符 靜，劉 佳，王 廣

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院 內(nèi)分泌科，北京 100020

膽汁酸是膽固醇代謝的主要產(chǎn)物之一，在生理狀態(tài)下其合成、排泌和重吸收等過程都受到精確而復(fù)雜的調(diào)控。膽汁酸的主要作用是消化脂肪，此外膽汁酸信號通路在動脈粥樣硬化、高血壓、糖脂代謝等病理勝利過程中也發(fā)揮重要作用。甲狀腺功能亢進癥是內(nèi)分泌常見疾病，Graves病是其主要類型[1-2]。Graves病患者由于甲狀腺激素水平升高而對機體產(chǎn)生廣泛影響，包括對心血管、消化、血液等系統(tǒng)的損害[3-5]。最新數(shù)據(jù)表明，甲亢也會影響膽汁酸的代謝過程，但具體影響方式和結(jié)果尚未完全闡明，各項研究結(jié)果也不一致[6-8]。本研究通過比較Graves病患者與正常對照者血清中不同膽汁酸成分濃度的差異，進一步探討膽汁酸代謝產(chǎn)物與Graves病患者甲狀腺功能的相關(guān)性。

對象與方法

1 研究對象 本研究納入2018年11月- 2019年11月在北京朝陽醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的初發(fā)、未治療的Graves病患者39例，以及年齡、性別和體質(zhì)量指數(shù) (body mass index，BMI)匹配的健康對照者39例。Graves病組納入標(biāo)準(zhǔn)：1)血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)＞4.20 pg/mL，游離甲狀腺素 (free thyroxine，F(xiàn)T4)＞1.76 ng/dL，超敏促甲狀腺激素(sensitive thyroid stimulating hormone，sTSH)＜0.55 uIU/mL；2)伴有Graves病典型的臨床表現(xiàn)：乏力消瘦、怕熱易怒、易饑多食、手抖、竇性心動過速、大便次數(shù)增加等；3)促甲狀腺激素受體抗體(thyrotrophin receptor antibody，TRAb)陽性(＞1.75 IU/L)；4)彩超顯示甲狀腺腫大伴血流豐富；5)簽署知情同意書。健康對照者納入標(biāo)準(zhǔn)：1)血清FT3、FT4、sTSH水平正常；2)甲狀腺自身抗體陰性；3)甲狀腺超聲檢查無異常；4)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病，高血壓，心血管疾病，嚴(yán)重肝腎功能不全，惡性腫瘤，其他全身性疾病，孕婦，既往3個月內(nèi)服用影響甲狀腺功能的藥物。

2 方法 所有受試者空腹過夜后抽靜脈血10 mL，采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測FT3、FT4、sTSH和TRAb水平(Dimension Vista，西門子，德國)；采用自動分析儀(日立747，羅氏診斷，德國)檢測高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、總膽汁酸(total bile acid，TBA)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、α-羥丁酸脫 氫 酶(hydroxybutyrate dehydrogenase，HBDH)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-glutamyl transferase，GGT)、總膽紅素(total bilirubin，Tbil)、直 接 膽 紅 素(direct bilirubin，Dbil)、間接膽紅素(indirect bilirubin，Ibil)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)和尿酸(uric acid，UA)水平。血清標(biāo)本-80℃保存后，統(tǒng)一使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)與Xevo TQ-S micro相結(jié)合的方法，分析樣品中各種膽汁酸濃度[9]。甲狀腺超聲檢查由具有資質(zhì)的超聲醫(yī)生完成。比較兩組間上述指標(biāo)的差 異。

3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用R語言3.6.1進行統(tǒng)計學(xué)分析及相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果的可視化展示。計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以 xˉ±s表示，不符合正態(tài)分布以中位數(shù)(四分位間距)表示，組間比較分別采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。采用秩和檢驗比較病例組與對照組膽汁酸水平差異，P值采用FDR校正。采用Spearman檢驗分析差異膽汁酸代謝物濃度與甲狀腺 功能的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組基線特征比較 對照組與Graves病組的年齡、性別構(gòu)成、肌酸激酶、總膽紅素、尿素氮、空腹血糖、白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均＞0.05)，病例組FT3、FT4、AST、ALT、ALP、GGT、Dbil、TG和UA水平顯著高于對照組，sTSH、TC、HDL-C、LDL-C、TBA、Ibil、Cr和脂蛋白(a)水平顯著低于對照組( P均＜0.05)。見表1。

表1 對照組與Graves病組的基線特征比較Tab. 1 Baseline characteristics of the control group and the Graves disease group

2 兩組血清中膽汁酸成分比較 表2顯示，與正常對照組相比，Graves病例組的血清?；悄懰?taurocholic acid，TCA)、牛磺熊脫氧膽酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)和?；铅潦竽懰?tauroalpha-muricholic acid，T-alpha-MCA)濃度升高，甘氨脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid，GDCA)、鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)、脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)、石膽酸(lithocholic acid，LCA)、豬脫氧膽酸(hyodeoxycholic acid，HDCA)和牛磺脫氧膽酸(taurodeoxycholic acid，TDCA)的濃度降低(P＜0.05)。其余膽汁酸包括甘氨熊脫氧膽酸(glycoursodeoxycholic acid，GUDCA)、?；秦i脫氧膽酸(taurohyodeoxycholic acid，THDCA)等 的血清濃度在兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。

表2 對照組與Graves病組血清中不同膽汁酸成分的濃度比較[Md(IQR)]Tab. 2 Serum concentrations of bile acid composition in controls and Graves disease patients (Md[IQR])

3 血清中膽汁酸濃度與甲狀腺功能的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，在正常對照組中，9種差異膽汁酸代謝物的濃度與甲功之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性；病例組FT3水平與DCA(r=-0.379，P=0.039)、HDCA(r=-0.486，P=0.006)和CDCA(r=-0.361，P=0.046)均呈顯著負(fù)相關(guān)，與TUDCA呈顯著正相關(guān)(r=0.340，P=0.042)；FT4水平與CDCA(r=-0.408，P=0.023)、DCA(r=-0.427，P=0.019)、GDCA(r=-0.371，P=0.048)和HDCA(r=-0.447，P=0.012)均呈顯著負(fù)相關(guān)。見圖1。

圖1 在正常人(A)和Graves患者(B)中，9種差異膽汁酸代謝物與臨床指標(biāo)的Spearman相關(guān)性分析熱圖。紅色和紫色代表正相關(guān)，藍色和綠色代表負(fù)相關(guān)，顏色越深相關(guān)性系數(shù)越大；＊表示P＜0.05，具有相關(guān)性Fig.1 Heatmap plot of spearman correlations between nine differential bile acid metabolites and clinical indicators in controls (A) and patients with Graves disease (B). Red and purple regions represent positive correlation, blue and green regions represent negative correlation, and the shades of color indicate the strength of relevance among them. The asterisk (＊) indicates P＜0.05

討 論

膽汁酸由膽固醇在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)變而來，膽固醇7α羥化酶(cholesterol 7αhydroxylase，CYP71A)是其合成過程中的限速酶。作為膽汁的主要成分，膽汁酸可占膽汁總固體量的50%～70%。人體中的膽汁酸成分按結(jié)構(gòu)分為兩大類——游離型膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸。前者包括CA、CDCA、DCA及少量LCA，其中CA和CDCA是由肝細(xì)胞合成的初級膽汁酸，其余為次級膽汁酸。大部分膽汁酸通過與甘氨酸或?；墙Y(jié)合后成為甘氨膽汁酸或?；悄懼?，即結(jié)合型膽汁酸。排入腸道的各種膽汁酸，95%以上能夠在回腸末端被重吸收，經(jīng)門靜脈被肝細(xì)胞攝取，此即為膽汁酸的腸肝循環(huán)。因此，膽汁酸的代謝狀況可在一定程度上反映肝功能的變化[10-13]。

一直以來，膽汁酸被認(rèn)為在脂質(zhì)的消化吸收和膽固醇的代謝中發(fā)揮重要作用。事實上，近年來研究還發(fā)現(xiàn)，膽汁酸作為機體的信號分子，通過與其受體結(jié)合發(fā)揮多種生理作用[14]。人體內(nèi)存在多種膽汁酸受體，其中最主要是的核受體法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)[15]和膜受體G蛋白偶聯(lián)受體(Takeda G protein receptor，TGR5)[16]。FXR在人體內(nèi)的分布非常廣泛，其中高表達的器官包括肝、腸道和腎等，此外心臟、肺、脾也有分布。膽汁酸通過與FXR結(jié)合，在糖脂代謝、胰島素抵抗、肝保護等過程中發(fā)揮重要作用[17-18]。TGR5受體在人體內(nèi)也廣泛表達，如膽囊、肺、胎盤、心臟、脾、骨骼肌、腎、肝和小腸等。膽汁酸激活TGR5信號通路后，能夠調(diào)節(jié)膽囊的充盈、腸道的運動，參與糖脂代謝、調(diào)控能量平衡，并在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[19-21]。

Graves病是一種器官特異性自身免疫性疾病，其發(fā)病機制為體內(nèi)產(chǎn)生促甲狀腺激素受體刺激 性 抗 體(thyroid stimulating antibody，TSAb)，TSAb通過與TSH受體結(jié)合，使甲狀腺合成和分泌過量的甲狀腺激素，從而對靶器官造成損害[5]。其中肝是甲狀腺激素作用的重要器官之一，甲亢時常伴肝功能損害[22]。然而，在甲狀腺功能亢進狀態(tài)下，甲狀腺激素如何影響膽汁酸的濃度，目前尚無定論。研究證實，膽汁酸在甲亢的病變過程中存在著特異性變化[7,23]。其能否作為生物學(xué)標(biāo)志物、其在甲亢管理中的潛在臨床應(yīng)用價值值得進一步研究。

本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，Graves病患者血清中TCA、TUDCA和T-alpha-MCA水平顯著增加，LCA、DCA、GDCA、CDCA、HDCA和TDCA水平顯著降低。大量研究證實，甲亢患者進食后的膽汁酸分泌較健康對照者減少[20,24-25]；也曾有關(guān)于甲亢患者合并膽汁酸吸收不良的個案報道[26]。另有研究結(jié)果指出，甲狀腺激素可提高膽汁酸合成過程中限速酶CYP71A的活性；甲狀腺激素還可以通過增加膽汁酸主要攝取轉(zhuǎn)運體鈉離子-?；悄懰徕c共轉(zhuǎn)運多肽(sodium-taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP) mRNA的表達調(diào)控膽汁酸的代謝與吸收；甲亢導(dǎo)致的肝功能損害，影響了經(jīng)肝腸循環(huán)重吸收至肝的膽汁酸的有效攝取和重新利用，從而引起血液中膽汁酸濃度的變化[27-28]。

本研究在此基礎(chǔ)上進一步探討了膽汁酸的9種差異代謝物在甲亢患者中的變化。Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，病例組濃度顯著降低的差異代謝物HDCA、CDCA和DCA與FT3、FT4水平均呈顯著負(fù)相關(guān)；病例組濃度顯著升高的TUDCA與FT3呈顯著正相關(guān)，說明膽汁酸各種組分的異常濃度與Graves病有一定的關(guān)聯(lián)，但其具體關(guān)聯(lián)程度和相互影響方式還需進一步研究。值得注意的是，與之前的大多數(shù)研究不同，在本研究中，我們對膽汁酸成分和肝功能指標(biāo)進行了相關(guān)性分析，并未發(fā)現(xiàn)二者存在顯著相關(guān)，我們推測這可能和本研究的樣本量較小有關(guān)。因此，在今后的研究中，我們將繼續(xù)擴大樣本量，并根據(jù)肝功水平進行分層研究，以期發(fā)現(xiàn)二者之間可能的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。

以上研究結(jié)果提示膽汁酸各組分水平異常與Graves病患者甲功變化相關(guān)聯(lián)，本研究進一步豐富了甲亢患者的代謝組學(xué)異常表現(xiàn)，為今后尋找甲亢診斷預(yù)測因子及評估預(yù)后等方面的研究提供了依據(jù)，為解決臨床棘手的甲亢復(fù)發(fā)問題提供了一種新思路。但影響甲狀腺功能的因素很多，膽汁酸在發(fā)病機制及診斷、預(yù)后中的作用需進一步深入研究。