果膠誘導(dǎo)可以生產(chǎn)耐酸性較強(qiáng)的聚半乳糖醛酸酶．單因素試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件將聚半乳糖醛酸酶活力從0.79 U/mL提高至3.59 U/mL．后期若要重復(fù)使用提高工業(yè)化應(yīng)用，可采用海藻酸鈣包覆的聚吡咯/銀納米復(fù)合材料固定PG的方法[32]．將粗酶用硫酸銨沉淀并用透析袋進(jìn)行透析后得到初步純化酶，對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該酶最適溫度45 ℃，最適pH值為5.0，低濃度的K+等離子對(duì)酶活有一定激活作用，濃度高于1 mmol/L對(duì)酶活有抑制作用．該酶在pH值 2.2～8.0保持30 min，酶活保留率都在80%以上，表明此酶耐酸性好，可較好的應(yīng)用于蘋果、 柑桔等酸性果汁生產(chǎn)．經(jīng)SDS-PAGE和酶譜分析，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)所得PG有聚半乳糖醛酸酶活性的酶活部分為48 kDa左右，有別于已報(bào)道的聚半乳糖醛酸酶[27]．本研究獲得的聚半乳糖醛酸酶用于酶解柑桔果膠，通過薄層層析和液相色譜法分析表明可以得到柑桔果膠低聚糖，這為制備功能性果膠低聚糖奠定了基礎(chǔ)，為柑桔的綜合利用提供了新的的途徑．