肖昀明，湯黎峰，耿光瑞，張 穎，朱 飛，沈婉君，李清剛，陳香美 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 008； 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 腎臟病醫(yī)學(xué)部，解放軍腎臟病研究所，腎臟疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家慢性腎病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，腎臟疾病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京008； 廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 0006； 南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 0007； 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 超聲科，北京 008

目前終末期腎病的治療方案是以腎移植為主的腎替代治療，而腎移植受限于供體腎源短缺[1]。為解決此問(wèn)題，世界范圍內(nèi)展開(kāi)了腎再生技術(shù)的研究。近年來(lái)，源自天然腎的細(xì)胞外基質(zhì)引起研究者們的興趣，并將其作為再生支架廣泛應(yīng)用于生物人工腎工程中，已成為腎再生技術(shù)的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)經(jīng)過(guò)眾多學(xué)者們的努力，2009年首次報(bào)道的通過(guò)SDS溶液制備腎脫細(xì)胞支架，能夠成功脫細(xì)胞的器官有軟骨、骨骼肌、心臟、血管、肺、肝、胰腺等[2-8]。但專(zhuān)家學(xué)者們對(duì)基于完整器官的脫細(xì)胞支架制備方案并沒(méi)有共識(shí)，具體的灌注洗脫的流速與方式也沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[9]，也尚無(wú)系統(tǒng)研究比較暴露時(shí)間和不同方法對(duì)DNA去除、脫細(xì)胞支架宏觀和微觀結(jié)構(gòu)損失的影響[10]。本研究通過(guò)不同流速的洗脫劑灌注大鼠腎，從而制備脫細(xì)胞支架。并記錄不同流速下脫細(xì)胞所需要的時(shí)間、脫細(xì)胞支架的干重和鮑曼氏囊面積等，探究制備腎脫細(xì)胞支架所使用灌注液的最佳流速，評(píng)價(jià)腎脫細(xì)胞支架的完整性和安全性。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 120只SPF級(jí)別10周齡雄性SD大鼠，購(gòu)自斯貝福生物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，白天12 h/黑夜12 h循環(huán)，自由飲食飲水，飼養(yǎng)溫度為20℃～24℃，相對(duì)濕度為40%～60%。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)(2020-X 16-34)。

2 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料 氣體麻醉機(jī)(MSSN6089)；體式顯微鏡(TOPCON)；蠕動(dòng)泵(SENZ 310HT)；真空冷凍干燥機(jī)(科旺達(dá)生物儀器有限公司ZLGJ-10)；超聲儀(邁瑞M9，7 ～ 13 MHz線(xiàn)性列陣探頭)；電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器)；激光酶標(biāo)儀(TECAN)；組織研磨儀(QIAGEN)；紫外分光光度計(jì)(Nanodrop2000c)；SDS(VWR 0227)；磷酸鹽緩沖液(CORNING 21-031-CV)；注射用六氟化硫微泡(SonoVue)；24G動(dòng)靜脈留置針(BRAUN)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、過(guò)碘酸-希夫氏(PAS)染色試劑盒、MASSON染色試劑盒(索萊寶生物技術(shù)有限公司)；DNA提取試劑盒(QIAGEN)；SDS檢測(cè)試劑盒(Sangon Biotech)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(MCE HY-K0301)；永生化人腎小管上皮細(xì)胞(ATCC HK-2)；Anti-Collagen Ⅳ抗體(ABCAM a b236640)。

3 脫細(xì)胞支架的制備方法 30只大鼠用于制備腎脫細(xì)胞支架。大鼠麻醉后尾靜脈注射1 mL肝素濃度為250 U/mL的0.9%氯化鈉注射液，腹部正中切口，游離左腎及動(dòng)靜脈。近心端夾閉左腎動(dòng)脈后剪斷，用24G留置針插入左腎動(dòng)脈，3-0絲線(xiàn)結(jié)扎固定。夾閉并剪斷左腎靜脈及輸尿管。將腎完全浸沒(méi)于0.9%氯化鈉注射液中，使用蠕動(dòng)泵經(jīng)腎動(dòng)脈留置針灌注肝素氯化鈉注射液直至整個(gè)腎變?yōu)榛野咨?。將腎完全浸沒(méi)于在含有抗生素的磷酸鹽緩沖液中，置于-80℃低溫冰箱中。24 h后取出解凍，將解凍后的腎連接至蠕動(dòng)泵，將腎整個(gè)浸沒(méi)于0.9%氯化鈉注射液中，0.5% (w/v) SDS溶液灌洗，將蠕動(dòng)泵流速分別調(diào)整為0.1 mL/min(S0.1)、0.5 mL/min (S0.5)、1 mL/min (S1)、5 mL/min (S5)、10 mL/min (S10)、20 mL/min(S20)，每組5個(gè)腎。觀察并記錄腎變透明時(shí)間，待腎變透明后將蠕動(dòng)泵入口的液體更換為純水，灌 洗12 h。

4 脫細(xì)胞支架凍干及稱(chēng)重 30只大鼠用于天然腎和脫細(xì)胞支架的凍干及稱(chēng)重。純水沖洗脫細(xì)胞支架12 h后剪去留置針，和天然腎一起放置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)，開(kāi)啟冷凍模式4 h后轉(zhuǎn)為真空模式，干 燥24 h后取出稱(chēng)重，每個(gè)腎稱(chēng)量3次。

5 常規(guī)病理學(xué)觀察 30只大鼠用于脫細(xì)胞支架的常規(guī)病理學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色和透射電鏡檢查。將純水沖洗12 h后的各組脫細(xì)胞支架和天然腎置于10倍組織體積的固定液中固定24 h。組織經(jīng)梯度乙醇脫水后，氯仿透明、浸蠟、包埋后切片。觀察脫細(xì)胞支架是否將細(xì)胞洗脫干凈，行HE染色：常規(guī)脫蠟后蘇木素浸染2 min、鹽酸乙醇分化3 s、氨水反藍(lán)后伊紅浸染3 s，乙醇梯度脫水、二甲苯浸泡透明后封片。觀察腎中膠原纖維的保留情況、細(xì)胞核成分的殘留和計(jì)算鮑曼氏囊面積，行PAS染色：過(guò)碘酸1 h、希夫氏液40 min、溫水浸泡30 min后浸染蘇木素，經(jīng)鹽酸乙醇和氨水分化反藍(lán)，脫水、透明并封片。觀察膠原纖維的保留情況行Masson染色：媒染劑20 min、蘇木素染色并分化反藍(lán)，Masson染液浸染10 min后1%醋酸洗，再經(jīng)過(guò)2.5%磷鎢酸、2%橘黃G、1%苯胺藍(lán)染色，脫水、透明并封片。鮑曼氏囊面積使用image J軟件對(duì)PAS染色結(jié)果 中的進(jìn)行描邊測(cè)算。

6 免疫組織化學(xué)染色 脫細(xì)胞支架和天然腎石蠟切片常規(guī)脫蠟后，1 mol/L枸櫞酸鉀溶液浸泡，微波爐加熱修復(fù)抗原。山羊血清封閉后，加入一抗CollagenⅣ(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜，二抗孵育后，DAB顯色。蘇木素復(fù)染后脫水封片。上鏡觀察并對(duì)比天然腎和脫細(xì)胞支架的Ⅳ型膠原蛋白的分 布。

7 透射電鏡檢查 脫細(xì)胞支架經(jīng)固定、脫水、干燥處理，在包埋膠囊中用環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑包埋樣本。組織固化后，超薄切片機(jī)切片，厚度50 nm。用醋酸鈾飽和溶液、枸櫞酸鉛溶液染色。上機(jī)觀察 腎小球毛細(xì)血管袢、基底膜和鮑曼氏囊的完整性。

8 DNA和SDS殘留檢測(cè) 30只大鼠用于脫細(xì)胞支架的DNA和SDS殘留檢測(cè)。脫細(xì)胞支架經(jīng)純水灌洗12 h后，使用真空凍干機(jī)凍干脫細(xì)胞支架和天然腎，按照DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取脫細(xì)胞支架和天然腎的DNA，使用Nanodrop2000c對(duì)所提取的核酸進(jìn)行定量后對(duì)比DNA洗脫率。將凍干后脫細(xì)胞支架和天然腎在組織研磨儀中研磨，按照SDS殘留試劑盒說(shuō)明書(shū)操作萃取組織中的SDS并轉(zhuǎn)移至96孔板中，使用酶標(biāo)儀測(cè)量499 nm下各孔的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各組S DS殘留量。

9 DNA瓊脂糖電泳 配置1%瓊脂糖溶液(w/v)，微波爐中大火加熱3 min至均一透明，按照1∶10 000的比例加入核酸染料，混勻后倒入配膠槽并插入梳子。將配好的凝膠轉(zhuǎn)移至水平電泳槽，倒入TAE電泳液。第1個(gè)孔內(nèi)上樣6 μL DNA Ladder。將提取出的DNA加入DNA Loading Buffer，混勻后上樣，每孔上樣10 μL。第2～6孔加入天然腎提取的DNA，第7～11孔加入脫細(xì)胞支架提取的DNA。80 V恒壓電泳。上機(jī)拍照凝膠 ，觀察各組的DNA條帶的分布。

10 超聲及超聲造影檢查 脫細(xì)胞支架經(jīng)純水灌洗12 h后，使用魯爾接頭將蠕動(dòng)泵硅膠管與三通閥和腎動(dòng)靜脈留置針相接，注射器連接在三通閥上。將腎完全浸于0.9%氯化鈉注射液中，超聲探頭伸入液面以下，進(jìn)行灰階檢查觀察支架是否完整。開(kāi)啟蠕動(dòng)泵流速0.5 mL/min，造影檢查用0.5 mL 0.9%氯化鈉注射液稀釋50倍的微泡造影劑，1 s內(nèi)推注完畢，開(kāi)始推注造影劑的同時(shí)采集超聲造影視頻，觀察支架內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)化速度和支 架表面是否有造影劑滲漏。

11 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基按照GB/T 16886.5-2017中的方法制備脫細(xì)胞支架浸提液：將純水灌洗12 h后的脫細(xì)胞支架浸泡在5%含血清培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫箱中浸提72 h。對(duì)照組培養(yǎng)基不加入脫細(xì)胞支架，與實(shí)驗(yàn)組放置于相同條件下72 h。96孔板中接種HK-2細(xì)胞(3 000/孔)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各6個(gè)復(fù)孔，第2天待細(xì)胞貼壁后更換為各組的培養(yǎng)基100 μL/孔，放入二氧化碳孵箱中培養(yǎng)48 h，每天換液。48 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，放入孵箱中2 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔450 nm處的OD值，對(duì)比兩組OD值判斷脫細(xì)胞支 架的細(xì)胞毒性。

12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism進(jìn)行繪圖，計(jì)量資料以 xˉ±s表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05為差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 脫細(xì)胞支架的大體觀 在脫細(xì)胞過(guò)程中，可觀察到腎靜脈有深棕色的液體排出。隨后可觀察到整個(gè)腎從皮質(zhì)至髓質(zhì)逐漸分段變?yōu)橥该鳎捌谀I皮質(zhì)區(qū)域的脫細(xì)胞速度較快，后期髓質(zhì)區(qū)域的脫細(xì) 胞速度較為緩慢，直至整個(gè)腎變?yōu)橥该鳡?圖1)。

圖1 液體環(huán)境中的脫細(xì)胞時(shí)序變化(流速0.5 mL/min)Fig.1 Decellularization changes over time in liquid environment (flow rate 0.5 mL/min)

2 不同流速下腎脫細(xì)胞支架 通過(guò)不同的灌注流速洗脫腎制備脫細(xì)胞支架，可以觀察到隨著流速的增加，脫細(xì)胞的時(shí)間呈下降趨勢(shì)(圖2A)。當(dāng)流速為0.1 mL/min時(shí)，脫細(xì)胞的時(shí)間約1 h，當(dāng)流速大于10 mL/min時(shí)，脫細(xì)胞時(shí)間整體降為3 h以?xún)?nèi)。采用明顯超出SD大鼠腎動(dòng)脈生理流速的20 mL/min時(shí)，時(shí)間減小至1 h以?xún)?nèi)，制得的腎脫細(xì)胞支架發(fā)白、透光度較差。不同流速下制備的腎脫細(xì)胞支架經(jīng)凍干后稱(chēng)重，各組間無(wú)明顯差異，均在10 mg左右(圖2B)。相同的天然腎干重則 高達(dá)300 mg。

圖2 不同流速下的脫細(xì)胞表現(xiàn)A：不同流速下各流速組脫細(xì)胞所需要的時(shí)間(n=5)；B：天然腎和不同流速下制備的脫細(xì)胞支架的干重(n=5)；C：天然腎和不同流速下制備的脫細(xì)胞支架的鮑曼氏囊面積(n=5)。NK：天然腎；aP＜0.000 1Fig.2 Decellularization results at different flow ratesA: The time required for decellularization at different flow rates (n=5); B: The dry weight of decellularization at different flow rates(n=5); C: The area of Bowman's area decellularized at different flow rates (n=5). NK: natural kidney; aP＜0.000 1

3 不同流速下脫細(xì)胞支架的鮑曼氏囊面積 經(jīng)PAS染色的鮑曼氏囊面積計(jì)算發(fā)現(xiàn)，不同流速下腎脫細(xì)胞支架的鮑曼氏囊面積隨著流速增加而增大。以1 mL/min為分界線(xiàn)，當(dāng)流速小于1 mL/min時(shí)，鮑曼氏囊平均面積為2 000 μm2；當(dāng)流速超過(guò)1 mL/min后，腎脫細(xì)胞支架的鮑曼氏囊面積明顯增加(圖2C)。PAS染色中可見(jiàn)低流速各組(S0.1、S0.5、S1)中腎皮質(zhì)和髓質(zhì)中腎小球飽滿(mǎn)，基底膜完整，鮑曼氏囊完整，可見(jiàn)明顯的血管極和尿極。高流速組(S5、S10、S20)中發(fā)現(xiàn)有結(jié)構(gòu)萎縮的腎小球，球內(nèi)有紫色細(xì)胞核成分殘留。S20組中可觀察到鮑曼氏囊有破碎和不完整(圖3)。提示制備脫細(xì)胞支架的最佳流速應(yīng)為低流速，為了保證支架微結(jié)構(gòu)的完整性，我們?cè)诤罄m(xù)的試驗(yàn)中采取了 0.5 mL/min流速。

圖3 光鏡下不同流速制備的脫細(xì)胞支架的鮑曼氏囊PAS染色(200 ×)F ig.3 PAS staining of Bowman's capsule of decellularized scaffolds prepared at different flow rates under light microscope (200 ×)

4 病理染色及電鏡 病理染色可見(jiàn)，0.5 mL/min流速下的HE染色無(wú)細(xì)胞成分，PAS染色可見(jiàn)鮑曼氏囊結(jié)構(gòu)完整，基底膜連續(xù)且清晰，腎小管分布均一。通過(guò)Masson染色和Ⅳ型膠原免疫組化染色可見(jiàn)各組脫細(xì)胞支架均有膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)保留(圖4A)。電鏡可見(jiàn)鮑曼氏囊和基底膜連續(xù)且完整 ，且未觀察到有細(xì)胞成分的殘留(圖4B)。

圖4 0.5 mL/min流速下制備的脫細(xì)胞支架光鏡和電鏡下形態(tài)A：光鏡下脫細(xì)胞支架的常規(guī)病理染色和Ⅳ型膠原蛋白染色顯示0.5 mL/min流速下的脫細(xì)胞支架無(wú)細(xì)胞核成分，細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，有膠原蛋白的保留(標(biāo)尺=100 μm，200 ×)；B：腎脫細(xì)胞支架的透射電鏡，鮑曼氏囊(黃色箭頭)和基底膜(紅色箭頭)連續(xù)且完整(標(biāo)尺=2 μm)Fig.4 Light and electron microscopy results of the decellularized scaffold prepared at a flow rate of 0.5 mL/min A: The conventional pathological staining of the decellularized scaffold and Ⅳ collagen staining under light microscope showed that the decellularized scaffold at a flow rate of 0.5 mL/min had no nuclear components, the extracellular matrix structure was intact, and collagen was retained (scale bar=100 μm, 200 ×); B: the transmission of the kidney decellularized scaffold electron microscope showed that the Bowman's capsule (yellow arrow) and basement membrane (red arrow) were continuous and intact (scale bar=2 μm)

5 超聲及超聲造影表現(xiàn) 脫細(xì)胞支架內(nèi)血管和腎盂呈高回聲影，腎實(shí)質(zhì)部分呈低回聲影，脫細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)完整(圖5A)。腎脫細(xì)胞支架超聲微泡造影檢查可見(jiàn)整個(gè)腎均勻迅速?gòu)?qiáng)化，從皮質(zhì)區(qū)域開(kāi)始強(qiáng)化，逐漸擴(kuò)大到腎髓質(zhì)，腎皮質(zhì)強(qiáng)化明顯，血 管網(wǎng)絡(luò)通暢，腎表面無(wú)造影劑泄露(圖5B)。

圖5 0.5 mL/min流速下制備的腎脫細(xì)胞支架超聲及造影表現(xiàn)A：脫細(xì)胞支架超聲檢查顯示血管和腎盂呈高回聲影，腎實(shí)質(zhì)部分呈低回聲影，脫細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)完整；B脫細(xì)胞支架超聲微泡造影顯示整個(gè)腎均勻迅速?gòu)?qiáng)化，腎表面無(wú)造影劑泄露Fig.5 Ultrasound and contrast-enhanced ultrasound examination of kidney decellularized scaffold A: Ultrasound examination of the decellularized scaffold showed that the blood vessels and renal pelvis were hyperechoic, the parenchymal part of the kidney was hypoechoic,and the structure of the decellularized scaffold were integrity; B: Decellularized scaffold ultrasound microbubble contrast showed that the entire kidney was rapidly strengthened, and no contrast agent was leaked from the kidney surface

6 DNA及SDS殘留量 經(jīng)過(guò)測(cè)量，對(duì)照組天然腎DNA含量為(1 624 ± 315.91) ng/mg干重，0.5 mL/min脫細(xì)胞組DNA含量為(35.2 ± 12.13) ng/mg干重(圖6A)。瓊脂糖電泳顯示S0.5脫細(xì)胞組未見(jiàn)明顯長(zhǎng)核酸鏈(＞100 bp)的殘留(圖6B)。脫細(xì)胞支架純 水沖洗12 h后，SDS殘留低至本底水平(圖6C)。

7 安全性 相比對(duì)照組，腎脫細(xì)胞支架的含血清培養(yǎng)基浸提液對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響(圖6D)。表明我們制備的脫細(xì)胞支架本身無(wú)細(xì)胞毒性，制得的腎脫細(xì)胞支架符合現(xiàn)行的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo) 準(zhǔn)[11]。

圖6 腎脫細(xì)胞支架DNA和SDS殘留檢測(cè)和安全性檢測(cè)A：脫細(xì)胞支架與天然腎相比，脫細(xì)胞支架核酸殘留低于50 ng/mg干重；B：瓊脂糖電泳未見(jiàn)脫細(xì)胞支架組大于100 bp DNA條帶；C：SDS溶液脫細(xì)胞后沖洗12 h，SDS殘留低至本底水平；D：脫細(xì)胞支架浸提液的細(xì)胞毒性驗(yàn)證顯示與對(duì)照組無(wú)差異。aP＜0.000 1Fig.6 Renal decellularized scaffold residue detection and safety detectionA:Compared with native kidney, the residual nucleic acid of the decellularized scaffold is less than 50 ng/mg dry weight; B: Agarose electrophoresis showed that there was no DNA band larger than 100 bp in the scaffold group (Scaffold); C: SDS solution was decellularized and rinsed for 12 hours, the residue was as low as the background level; D: The cytotoxicity verification of the decellularized scaffold extract showed no difference when compared with the control group. aP＜0.000 1

討 論

脫細(xì)胞支架是生物組織和器官在經(jīng)過(guò)表面活性劑和酶的作用下去除細(xì)胞成分，同時(shí)又不影響細(xì)胞外基質(zhì)的情況下獲得的生物支架，隨后通過(guò)不同的接種策略使無(wú)細(xì)胞的支架得以再細(xì)胞化，以重現(xiàn)組織或器官功能[12]。與人工支架相比，腎脫細(xì)胞支架的優(yōu)勢(shì)包括：1)脫細(xì)胞支架具有獨(dú)特且精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)，難以人工實(shí)現(xiàn)；2)脫細(xì)胞支架中包含可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和黏附的蛋白和生長(zhǎng)因子；3)包含天然的動(dòng)靜脈和輸尿管結(jié)構(gòu)，可用于細(xì)胞植入和血液灌流[13]。

既往眾多文獻(xiàn)中研究者們將離體器官和組織快速冰凍后解凍，這樣可以在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶破壞細(xì)胞膜，在灌注過(guò)程中可以有效地將細(xì)胞碎片沖出腎內(nèi)部，且快速冰凍形成的小冰晶不會(huì)影響后續(xù)的支架再細(xì)胞化過(guò)程[14-15]。但我們實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融并不會(huì)有效提高脫細(xì)胞效率，因此我們僅將離體腎快速冰凍24 h以保證能將腎完全冰凍。

目前灌注洗脫劑制備脫細(xì)胞支架的流速還未達(dá)成共識(shí)，我們查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)常用的灌注流速為1 mL/min以下。因此我們主要觀察的實(shí)驗(yàn)流速設(shè)定為0.1 mL/min、0.5 mL/min、1 mL/min，并同時(shí)設(shè)置了5 mL/min、10 mL/min、20 mL/min作為對(duì)比。我們通過(guò)以上不同流速對(duì)腎進(jìn)行洗脫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著灌注流速的增加，脫細(xì)胞時(shí)間減少，但較高的灌注速度會(huì)造成鮑曼氏囊面積增大，以至于破裂，導(dǎo)致腎小球的細(xì)胞無(wú)法洗脫干凈。表明脫細(xì)胞過(guò)程中在一定范圍內(nèi)提高灌注流速可以有效減少脫細(xì)胞時(shí)間。我們?cè)诒狙芯恐胁捎玫氖桥c傳統(tǒng)懸吊法脫細(xì)胞不同的脫細(xì)胞方案，即將整個(gè)腎浸泡在液體中進(jìn)行脫細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，相較傳統(tǒng)懸吊法，在0.5 mL/min的流速下液體環(huán)境中脫細(xì)胞時(shí)間明顯縮短。可能原因是液體環(huán)境中的腎由于浮力的存在，可以給腎組織一個(gè)良好的支撐，使血管處于充盈狀態(tài)，洗脫試劑可以更好地灌注到腎內(nèi)部。

腎脫細(xì)胞支架的完整性關(guān)系到再細(xì)胞化效率[15-16]。為了更好地觀察到脫細(xì)胞后支架內(nèi)部的結(jié)構(gòu)情況，我們使用了超聲檢查和超聲造影檢查評(píng)估腎脫細(xì)胞支架的結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)?；译A檢查結(jié)果顯示支架外形結(jié)構(gòu)完整，造影檢查可見(jiàn)整個(gè)腎在1 s內(nèi)迅速?gòu)?qiáng)化，血管網(wǎng)絡(luò)通暢。由于超聲微泡無(wú)細(xì)胞毒性，殘留的微泡可在后續(xù)灌注培養(yǎng)中離開(kāi)支架內(nèi)部[17]。所以我們認(rèn)為超聲微泡造影可以作為腎脫細(xì)胞支架使用前的無(wú)創(chuàng)預(yù)先檢查手段，有效避免在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)血管網(wǎng)絡(luò)不通暢和灌注細(xì)胞時(shí)的泄露問(wèn)題。我們認(rèn)為可以用于腎再生技術(shù)的合格脫細(xì)胞支架應(yīng)至少符合以下條件：1)在進(jìn)行脫細(xì)胞程序前對(duì)目的腎進(jìn)行灰階及彩色多普勒超聲檢查，確認(rèn)腎形態(tài)、結(jié)構(gòu)無(wú)異常，血流通暢，排除占位性病變；2)超聲檢查可見(jiàn)脫細(xì)胞支架完整，可見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整的高回聲血管網(wǎng)絡(luò)；3)超聲微泡造影檢查支架迅速?gòu)?qiáng)化，血管網(wǎng)絡(luò)通暢；4)超聲造影檢查支架表面無(wú)造影劑滲漏。

由于移植后不良反應(yīng)的主要原因是支架內(nèi)殘留的DNA，因此支架內(nèi)DNA殘留是極為關(guān)鍵的因素[16]。本研究中制備的脫細(xì)胞支架符合脫細(xì)胞指標(biāo)要求。同時(shí)，SDS對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，在用純水灌洗脫細(xì)胞支架12 h后，支架內(nèi)的SDS平均殘留量低于安全水平(133 μg/g)[18]。最后我們對(duì)脫細(xì)胞支架浸體液和對(duì)照進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)后測(cè)試毒性，兩組間無(wú)顯著差異。因此我們制備的腎脫細(xì)胞支架安全、無(wú)細(xì)胞毒性，可以用于后續(xù)的再細(xì)胞化培養(yǎng)。

雖然已經(jīng)有膀胱和真皮等組織器官的脫細(xì)胞支架用于臨床使用階段，但由于腎脫細(xì)胞方法的不確定性以及腎脫細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，腎脫細(xì)胞支架的臨床應(yīng)用還有很大的挑戰(zhàn)[19-21]。目前尚未見(jiàn)腎脫細(xì)胞支架應(yīng)用于人體的報(bào)道，但已經(jīng)有很多團(tuán)隊(duì)將腎脫細(xì)胞支架應(yīng)用于動(dòng)物模型。在腎脫細(xì)胞支架的臨床應(yīng)用之前依然有較多問(wèn)題亟待解決，包括保留更多天然腎生物學(xué)特征的脫細(xì)胞方法、對(duì)腎脫細(xì)胞支架進(jìn)行化學(xué)物理修飾以產(chǎn)生足夠的生物學(xué)活性、適當(dāng)?shù)貙⒓?xì)胞重新種植于脫細(xì)胞支架特定區(qū)域的細(xì)胞接種方案等。相信隨著技術(shù)的進(jìn)步和實(shí)驗(yàn)方案的優(yōu)化，會(huì)有力地促進(jìn)生物人工腎的研制。

綜上，本研究通過(guò)不同流速灌注腎制備脫細(xì)胞支架，發(fā)現(xiàn)液體環(huán)境下0.5 mL/min是制備大鼠腎脫細(xì)胞支架的最佳流速，并提出了將超聲檢查和超聲微泡造影檢查作為脫細(xì)胞支架使用前的預(yù)先檢查手段，有助于脫細(xì)胞支架的后續(xù)應(yīng)用。