王思瑤,田清源,張林安,李佳馨,郭沙沙,毛丹丹,陳良碧

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室，中國湖南長沙410081）

水稻高溫熱害指氣溫超過水稻發(fā)育生理溫度上限,影響水稻正常開花結(jié)實,造成結(jié)實率降低甚至絕收的一種農(nóng)業(yè)氣象災(zāi)害[1]。水稻的生長周期較長,生殖生長階段對高溫更為敏感,當溫度超過35℃時,2 h的高溫就能使水稻育性顯著降低。高溫影響下,水稻花粉生長過程中由于水稻內(nèi)環(huán)境甚至細胞結(jié)構(gòu)被破壞,花粉發(fā)育不良,花粉活力降低?；ǚ勰讣毎麥p數(shù)分裂期是水稻對高溫最為敏感的時期,期間對水稻造成的傷害多為不可逆。其次是抽穗開花期,再次是灌漿初期和中期[2]。如果花期遭受高溫天氣,會導(dǎo)致水稻花粉育性下降,花藥開裂不全,柱頭沾染花粉粒數(shù)降低,花粉管萌發(fā)受阻等現(xiàn)象發(fā)生[3～6]。

周海等[7]在研究溫敏核不育系的育性基因調(diào)控時發(fā)現(xiàn),溫敏核不育系水稻的TMS5基因突變后,其編碼的RNase Zs1失去降解UbL40的mRNA能力,高溫條件下UbL40的mRNA大量積累,導(dǎo)致花粉不育；21℃較低溫度條件下,溫敏核不育系UbL40表達水平低,花粉可育。該研究結(jié)果表明,UbL40是響應(yīng)高溫而表達的基因,且與花粉發(fā)育有關(guān)。因此,常規(guī)水稻中該基因的表達是否響應(yīng)高溫,以及該基因的表達是否與花粉發(fā)育耐高溫有關(guān)是一個值得探討的問題。

本研究在高溫條件下對190份水稻資源材料的花粉育性進行比較,并在此基礎(chǔ)上分析UbL40基因的表達規(guī)律與水稻花粉育性的關(guān)系,旨在促進對水稻花粉耐高溫分子機制的認識和耐高溫水稻的選育。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的190份材料都為一季稻,其中107份為父本材料,由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點實驗室提供。

1.2 水稻材料的種植

實驗在湖南長沙湖南師范大學(xué)水稻實驗基地(北緯 28.12°,東經(jīng) 112.59°,海拔 45 m)進行。共設(shè)置3個播種期,分別為4月15日、4月30日和5月15日。采取盆栽種植,每盆插10株(桶口內(nèi)徑27.2 cm,高17.5 cm),每材料每期種植3盆。以7月中旬到8月中旬的盛夏高溫階段抽穗開花的材料為研究對象。溫度記載采用溫濕度記錄儀自動記錄。

1.3 花粉育性的鑒定

水稻始穗開花期選取稻穗的上、中、下各部3個穎花的花藥,用碘化鉀溶液制片,在光學(xué)顯微鏡下觀察花粉育性并計數(shù)和拍照。

1.4 水稻結(jié)實率的統(tǒng)計

成熟期每材料取5株統(tǒng)計總粒數(shù)和實粒數(shù),計算結(jié)實率。結(jié)實率(%)=實粒數(shù)÷總粒數(shù)×100%。

1.5 水稻花藥RNA的提取

取劍葉葉枕距為1 cm±1 cm的水稻幼穗,在冰上取花藥,液氮速凍后-80℃保存。一次取適量(約100 mg)花藥置于研缽的液氮中研磨。將粉末轉(zhuǎn)移至已加入1 mL Trizol的1.5 mL EP管中,混勻后冰上靜置5 min。加入1 mL的氯仿,充分振蕩后冰上靜置15 min,然后12 000 r/min、4℃離心15 min。轉(zhuǎn)移上清至另一1.5 mL EP管中,加入等體積的異丙醇,輕柔顛倒混勻后,于4℃或者-20℃靜置10 min,沉淀RNA。4℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清液。用預(yù)冷的75%乙醇重復(fù)洗滌沉淀,干燥后加入20 μL DEPC水,于60℃水浴鍋水浴10 min,使RNA充分溶解。吸取2 μL RNA于Eppendorf公司紫外分光光度計中檢測RNA純度與濃度,其余放置-80℃冰箱備用。

1.6 水稻花藥RNA反轉(zhuǎn)錄和定量PCR

水稻花藥RNA反轉(zhuǎn)錄和對目基因的定量PCR(real-time PCR)及檢測分別按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AT311-02 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix,北京全式金生物技術(shù)有限公司)和2×SYBR Green qPCR Mix(北京艾德萊生物有限公司)試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 不同水稻花粉育性耐高溫的差異比較

在水稻抽穗前后經(jīng)歷10 d持續(xù)自然日平均氣溫34.7℃高溫條件下,190個水稻材料的花粉育性和結(jié)實率差異顯著,可分為耐高溫和不耐高溫兩大類型,其中不耐高溫材料中又可分為花粉染敗、花粉典敗和無花粉3種高溫敏感型(表1)。

耐高溫水稻品種包括MCQA8等36個(表1、圖1)。高溫條件下耐高溫水稻的花粉可染率為95.2%～97.3%,結(jié)實率為87.7%～94.1%(圖2),日平均氣溫25.1℃的適溫條件下,花粉可染率為96.1%～98.9%,結(jié)實率93.2%～99.5%。該結(jié)果說明耐高溫水稻在不同溫度條件下,花粉育性和結(jié)實率變化不大。

圖1 不同溫度條件下水稻花粉育性比較Fig.1 Comparison of pollen fertility in rice under different temperature conditions

圖2 高溫條件下不同水稻品種結(jié)實性狀比較(A)結(jié)實穗表型；(B)結(jié)實率(n=3)。Fig.2 Comparison of seed-setting traits of different rice varieties under high temperature(A)Spike phenotypes；(B)Seed-setting rates(n=3).

在高溫條件下,花粉染敗率增加、結(jié)實率下降的水稻品種有華恢1006等135個,花粉可染率為11.3%～73.3%,結(jié)實率為13.0%～61.8%；在適溫條件下,花粉可染率為78.8%～98.5%,結(jié)實率為87.2%～98.4%。高溫條件下花粉以典敗為主的水稻有MZQA2等4個,其在適溫條件下育性正常。高溫條件下,鏡檢無花粉、結(jié)實率為零的水稻有YWQB3等15個,其在適溫條件下育性正常。

2.2 不同溫度條件下水稻幼穗中TMS5基因的表達差異比較

TMS5(thermo-sensitive genic male sterile 5)基因突變導(dǎo)致溫敏核不育系花粉不育[8～9]。為了探究常規(guī)稻在不同溫度條件下該基因的表達有否差異以及與花粉育性有否關(guān)系,選取耐高溫品種MZQA8、MCQA2以及不耐高溫的華恢1006(部分花粉染敗,結(jié)實率中等)、638和越1000父(無花粉型,結(jié)實率為零)為材料,比較不同溫度條件下TMS5基因的表達差異。結(jié)果顯示:在不同溫度下各水稻品種材料幼穗中均有TMS5基因的表達(圖3),高溫條件下TMS5的mRNA表達水平是適溫條件下的2～3倍,說明該基因?qū)Ω邷赜幸欢憫?yīng),但花粉耐高溫和不耐高溫的水稻之間該基因的表達水平?jīng)]有明顯差異,即該基因的表達水平與水稻花粉育性的相關(guān)性不高。

圖3 不同溫度條件下水稻幼穗中TMS5基因mRNA的相對表達水平比較Fig.3 Relative expression levels of TMS5 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions**:P＜0.01.

2.3 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL40基因的表達差異比較

溫敏核雄性不育系水稻幼穗中UbL40基因的mRNA表達水平隨著溫度的升高而增加,UbL40的mRNA累積導(dǎo)致溫敏核雄性不育[7～8]。以安農(nóng)S-1為陽性對照,對幾個代表性耐高溫和不耐高溫常規(guī)水稻品種幼穗中UbL40的mRNA水平進行比較分析,結(jié)果表明,各水稻幼穗在不同溫度下均有UbL401基因的表達,且高溫條件下UbL401的mRNA含量高于適溫條件下的含量。耐高溫的MZQA8和MCQA2中UbL401的mRNA相對表達水平明顯低于不耐高溫的華恢1006,而華恢1006的mRNA相對表達水平又低于無粉型的638、越1000父。這些結(jié)果說明,UbL401的mRNA相對表達水平與水稻花粉的可育性呈現(xiàn)負相關(guān)(圖4)。

圖4 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL401基因的相對表達水平比較Fig.4 Relative expression levels of UbL401 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions*:P＜0.05,**:P＜0.01.

UbL402基因包括UbL402a和UbL402b兩種同源異構(gòu)體。在高溫與適溫條件下,水稻幼穗中均有UbL402基因表達,且高溫條件下表達水平都升高。但不同水稻間UbL402a的mRNA相對表達水平無明顯差異(圖5A),而UbL402b的mRNA相對表達水平與水稻育性呈負相關(guān)(圖5B)。

圖5 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL402a(A)和UbL402b(B)基因的相對表達水平比較Fig.5 Relative expression levels of UbL402a(A)and UbL402b(B)mRNAs in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions*:P＜0.05,**:P＜0.01.

水稻中 UbL404基因分為 UbL404a、UbL404b和UbL404c。耐高溫和不耐高溫水稻中UbL404a、UbL404b和UbL404c基因都有表達(圖6),表達水平都是適溫條件下低,高溫條件下高,但不同水稻間UbL404a、UbL404b的相對表達水平?jīng)]有明顯差異,而UbL404c的相對表達水平(圖6C)與水稻花粉育性呈負相關(guān)。

圖6 不同溫度條件下水稻幼穗中UbL404基因的相對表達水平比較(A)UbL404a基因mRNA；(B)UbL404b基因mRNA；(C)UbL404c基因mRNA。Fig.6 Relative expression levels of UbL404 mRNA in the spikelets of different rice varieties under optimal and high temperature conditions(A)UbL404a mRNA；(B)UbL404b mRNA；(C)UbL404c mRNA.*:P＜0.05,**:P＜0.01.

以上結(jié)果表明,在常規(guī)水稻的幼穗中UbL40是受高溫誘導(dǎo)的基因,對于不耐高溫的水稻,其花粉敗育可能與UbL401、UbL402b和UbL404c的高表達有關(guān)。

3 討論

高溫對世界主要糧食作物特別是水稻的生產(chǎn)造成極大的威脅。探索高溫的影響機制,篩選和培育耐高溫的水稻品種是水稻科學(xué)研究的重要方向。本研究對190份水稻花粉育性耐高溫的差異進行了比較分析,發(fā)現(xiàn)受試水稻中大多數(shù)品種的花粉發(fā)育對高溫敏感,結(jié)實率低。這類花粉發(fā)育不耐高溫的水稻品種在長江中下游作為一季稻種植存在較大風(fēng)險,因為一季稻的花粉發(fā)育時期遇35℃以上高溫的頻率高。本研究鑒定出的耐高溫MZQA8、MCQA2等材料可作為長江中下游一季稻耐高溫育種的基因源。

周海等[7～9]研究發(fā)現(xiàn),TMS5基因編碼的RN-ase ZS1在野生型水稻中降解UbL40基因的mRNA,從而使水稻中的該mRNA保持在較低的水平。溫敏核不育系(如安農(nóng)S-1)中TMS5基因發(fā)生單堿基突變,不能產(chǎn)生活性RNase ZS1,在較高溫度條件下導(dǎo)致UbL40的mRNA積累,使不育系花粉敗育；在低溫條件下,由于UbL40表達降低,不育系花粉可育。周海等的研究還發(fā)現(xiàn),TMS5基因編碼的RNase ZS1在各組織的表達屬于組成型表達,其mRNA在高溫和低溫條件下都在花粉的小孢子母細胞(MMC)中相對富集,并不受低溫(23℃)或高溫(28℃)條件的影響,因而被認為是一個非溫敏基因。但本研究表明,在高溫逆境條件下TMS5基因的表達對高溫有一定響應(yīng),推測這種響應(yīng)可促進其對UbL40基因mRNA的降解,有利于花粉的發(fā)育,但耐高溫和不耐高溫水稻在高溫條件下該基因的表達沒有明顯差異,故TMS5基因是決定溫敏核不育系花粉育性的關(guān)鍵基因,而不是決定常規(guī)水稻花粉發(fā)育能否耐高溫的關(guān)鍵基因。常規(guī)水稻花粉發(fā)育是否耐高溫與UbL40基因有關(guān),即在常規(guī)水稻的幼穗中UbL40受高溫誘導(dǎo)表達,其中UbL401、UbL402b和UbL404c的過高表達導(dǎo)致不耐高溫的水稻花粉發(fā)育不良,結(jié)實率降低。相關(guān)分子機制有待進一步深入研究。