付強(qiáng),李澤宇，賀淵秀，塞力克·杰恩斯，楊莉，岳劍波，史慧君*

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2. 香港城市大學(xué)生物醫(yī)學(xué)系，香港 999077)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)屬于黃病毒科瘟病毒屬[1]，主要感染牛、羊、豬、鹿等家畜動物及部分野生動物，感染可造成易感動物的牛病毒性腹瀉/黏膜病(bovine viral diarrhoea/mucosal disease，BVD/MD)[2]，并以幼齡動物易感性最高[3]；主要臨床表現(xiàn)為高燒、腹瀉、白細(xì)胞減少、黏膜糜爛、孕畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸形胎、繁殖機(jī)能障礙等[4]。尤其是非致細(xì)胞病變型(non-cytopathic biotype，NCP)感染妊娠早期母牛導(dǎo)致小牛出生后產(chǎn)生持續(xù)性感染(persistent infection，PI)[5]，長期或終生帶毒，并經(jīng)常、反復(fù)、不定期向外排泄病毒，成為重要的傳染源[6]；同時PI犢牛一旦感染CP型BVDV[7]，可造成嚴(yán)重的黏膜病，表現(xiàn)為嚴(yán)重的口腔、食管和腸道等部位的黏膜糜爛、脫落、潰瘍、出血性炎癥、脫水、運(yùn)動失調(diào)等，致死率高達(dá)100%，而且BVDV常污染血清、凍精、凍胚等，對畜牧業(yè)的健康發(fā)展和牛源生物制品質(zhì)量提高等造成巨大的威脅[8-9]。目前我國尚無有效的藥物、疫苗和防控措施防控BVD[10]。

天然小分子化合物小檗胺(berbamine，BBM)是提取于小檗屬植物中的一種雙芐基異喹啉類生物堿[11]。目前，臨床醫(yī)學(xué)上BBM是一種成熟的化學(xué)藥物，用于化療、放療及慢性苯中毒后的一種免疫調(diào)節(jié)劑[12]，具有促進(jìn)白細(xì)胞增生、抗炎、抗結(jié)核、抗矽肺、抗腫瘤[13]、降血壓、抗心肌缺氧缺血、抗心律失常等作用[14]。BBM對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞有抑制作用[15]，對小鼠體外自然殺傷細(xì)胞活性有明顯促進(jìn)作用，在體內(nèi)外可誘生出較高水平白細(xì)胞介素II(IL-2)[16]，可避免用大劑量IL-2治療腫瘤時引起的毒副反應(yīng)。此外，BBM還是一種鈣調(diào)蛋白拮抗劑[17]，BBM及其衍生物對腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、人宮頸癌細(xì)胞、腹水癌細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞都有明顯的抑制作用[18]。BBM也可以減少氧自由基的損害作用[19]，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載[20]，對缺血組織有一定的保護(hù)作用以及作為一種自噬調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于人乳腺癌細(xì)胞的治療[21]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天然小分子化合物小檗胺抑制BVDV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制[22]，而BBM是否抑制BVDV體內(nèi)復(fù)制尚不明確。已有文獻(xiàn)報道小鼠可作為BVDV感染模型，病毒感染可造成組織學(xué)病變[23]。本研究結(jié)合BBM的用藥途徑及治療特性[24]，在BALB/c小鼠開展BBM預(yù)防保護(hù)試驗和治療試驗，為BBM用于BVD防治提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和實驗動物

BVDV毒株TC由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室冉多良教授惠贈，BVDV TC為CP型，屬于1b基因亞型。BALB/c小鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重約20 g，置于安靜、溫暖、避強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 試劑

BBM(HY-N0714A)、PEG300(HY-Y0873)和Tween 80(HY-Y1891)購自Med Chem Express公司；DMSO購自美國SIGMA公司；10%中性福爾馬林固定液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購自QIAGEN公司；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(RR036A)試劑盒購自TaKaRa公司；TRIzol購自Ambion公司；蘇木素伊紅染色試劑盒(G1120-3)購自索萊寶公司。

1.3 BBM稀釋

以50 mg/kg BBM為例，每只小鼠灌胃200 μL，按照以下方法進(jìn)行稀釋：1 mg BBM溶于10 μL DMSO溶液(終濃度5%)，配制的母液濃度為100 mg/mL。取10 μL母液，加入60 μL PEG300(終濃度30%)，混勻澄清后加入20 μL Tween 80(終濃度10%)，混勻澄清后加入110 μL ddH2O，混勻澄清。0 mg/kg BBM中除不含BBM外其他成分劑量相同，100 mg/kg BBM中BBM為2 mg，其他成分劑量相同。

1.4 BBM預(yù)防保護(hù)試驗

將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，每組8只，感染前使用0、50、100 mg/kg BBM灌胃小鼠，每只小鼠200 μL，每24 h灌胃1次，連續(xù)3次；第3次灌胃24 h后滴鼻感染105TCID50BVDV，每只小鼠滴鼻10 μL，48 h后再次感染，再次感染后繼續(xù)每24 h灌胃0、50、100 mg/kg BBM；首次感染后第5和10天時處死小鼠，每次4只，取肝、脾、腎、小腸等組織，其中以0 mg/kg BBM為對照組，50、100 mg/kg BBM為試驗組進(jìn)行后續(xù)熒光定量PCR并于40倍鏡下觀察各組織病理變化。

1.5 BBM治療試驗

將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分成2組，每組12只，使用105TCID50BVDV滴鼻感染，48 h后再次感染，感染后分別使用0和100 mg/kg BBM灌胃小鼠，每24 h 1次，于首次感染后第3、6和10天時處死小鼠，每次4只，取肝、脾、腎、小腸等組織，其中以0 mg/kg BBM為對照組，100 mg/kg BBM為試驗組進(jìn)行后續(xù)熒光定量PCR并于40倍鏡下觀察各組織病理變化。

1.6 qPCR檢測病毒載量

取肝、脾、腎、小腸等組織按田瑞鑫等[25]方法提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用熒光定量PCR檢測BVDV 5′UTR水平。檢測Ct值并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對后使用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。病毒載量(copies/mL)=(6.02×1023copies/mol)×(濃度g/mL)/(分子量 g/mol)。

1.7 組織病理切片檢測各組織病變情況

取肝、脾、腎、小腸等組織按文獻(xiàn)[26]制成組織切片，HE染色后使用中性樹膠進(jìn)行封片，顯微鏡下(40×)觀察組織病理變化情況；各組織病理變化程度以“-”無病變，組織完整無出血點；“+”輕度病變，組織腫大，被膜緊張，有少量出血點；“++”中度病變，組織有大量出血斑并形成白色壞死灶；“+++”嚴(yán)重病變，組織嚴(yán)重出血壞死，質(zhì)地軟爛如泥等情況判定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行兩獨立樣本t檢驗和單因素方差分析，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”，柱狀圖使用GraphPad Prism 5作圖。

2 結(jié)果

2.1 BBM預(yù)防保護(hù)BALB/c小鼠感染BVDV

0 mg/kg BBM預(yù)處理然后感染BVDV的小鼠表現(xiàn)出現(xiàn)精神沉郁、腹瀉等BVDV感染的示病癥狀。解剖可見肝臟有出血點，脾邊緣發(fā)紺并伴有腫大，腸道內(nèi)容物呈黃色水樣狀,腎臟表面充血、水腫質(zhì)地變軟。熒光定量結(jié)果如圖1所示，在5 d和10 d對照組各組織中BVDV 5′UTR水平較50 mg/kg和100 mg/kg處理組顯著升高；50 mg/kg BBM 預(yù)處理然后感染BVDV的小鼠精神狀態(tài)良好，病理剖檢可見肝、脾、腎、小腸等組織無出血點，各組織中BVDV 5′UTR水平較0 mg/kg的對照組顯著降低，與其他組織相比，小腸中降低最為明顯，而BVDV感染10 d時腎臟中5′UTR水平降低最明顯，約降低72倍；BVDV感染50 mg/kg BBM處理小鼠精神狀態(tài)良好，但被毛蓬亂，病理剖檢可見肝、脾、腎、小腸等組織有少量血點，10 d時各組織中5′UTR水平均出現(xiàn)顯著性降低，而5 d時腎臟和脾臟中5′UTR水平改變未出現(xiàn)顯著性差異。

注：同一組織不同BBM劑量組與對照組(0 mg/kg)比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

取肝、脾、腎、腸4個組織進(jìn)行HE染色，觀察結(jié)果(圖2)顯示：BVDV感染可引起腎臟出血、腎小球充血水腫及炎性細(xì)胞增多等現(xiàn)象；100 mg/kg BBM處理小鼠5、10 d，可顯著抑制腎臟出血及腎小球腫大；50 mg/kg BBM處理小鼠5、10 d，可有效減緩腎小球充血腫大，減少炎性細(xì)胞浸潤，使腎小球和腎小管間質(zhì)病變均勻。BVDV感染導(dǎo)致的肝臟出血、肝靜脈充血、肝細(xì)胞中可見少量顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)呈空泡狀等；50 mg/kg BBM處理小鼠5、10 d，可減少肝臟出血、肝靜脈充血；100 mg/kg BBM處理5 d可減輕上述癥狀；10 d可顯著抑制肝臟出血、肝靜脈充血，減少細(xì)胞中顆粒狀物質(zhì)產(chǎn)生及細(xì)胞質(zhì)空泡狀現(xiàn)象的發(fā)生，使肝小葉結(jié)構(gòu)完整、中央靜脈清晰、肝細(xì)胞索呈整齊的放射狀。BVDV感染可致小鼠脾臟充血，紅細(xì)胞顯著增多，紅髓與白髓界限不清晰，小梁增多；50 mg/kg BBM處理BALB/c小鼠5 d可減少脾臟充血，中性粒細(xì)胞增多；10 d時脾小梁減少，巨細(xì)胞增多，100 mg/kg BBM處理5 d可減少組織充血，白細(xì)胞增多，10 d時脾臟充血顯著減輕且紅髓與白髓界限清晰，出現(xiàn)少量巨細(xì)胞。BVDV感染可致小鼠小腸黏膜充血水腫，黏膜下層的炎性細(xì)胞增多，腸絨毛代償性增寬且縮短，隱窩減少且形態(tài)改變；50 mg/kg BBM處理小鼠5 d可減少小黏膜下層的炎性細(xì)胞浸潤，10 d可使隱窩增多，腸絨毛增長且隱窩增大；100 mg/kg BBM處理5、10 d可使腸絨毛上皮細(xì)胞由多層變?yōu)閱螌?。對每組具體病變程度見表1，結(jié)果表明 BBM處理BALB/c小鼠可有效抑制BVDV感染。

A. BVDV感染5 d；B. BVDV感染10 d

表1 BVDV感染BBM預(yù)處理BALB/c小鼠不同時間后各組織病理變化程度

2.3 BBM對BVDV感染的治療作用

如圖3所示，對照組中BVDV感染小鼠3、6和10 d后5′ UTR水平均較高，100 mg/kg BBM治療后各組織中BVDV 5′ UTR水平顯著性降低，其中BVDV感染10 d時，治療組肝臟中5′ UTR水平下降最為明顯，約降低26倍。

A. BVDV感染3 d；B. BVDV感染6 d；C. BVDV感染10 d

分別取腎、脾、腸、肝4個組織進(jìn)行HE染色，病理變化結(jié)果如圖4所示。與相應(yīng)對照組相比：100 mg/kg BBM處理BALB/c小鼠3 d可抑制BVDV感染引起的腎臟出血現(xiàn)象，6 d可減輕腎小球充血水腫等癥狀，10 d可顯著減少炎性細(xì)胞增多情況；BBM處理小鼠3 d 可減輕BVDV感染導(dǎo)致的小鼠脾臟中巨噬細(xì)胞增多的癥狀，6 d改善紅細(xì)胞增多、小梁增多等現(xiàn)象，10 d可顯著減少脾臟充血、減少脾小梁、改善紅髓與白髓界限不清晰等情況，同時中性粒細(xì)胞、巨細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量等增多；BBM處理小鼠3 d可減少小黏膜下層的炎性細(xì)胞浸潤，使腸絨毛增長隱窩增多且增大，6 d可使腸絨毛上皮細(xì)胞由多層變?yōu)閱螌樱?0 d可顯著抑制小腸黏膜充血水腫，黏膜下層的炎性細(xì)胞增多，腸絨毛代償性增寬且縮短，隱窩減少且形態(tài)改變等情況；BBM處理小鼠3 d可減少BVDV感染導(dǎo)致的肝臟出血、肝靜脈充血，6 d可使肝細(xì)胞索排列整齊，細(xì)胞質(zhì)呈空泡狀現(xiàn)象改善，10 d可顯著抑制肝臟出血、肝靜脈充血，減少細(xì)胞質(zhì)空泡狀現(xiàn)象的發(fā)生，使肝小葉結(jié)構(gòu)完整、中央靜脈清晰、肝細(xì)胞索呈整齊的放射狀。對每組具體病變程度進(jìn)行分析(表2)，結(jié)果顯示100 mg/kg BBM治療能有效緩解BVDV感染所致的小鼠組織損傷。

A. BVDV感染3 d；B. BVDV感染6 d；C. BVDV感染10 d

表2 BBM治療BVDV感染BALB/c小鼠不同時間后各組織病理變化檢測

3 討論

BBM是一種雙芐基異喹啉類生物堿，具有促進(jìn)白細(xì)胞增生、抗炎、降血壓、抗心肌缺氧缺血等功能，常用于免疫調(diào)劑化療、放療及慢性苯中毒后綜合癥[27]。而目前BBM是否具有抗病毒作用尚未見報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)BBM可有效抑制BVDV在牛腎細(xì)胞(Madin-Darby bovine kidney，MDBK)中的復(fù)制[22]，而BBM是否能防控BVDV感染BALB/c小鼠，尚未見報道。本研究開展BBM預(yù)防保護(hù)試驗以闡明BBM預(yù)防BVDV感染BALB/c小鼠的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用100 mg/kg劑量BBM提前灌胃BALB/c小鼠可有效降低BVDV感染程度，減輕BVDV感染造成的各器官組織病理損傷；而前期研究發(fā)現(xiàn)使用BBM預(yù)處理MDBK能有效抑制BVDV在MDBK細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA積累、5′UTR復(fù)制、致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)、滴度變化等，綜上BBM不僅能抑制BVDV感染宿主細(xì)胞，而且能有效保護(hù)BALB/c小鼠阻止BVDV感染。此外，本研究使用BBM治療BVDV感染的BALB/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBM處理后有效抑制BALB/c小鼠中BVDV的RNA復(fù)制，減弱BVDV感染BALB/c小鼠后造成的病理損傷。

Seong等[28]發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致BVDV感染小鼠的組織病理變化存在一定差異，但原因尚不清楚，可能與研究中使用的病毒株的毒力強(qiáng)弱和組織的差異性有關(guān)，也有可能是病毒感染途徑和攻毒劑量的不同所導(dǎo)致。根據(jù)BBM的用藥方法及吸收-代謝機(jī)制，灌胃的BBM通過腸吸收后經(jīng)肝臟代謝，故選擇肝臟、腸；考慮BBM是否具有一定腎毒性，故選擇腎臟；同時因BVDV感染特性嚴(yán)重影響其機(jī)體免疫，故選擇免疫器官脾，關(guān)于脾臟病毒含量很低的原因或與感染途徑相關(guān)，與Seong等[28]結(jié)果相似，但不同之處在于本試驗使用的BVDV(CP型)株毒力較強(qiáng)，具有短時間致消化系統(tǒng)病變的特點。盡管如此，100 mg/kg BBM對該BVDV毒株仍具有預(yù)防及治療作用。

BVDV、牛冠狀病毒(bovine coronavirus，BCoV)、牛輪狀病毒(bovine rotavirus，BRV)、牛腸道病毒(bovine enterovirus，BEV)等感染是犢牛腹瀉的主要致病因素。而在大群密集飼養(yǎng)時，犢牛腹瀉發(fā)生率常達(dá)90%以上，死亡率最高可達(dá)50%以上，對養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展威脅嚴(yán)重[29]。而BVDV、BCoV、BRV、BEV均屬于RNA病毒，那么BBM是否具有抑制BCoV、BRV、BEV感染的作用，值得進(jìn)一步研究。

綜上，本研究從BBM預(yù)防保護(hù)試驗和治療試驗兩個角度證實了BBM對BVDV感染BALB/c小鼠的防控作用，為探討B(tài)BM防控BVD提供有力的依據(jù)。