韋艷，張海英，歐冰凝，梁鋼

（1.武警廣西總隊醫(yī)院，廣西南寧530000；2.廣西醫(yī)科大學，廣西南寧530022）

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gal?late，EGCG）是茶多酚的主要組成成分，其結(jié)構(gòu)中含有多個鄰位羥基而具有較強的抗氧化性，已有大量的實驗研究證明EGCG不僅具有抗腫瘤活性，并且對腫瘤的多藥耐藥性有逆轉(zhuǎn)作用。但由于EGCG結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易發(fā)生氧化，生物利用度低，制約了其應用價值。本課題組通過乙?；磻筮M行結(jié)構(gòu)修飾得到表沒食子兒茶素沒食子酸酯全乙?；苌铮ˋc-EGCG），增加了其化學穩(wěn)定性。前期研究發(fā)現(xiàn)Ac-EGCG體外有較好的抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的作用［1-2］，本研究觀察Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細胞增殖的影響，并檢測Ac-EGCG作用于人口腔鱗癌耐藥細胞后對多藥耐藥1型基因（MDR1）、肺耐藥蛋白（LRP）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST-π）、DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）各多藥耐藥相關(guān)基因表達的影響，探討其逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的可能機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株人口腔鱗癌細胞KB及其耐藥株KBV200保存于廣西醫(yī)科大學實驗中心。人口腔鱗癌細胞KB及其耐藥株KBV200置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，KBV200細胞培養(yǎng)時加入200 ng/ml長春新堿（VCR）維持其多藥耐藥性。

1.2 藥品與試劑Ac-EGCG由本研究團隊合成（純度98.77%）；胰蛋白酶與牛血清購自美國Hyclone公司；Model-450酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Rad公司）；實時定量PCR儀（ABI PRISM7900 system，美國Ap?plied Biosystems公司）。

2 方法

2.1 甲基四唑藍（MTT）法檢測Ac-EGCG對耐藥細胞的抑制作用分別取對數(shù)生長期的人口腔鱗癌耐藥細胞，稀釋，調(diào)整單細胞懸液為1×105cell/ml，接種于同一96孔板中，每孔100μl，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將Ac-EGCG配制成不同濃度（60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L、960 mg/L）的系列溶液，每個濃度設(shè)4個復孔；對照組加入等量無血清RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 g/L MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO振蕩10 min，充分溶解藍紫色結(jié)晶，以酶標儀于492 nm處測定吸光值，實驗不同日重復測定3次取均數(shù)。計算各組細胞抑制率（IR）=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%。根據(jù)對應的抑制率用LOGIT軟件計算IC50（50%的細胞株生長受抑制時所需的藥物濃度）和IC10（10%的細胞株生長受抑制時所需的藥物濃度）。

2.2 MTT法檢測Ac-EGCG對細胞耐藥的逆轉(zhuǎn)作用實驗設(shè)空白對照組、陰性對照組、藥物組。取人口腔鱗癌耐藥細胞單細胞懸液1×105cell/ml種板，空白對照組僅加培養(yǎng)液，陰性對照組加入濃度梯度（0.5 mg/L，1 mg/L，1.5 mg/L，2 mg/L）的VCR（無Ac-EGCG作用耐藥細胞），藥物組選取3個對耐藥細胞株抑制率<10%的Ac-EGCG濃度（20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L）為試驗濃度，分別聯(lián)合濃度梯度的VCR（0.5 mg/L，1 mg/L，1.5 mg/L，2 mg/L）。按前述MTT實驗方法，LOGIT軟件計算各組VCR的IC50。逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)（reverse fold，RF）=VCR的IC50/聯(lián)合Ac-EGCG后VCR的IC50。

2.3 實時定量PCR檢測MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因的表達實驗分為陰性對照組和實驗組兩組。陰性對照組（KBV200組）：該組僅有KBV200細胞，不加藥物干預。實驗組（KBV200+Ac-EGCG組）：于KBV200細胞中加入98.2 mg/L Ac-EGCG培養(yǎng)48 h。引物以及PCR微陣列由上海康成生物工程有限公司提供。各樣品在5 ml EP管中配制混合液：2×Super Ar?ray PCR mastermix 550 μl，已 稀 釋 的cDNA102 μl，ddH2O 448 μl，總體積1 100 μl。加10 μl混合液到PCR微陣列對應的每個孔中，在設(shè)置PCR程序前將準備好的PCR微陣列放在冰上，所設(shè)置的程序如下：10 min 95℃，15 s 95℃，1 min 60℃（收集熒光）40個循環(huán)。所有樣本做3個復孔，實時定量PCR產(chǎn)物用融解曲線進行分析以排除是否有引物二聚體的干擾。反應設(shè)陰性對照（超純水代替引物及模板），以達到閾值的最低循環(huán)數(shù)（Ct值）計算樣本中基因的mRNA拷貝數(shù)相對量。采用ΔΔCt方法計算每個處理組中的每個通路反應孔相關(guān)基因ΔCt。ΔCt（對照組）=對照組平均Ct值-對照組看家基因平均Ct值；ΔCt（實驗組）=實驗組平均Ct值-實驗組看家基因平均Ct值。兩組差異基因ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組），通過2-ΔΔCt計算實驗組與對照組對應基因的表達差異倍數(shù)，差異倍數(shù)大于2為差異基因。

2.4 統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細胞增殖的影響不同濃度Ac-EGCG（60 mg/L、120 mg/L、240 mg/L、480 mg/L、960 mg/L）對KBV200作用48 h的抑制率（%）分別為：（5.56±0.11）%、（13.34±0.38）%、（18.70±0.59）%、（35.19±0.51）%、（67.10±0.24）%，隨著Ac-EGCG濃度增加，對KBV200的抑制率增加（P<0.05），呈濃度依賴性。Ac-EGCG對KBV200作用48 h的IC50為609.5 mg/L，IC10為98.2 mg/L。

3.2 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細胞耐藥性的影響20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L Ac-EGCG對VCR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為1.38、2.12、3.26倍（P<0.05），隨著Ac-EGCG濃度增加，對KBV200耐藥逆轉(zhuǎn)作用增加（P<0.05），呈濃度依賴性。見表1。

表1 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細胞耐藥性的影響 （±s）

表1 Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細胞耐藥性的影響 （±s）

注：與陰性對照組比較，①P<0.05；與20 mg/L Ac-EGCG組比較，②P<0.05；與40 mg/L Ac-EGCG組比較，③P<0.05

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3.3 實時定量PCR檢測各基因的表達情況見表2。Ac-EGCG可下調(diào)人口腔鱗癌耐藥細胞KBV200中MDR1、GST-π、TopoⅡ基因的表達，分別下調(diào)5.09、2.12、2.46倍（P<0.05）；而對LRP基因表達無影響。

表2 Ac-EGCG對耐藥細胞中MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因表達的影響 （±s)

表2 Ac-EGCG對耐藥細胞中MDR1、GST-π、TopoⅡ、LRP基因表達的影響 （±s)

注：與KBV200組比較，①P<0.05

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4 討論

本課題組在前期就Ac-EGCG對體外逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性進行了研究，現(xiàn)本研究在基因轉(zhuǎn)錄水平上進一步探討Ac-EGCG逆轉(zhuǎn)耐藥機制。在MTT法測定Ac-EGCG對人口腔鱗癌耐藥細胞增殖及耐藥性的實驗中，結(jié)果表明Ac-EGCG對KBV200的抑制率呈濃度依賴性，隨著濃度增加而提高，并且3個低于IC10濃度的Ac-EGCG都能下調(diào)長春新堿對KBV200的IC50，增加了KBV200對長春新堿的敏感性，說明Ac-EGCG可逆轉(zhuǎn)KBV200對長春新堿的耐藥性。

在檢測耐藥相關(guān)基因表達時發(fā)現(xiàn)，Ac-EGCG可下調(diào)人口腔鱗癌耐藥細胞KBV200中MDR1、GST-π、TopoⅡ基因的表達，而對LRP基因表達無影響。多藥耐藥1型基因（MDR1）可導致載體轉(zhuǎn)運蛋白P-糖蛋白（P-gp）過度表達，P-gp具有依賴ATP的“藥泵”功能，能夠增加藥物的外向轉(zhuǎn)運而降低細胞內(nèi)的藥物濃度，這是腫瘤經(jīng)典的耐藥途徑。目前國內(nèi)外研究的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑多數(shù)是針對此機制，所發(fā)現(xiàn)的中藥類MDR逆轉(zhuǎn)劑絕大多數(shù)仍然是P-gp競爭性抑制劑［3-4］。Ac-EGCG可降低MDR1基因的表達，這可能是其逆轉(zhuǎn)耐藥的途徑之一，至于Ac-EGCG是否可從RNA翻譯水平上抑制人口腔磷癌耐藥細胞中P-gp蛋白表達還有待下一步的研究。實驗還發(fā)現(xiàn)Ac-EGCG可下調(diào)人口腔磷癌耐藥細胞谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶-π（GST-π）基因的表達，GST是體內(nèi)重要的藥物代謝酶體系，GST-s不同同功酶對不同抗腫瘤藥物有一定特異性，其中GST-π與腫瘤耐藥密切相關(guān)，其作用機制可能為：GST催化抗腫瘤藥物與GSH結(jié)合，直接降低藥物活性；或核內(nèi)GST抑制藥物對DNA攻擊；或GST催化GSH與DNA競爭與金屬鉑結(jié)合，降低鉑類活性；此外，GSH在細胞損傷修復和解毒過程中也具有關(guān)鍵性作用［5-6］。同時，Ac-EGCG可下調(diào)人口腔磷癌耐藥細胞拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）基因的表達，拓撲異構(gòu)酶（Topoisom?erase）是一種能催化DNA超螺旋結(jié)構(gòu)局部構(gòu)型改變的基本核酶，許多藥物通過該酶與DNA形成共價復合物，引起DNA永久性損傷（DNA斷裂），導致腫瘤細胞凋亡。TopoⅡ活性降低、表達減少或基因突變，可使化療藥物喪失靶點產(chǎn)生耐藥［7-8］。實驗中檢測到Ac-EGCG對肺耐藥蛋白（LRP）RNA的表達影響不大，但在蛋白表達水平上Ac-EGCG是否通過LRP逆轉(zhuǎn)耐藥，值得進一步繼續(xù)研究。