高 藝,魏紹琦,匡雪梅,邱義蘭

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)湖南長(zhǎng)沙410081)

辣椒屬茄科,富含維生素和多種礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)成分,同時(shí)具有藥用價(jià)值,是一種深受人們喜愛(ài)的重要的蔬菜作物和調(diào)味品,在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。采用傳統(tǒng)育種方法選育優(yōu)良辣椒品種耗時(shí)耗力,而且易造成作物遺傳多樣性的下降和有益基因的流失。在高效離體再生體系基礎(chǔ)上開展的轉(zhuǎn)基因技術(shù),是定向改良辣椒目標(biāo)性狀和開展功能基因組學(xué)研究的有力工具,但其巨大潛力的發(fā)揮依賴于高效離體培養(yǎng)再生體系的建立。辣椒屬于頑拗型離體再生和遺傳轉(zhuǎn)化的植物[1～4]。自Gunay于1978年首次開展辣椒組培工作至今四十余年,相繼有關(guān)于探索辣椒離體再生的文獻(xiàn)報(bào)道。據(jù)報(bào)道,辣椒離體再生的成功取決于辣椒基因型、培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度與組合、生長(zhǎng)室光溫條件、外植體類型等[4～6]。然而,當(dāng)前辣椒離體再生技術(shù)主要停留在芽誘導(dǎo)階段,仍然存在芽難以伸長(zhǎng)、生根困難等問(wèn)題。為了探索辣椒離體再生不定芽的伸長(zhǎng),一些研究者通過(guò)添加GA3誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng),但芽的伸長(zhǎng)效率低,且存在基因型依賴等問(wèn)題[4,7～8]。因此,辣椒通過(guò)組織培養(yǎng)獲得再生體系的技術(shù)一直未獲得重大突破。這限制了辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立和基因工程在辣椒遺傳改良上的應(yīng)用,故亟待建立高效、穩(wěn)定的辣椒離體再生體系。此外,雖然有關(guān)辣椒子葉離體再生的組織細(xì)胞學(xué)研究有零星的報(bào)道[9～10],但對(duì)其起源和發(fā)育過(guò)程缺乏系統(tǒng)的研究。在本研究中,我們選取辣椒骨干親本8214B子葉為實(shí)驗(yàn)材料,建立了一種適于辣椒離體再生的方法,同時(shí)對(duì)其發(fā)生發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)研究,為辣椒遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立、進(jìn)一步開展辣椒基因功能的驗(yàn)證和應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)辣椒遺傳改良的有效應(yīng)用等方面的工作奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料來(lái)自湖南省蔬菜研究所創(chuàng)制的辣椒骨干親本8214B。該材料具有抗逆強(qiáng)、配合力高、適應(yīng)廣等優(yōu)勢(shì),已成功育出多個(gè)優(yōu)良的辣椒新品種,并在我國(guó)大面積推廣,是我國(guó)應(yīng)用范圍最廣的骨干親本之一[11]。

外植體選用辣椒無(wú)菌苗子葉。

1.2 無(wú)菌苗培養(yǎng)

挑選健康無(wú)病菌的辣椒8214B種子,用純凈水浸種約48 h后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)中進(jìn)行表面消毒處理。先用75%乙醇對(duì)辣椒種子消毒60 s,然后用0.1%升汞消毒10 min,接著用無(wú)菌水沖洗4次,每次2 min,最后將種子接種于MB培養(yǎng)基(MS大量元素+MS微量元素+MS鐵鹽+B5有機(jī)成分,添加3%白糖和0.5%瓊脂粉,pH=5.8)上進(jìn)行光照培養(yǎng)(溫度25℃±2℃ ,光強(qiáng)2 500 lx,光周期14 h光照/10 h黑暗,下同)。約10 d,種子開始萌發(fā),生長(zhǎng)7 d后形成無(wú)菌苗。

1.3 子葉離體再生的誘導(dǎo)

選取即將展開或剛展開的無(wú)菌苗子葉,用鋒利的無(wú)菌刀片把子葉(帶葉柄)切下,去除葉尖,將兩端各有切口的子葉接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)(溫度25℃±2℃),子葉腹面朝上、背面朝下接觸培養(yǎng)基。誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MB為基本培養(yǎng)基,添加IAA(0.05 mg/L)與不同濃度配比的6-BA(0 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)和/或 ZT(0 mg/L、1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)組合(pH=5.8),每個(gè)組合接種子葉不超過(guò)20個(gè),每個(gè)組合設(shè)4次重復(fù)。暗培養(yǎng)20 d后觀察離體子葉再生的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況,統(tǒng)計(jì)再生誘導(dǎo)率。

離體子葉再生誘導(dǎo)率(%)=誘導(dǎo)再生的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%,下同。

1.4 子葉離體再生的組織細(xì)胞學(xué)觀察

植物材料選取8214B帶柄子葉外植體,釆用前面優(yōu)化的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)子葉進(jìn)行離體培養(yǎng)(1對(duì)子葉/瓶),每3 d取樣1次,重復(fù)4次,共取樣10次,進(jìn)行石蠟切片制作[12],光學(xué)顯微鏡(Olympua-bx51,日本)觀察拍照并分析結(jié)果。

1.5 離體子葉不定芽的伸長(zhǎng)

1.5.1 GA3對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響

將子葉離體再生誘導(dǎo)形成的葉狀體置于不同濃度GA3配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng),10 d繼代一次,20 d后觀察不定芽伸長(zhǎng)情況,并統(tǒng)計(jì)不定芽的伸長(zhǎng)頻率。誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)的培養(yǎng)基以MB為基本培養(yǎng)基,在上述獲得的適宜誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素組合的基礎(chǔ)上添加不同濃度配比的GA3(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L),每個(gè)組合接種10個(gè)再生誘導(dǎo)形成葉狀體的離體子葉,每瓶1個(gè)離體子葉,設(shè)4次重復(fù)。

不定芽伸長(zhǎng)率(%)=誘導(dǎo)不定芽伸長(zhǎng)的子葉數(shù)/接種的子葉總數(shù)×100%,下同。

1.5.2 刪減葉狀體對(duì)不定芽伸長(zhǎng)的影響

用鋒利的無(wú)菌刀片切除葉狀體,只留1～2對(duì)呈對(duì)生狀的長(zhǎng)條形葉狀體,在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行光照培養(yǎng),7～8 d繼代一次,20 d后觀察不定芽伸長(zhǎng)情況,并統(tǒng)計(jì)不定芽的伸長(zhǎng)頻率。伸長(zhǎng)培養(yǎng)基配方:MB為基本培養(yǎng)基,添加IAA(0.05 mg/L)與不同濃度配比的 6-BA(1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)和/或 ZT(1.0 mg/L、3.0 mg/L、5.0 mg/L、7.0 mg/L、9.0 mg/L)組合(pH=5.8)。每個(gè)處理接種6對(duì)子葉,每瓶1對(duì)子葉,重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體子葉的再生誘導(dǎo)

辣椒離體子葉在再生誘導(dǎo)過(guò)程發(fā)生了一系列的形態(tài)變化。離體子葉先進(jìn)行暗培養(yǎng):暗培養(yǎng)3 d時(shí)可見(jiàn)子葉由碧綠轉(zhuǎn)為黃綠；暗培養(yǎng)5 d時(shí)子葉增大增厚,兩端切口處開始形成愈傷組織；暗培養(yǎng)10 d時(shí)子葉體積進(jìn)一步增大,在葉柄端切口可見(jiàn)淺黃色透明狀愈傷組織,葉尖端切口形成白色愈傷組織；暗培養(yǎng)21 d時(shí)子葉葉柄端切口處誘導(dǎo)再生形成黃色葉狀體(圖1A)。隨后,經(jīng)暗培養(yǎng)的離體子葉見(jiàn)光培養(yǎng),7 d后子葉顏色由淺黃色轉(zhuǎn)為綠色,在子葉背面形成白色愈傷組織,葉柄端切口處再生的葉狀體轉(zhuǎn)綠,且體積明顯增大(圖1B)。

圖1 辣椒離體子葉在再生誘導(dǎo)過(guò)程中的形態(tài)變化(Bars=0.2 cm)(A)暗培養(yǎng)21 d的離體子葉,葉柄端切口處再生黃色葉狀體,葉尖端切口再生白色愈傷組織；(B)暗培養(yǎng)21 d后再光照培養(yǎng)7 d的離體子葉,子葉及葉柄端再生的葉狀體轉(zhuǎn)綠且體積明顯增大。Fig.1 Morphological changes of cotyledon explants during induction of in vitro regeneration(Bars=0.2 cm)(A)Cotyledon explants cultured in vitro in darkness for 21 days.Light yellow leafy structures can be seen at the petiole end and white calli at the opposite end；(B)Cotyledon explants cultured in darkness for 21 days and then under light for 7 days.The color of cotyledons changed from light yellow to green,and leafy structures significantly enlarged and their color changed from yellow to green.

外源激素對(duì)辣椒離體子葉再生誘導(dǎo)的效果見(jiàn)表1。從表1中可看出,帶柄子葉是一種很容易誘導(dǎo)再生的外植體,單獨(dú)添加6-BA和ZT或者不同濃度6-BA和ZT的組合均能100%誘導(dǎo)帶柄子葉葉柄端切口再生形成葉狀體,但不能形成可正常伸長(zhǎng)的不定芽,其再生形成的葉狀體的狀態(tài)存在差異。單獨(dú)添加1.0～9.0 mg/L 6-BA,帶柄子葉的葉柄端切口分化的葉狀體呈玫瑰花瓣?duì)?且數(shù)量較多；1.0～4.0 mg/L 6-BA條件下子葉形成的愈傷組織相對(duì)少,葉狀體生長(zhǎng)緩慢,而5.0～9.0 mg/L 6-BA條件下子葉形成的愈傷組織較多,葉狀體生長(zhǎng)較快。單獨(dú)添加不同濃度ZT誘導(dǎo)子葉再生的葉狀體形態(tài)存在明顯差異:低濃度ZT(1.0～3.0 mg/L)條件下形成的葉狀體短小呈玫瑰花瓣?duì)?其數(shù)量也少；ZT濃度增加至5.0～9.0 mg/L時(shí),子葉葉柄端切口處形成的葉狀體較大,大部分葉狀體呈玫瑰花瓣?duì)?少部分呈長(zhǎng)條形。然而,由于ZT誘導(dǎo)子葉形成的愈傷組織少,葉狀體生長(zhǎng)緩慢。不同濃度6-BA和ZT組合能100%誘導(dǎo)子葉葉柄端切口再生形成葉狀體,且數(shù)量較多,但是不同濃度組合誘導(dǎo)再生的葉狀體狀態(tài)及其生長(zhǎng)存在差異:低濃度6-BA和低濃度ZT組合誘導(dǎo)的葉狀體的體積小呈玫瑰花瓣?duì)?數(shù)量較少,生長(zhǎng)緩慢,隨著6-BA和ZT濃度的增加,誘導(dǎo)的葉狀體體積較大且數(shù)量多,當(dāng)6-BA≥5.0 mg/L時(shí),由于子葉形成較多的愈傷組織,葉狀體生長(zhǎng)較快。3.0～9.0 mg/L ZT和5.0～9.0 mg/L 6-BA組合均能使子葉再生較多的葉狀體,大部分葉狀體呈玫瑰花瓣?duì)?少部分呈長(zhǎng)條形(包括極少數(shù)對(duì)生的長(zhǎng)條形),且葉狀體生長(zhǎng)快,因此該濃度組合適宜于子葉離體再生的誘導(dǎo)。

表1 不同濃度ZT和/或6-BA配比對(duì)辣椒離體子葉再生的影響Table 1 Effects of different concentrations of ZT and/or 6-BA on in vitro regeneration of cotyledons in pepper

2.2 離體子葉再生的組織細(xì)胞學(xué)觀察

辣椒子葉由表皮、皮層和維管組織組成。表皮包括上表皮和下表皮,兩者均由單層細(xì)胞緊密排列。皮層分為柵欄組織和海綿組織,柵欄組織靠近上表皮,細(xì)胞呈柱狀緊密排列,海綿組織細(xì)胞形狀不規(guī)則,排列疏松。維管束散布在皮層中,由大維管束和小維管束組成。培養(yǎng)3～3.5 d后,離體子葉葉柄端切口處的上表皮以及與維管束之間近腹面一側(cè)的薄壁細(xì)胞去分化,細(xì)胞分裂活躍,尤其是上表皮及其內(nèi)側(cè)薄壁細(xì)胞染色較深,具有大的細(xì)胞核和濃厚的細(xì)胞質(zhì)(圖2A,B)；此時(shí),葉柄端切口附近的細(xì)胞未去分化,細(xì)胞分裂不活躍(圖2C)。培養(yǎng)5～7 d后,離體子葉葉柄端切口處上表皮及其內(nèi)側(cè)薄壁細(xì)胞脫分化并分裂形成分生細(xì)胞團(tuán)(圖2D),此時(shí)葉柄端切口附近的上表皮內(nèi)側(cè)薄壁細(xì)胞也發(fā)生脫分化并進(jìn)行活躍的細(xì)胞分裂,形成染色較深的分生細(xì)胞團(tuán)(圖2E)；分生細(xì)胞團(tuán)的形成具有時(shí)空分布特征,它們?cè)谏媳砥げ煌课幌群笮纬?圖2F)。當(dāng)培養(yǎng)8～11 d時(shí),分生組織細(xì)胞團(tuán)明顯增大,但未見(jiàn)典型的芽分化,隨著分生組織細(xì)胞團(tuán)的增大其分化形成葉狀體。在子葉離體培養(yǎng)過(guò)程中形成兩種分生細(xì)胞團(tuán):一種是單個(gè)分生細(xì)胞團(tuán),在分裂和分化過(guò)程中呈球形和心形(圖2G),其隨著體積的增大最后分化形成長(zhǎng)條形的葉狀體(圖3H)；另一種類型是在分裂和分化過(guò)程中幾個(gè)相鄰的分生細(xì)胞團(tuán)連在一起,它們最終形成花瓣?duì)畹娜~狀體(圖2I,J)。

圖2 辣椒子葉葉柄端離體再生的組織細(xì)胞學(xué)觀察(Bars=50 μm)(A)離體培養(yǎng)3 d的子葉切口處,上表皮及與維管束之間腹面一側(cè)薄壁細(xì)胞染色較深；(B)圖A的局部放大,上表皮及內(nèi)側(cè)薄壁細(xì)胞質(zhì)濃厚,細(xì)胞核大；(C)離體培養(yǎng)3.5 d的子葉近切口處,表皮及薄壁細(xì)胞未見(jiàn)脫分化；(D)離體培養(yǎng)5.5 d的子葉切口處,上表皮及內(nèi)側(cè)薄壁細(xì)胞脫分化,分裂活躍開始形成分生細(xì)胞團(tuán)；(E)離體培養(yǎng)6.5 d的子葉近切口處,誘導(dǎo)形成的分生細(xì)胞團(tuán)；(F)離體培養(yǎng)6.5 d的子葉切口處,上表皮不同部位先后形成分生細(xì)胞團(tuán)；(G)離體培養(yǎng)7.5 d的子葉誘導(dǎo)形成的單個(gè)分生細(xì)胞團(tuán)呈球形和心形；(H)離體培養(yǎng)10.5 d的子葉誘導(dǎo)形成的分生細(xì)胞團(tuán)分化成長(zhǎng)條形葉狀體；(I)離體培養(yǎng)10.5 d的子葉誘導(dǎo)形成的相鄰分生細(xì)胞團(tuán)連在一起；(J)離體培養(yǎng)11 d的子葉誘導(dǎo)形成的分生細(xì)胞團(tuán)分化成花瓣?duì)钊~狀體。Fig.2 Histocytological observation of in vitro regeneration of cotyledons in pepper(Bars=50 μm)(A)The incision of cotyledons cultured in vitro for 3 days.Some cells,including upper epidermal ones and the parenchyma ones between the upper epidermis and the vascular bundle,were deeply stained；(B)The local enlargement of Fig.A.The upper epidermal cells and their adjacent parenchyma ones had dense cytoplasm and a large nucleus；(C)A part next to the incision of cotyledons cultured in vitro for 3.5 days.The epidermal and parenchyma cells did not dedifferentiate；(D)The incision of cotyledons cultured in vitro for 5.5 days.The upper epidermal cells and their inside parenchyma ones dedifferentiated,which divided actively and began to form the meristematic cell mass；(E)A part next to the incision of cotyledons cultured in vitro for 6.5 days.The formation of meristematic cell mass was induced；(F)The incision of cotyledons cultured in vitro for 6.5 days.The meristematic cell masses were successively formed from different parts of the upper epidermis；(G)Cotyledons cultured in vitro for 7.5 days.The single meristem cell mass was sphere-or heart-shaped；(H)Cotyledons cultured in vitro for 10.5 days.The meristematic cell mass differentiated into a long strip-shaped leafy structure；(I)Cotyledons cultured in vitro for 10.5 days.The adjacent meristematic cell masses connected together；(J)Cotyledons cultured in vitro for 11 days.The meristematic cell mass differentiated into a rosetteshaped leafy structure.

2.3 離體子葉再生芽的伸長(zhǎng)誘導(dǎo)

2.3.1 GA3對(duì)離體子葉再生芽伸長(zhǎng)的影響

辣椒離體子葉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)再生形成不同形態(tài)的葉狀體,約98%的子葉離體再生的葉狀體數(shù)量多且大部分呈玫瑰花瓣?duì)?僅有約2%的子葉形成的葉狀體數(shù)量少且呈長(zhǎng)條形。用無(wú)菌刀片將葉狀體從離體子葉上切下,置于添加不同濃度GA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果表明:當(dāng)離體子葉再生的葉狀體數(shù)量多且呈玫瑰花瓣?duì)顣r(shí),在添加1.0～2.0 mg/L GA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d后,葉狀體呈淡綠色,葉明顯伸長(zhǎng)且變薄,但是未形成伸長(zhǎng)的再生芽(圖3A),繼續(xù)生長(zhǎng)7 d后,子葉愈傷組織褐化,葉狀體脫落；在添加3.0 mg/L GA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d后,葉狀體易形成水漬狀,葉明顯伸長(zhǎng),但也未形成伸長(zhǎng)的再生芽。當(dāng)離體子葉再生的葉狀體呈對(duì)生狀、長(zhǎng)條形且數(shù)量少(為1～3 對(duì))時(shí),在添加 1.0～2.0 mg/L GA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)7 d后,其再生芽明顯伸長(zhǎng),葉柄及葉片也伸長(zhǎng),葉片變薄呈淡綠色(圖3B)；3.0 mg/L GA3誘導(dǎo)培養(yǎng)的葉狀體的再生芽也能明顯伸長(zhǎng),但是易形成水漬狀。因此,1.0～2.0 mg/L GA3對(duì)離體子葉再生形成的數(shù)量少且呈長(zhǎng)條形對(duì)生的葉狀體的再生芽伸長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用,但是對(duì)玫瑰花瓣?duì)钊~狀體及非對(duì)生葉狀體再生芽的伸長(zhǎng)作用不明顯。

圖3 GA3對(duì)辣椒子葉葉狀體再生芽伸長(zhǎng)的影響(Bars=0.2 cm)(A)在添加2.0 mg/L GA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)7 d后,花瓣?duì)钊~狀體再生芽未見(jiàn)伸長(zhǎng)；(B)在添加2.0 mg/L GA3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)7 d后,對(duì)生葉狀體的再生芽明顯伸長(zhǎng)。Fig.3 Effects of GA3on the elongation of regenerated buds from leafy structures in cotyledon explants of pepper(Bars=0.2 cm)(A)Rosette-shaped leafy structures cultured under light for 7 days in the induction medium with 2.0 mg/L GA3.The regenerated buds did not elongate；(B)An opposite strip-shaped leafy structure cultured under light for 7 days in the induction medium with 2.0 mg/L GA3.The regenerated bud obviously elongated.

2.3.2 刪減葉狀體對(duì)離體子葉再生芽伸長(zhǎng)的影響

辣椒離體子葉在適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上再生形成的葉狀體未刪減直接在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng),未見(jiàn)再生芽的伸長(zhǎng)(圖4A)。用鋒利的無(wú)菌刀片將葉狀體刪減,只留1～2對(duì)呈對(duì)生的長(zhǎng)條形葉狀體,刪減葉狀體在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)2周后,再生芽明顯伸長(zhǎng),葉片碧綠呈長(zhǎng)橢圓形,莖粗壯(圖4B)。伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中不同濃度配比的ZT和BA對(duì)再生芽伸長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2。從表2中可以看出:1.0 mg/L ZT與1.0～9.0 mg/L 6-BA組合能使再生芽伸長(zhǎng)率≤40%；隨著ZT濃度的增加,葉狀體再生芽的伸長(zhǎng)率明顯升高,3.0～7.0 mg/L ZT 與 5.0～9.0 mg/L 6-BA組合能使再生芽伸長(zhǎng)率高于67%；5.0～7.0 mg/L ZT與7.0 mg/L 6-BA組合培養(yǎng)的再生芽伸長(zhǎng)率最高,為88%～90%,顯著高于其他組合,是適宜于再生芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中的激素組合。經(jīng)刪減僅存1～2對(duì)呈對(duì)生狀的長(zhǎng)條葉狀體在適宜的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)約15 d后,再生芽伸長(zhǎng)4～5 cm,為3～4葉1心的生長(zhǎng)階段。

表2 不同濃度配比的ZT和BA對(duì)再生芽伸長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different concentrations of ZT and/or 6-BA on the elongation of regenerated buds in pepper

圖4 刪減葉狀體對(duì)辣椒子葉葉狀體再生芽伸長(zhǎng)的影響(Bars=0.2 cm)(A)未刪減的葉狀體在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)2周后未見(jiàn)再生芽伸長(zhǎng)；(B)經(jīng)刪減僅剩1～2對(duì)對(duì)生的長(zhǎng)條形葉狀體在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)2周后再生芽明顯伸長(zhǎng)。Fig.4 Effect of pruning the leafy structures on the elongation of regenerated buds in cotyledon explants of pepper(Bars=0.2 cm)(A)Leafy structures not pruned and cultured under light for two weeks in the elongation medium.No buds elongated；(B)Leafy structures cultured under light for two weeks in the elongation medium after the rosette-like ones were pruned out and only 1～2 pairs of opposite strip-shaped ones remained.The bud obviously elongated.

3 討論

3.1 辣椒子葉的離體再生

辣椒屬于離體再生困難的植物,其外植體常常分化為葉狀體,葉狀體的芽難以伸長(zhǎng)會(huì)限制根的形成,使其不能形成完整植株,影響離體再生體系的建立,進(jìn)而影響辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的研究。辣椒子葉常被用作離體再生的外植體,其愈傷組織的誘導(dǎo)率高于莖尖、上胚軸、下胚軸等其他外植體。據(jù)報(bào)道,處于分化狀態(tài)的辣椒子葉回復(fù)到分裂狀態(tài)并開始快速的分裂分化需要適宜的外源激素,細(xì)胞分裂素6-BA搭配生長(zhǎng)素IAA可成功誘導(dǎo)辣椒子葉再生,但不定芽伸長(zhǎng)困難是限制該離體再生技術(shù)體系建立的瓶頸[4,13]。在本研究中,辣椒帶柄子葉是一種離體再生率非常高的外植體,生長(zhǎng)素IAA與細(xì)胞分裂素6-BA和/或ZT搭配可100%誘導(dǎo)子葉再生形成葉狀體,但葉狀體的狀態(tài)與細(xì)胞分裂素的類型及其濃度密切相關(guān):6-BA主要誘導(dǎo)離體子葉葉柄端切口玫瑰花瓣?duì)钊~狀體形成,ZT誘導(dǎo)再生的葉狀體包括玫瑰花瓣?duì)詈烷L(zhǎng)條形,而切口端愈傷組織的形成與6-BA密切相關(guān)。愈傷組織的快速生長(zhǎng)有利于從培養(yǎng)基中獲得包括植物激素在內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以供葉狀體的生長(zhǎng)。本文的研究結(jié)果顯示,在辣椒離體子葉再生過(guò)程中,5.0～9.0 mg/L 6-BA 與 3.0～9.0 mg/L ZT配比組合,使離體子葉再生形成的葉狀體大部分呈玫瑰花瓣?duì)?少部分呈正常長(zhǎng)條形,且生長(zhǎng)速度較快。

不定芽的伸長(zhǎng)是辣椒離體再生成苗的關(guān)鍵。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,GA3在辣椒不定芽伸長(zhǎng)過(guò)程中是必需的,可促進(jìn)不定芽伸長(zhǎng)[4,7～9]。有研究者在辣椒子葉離體再生過(guò)程中發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基中添加椰子水和AgNO3對(duì)芽的伸長(zhǎng)有促進(jìn)作用[14]。此外,有研究者發(fā)現(xiàn),及時(shí)切割分離葉叢或者膨大的葉狀體也有利于獲得更多的伸長(zhǎng)芽,推測(cè)其可能與葉叢的通氣、光照狀況有關(guān)[15]。在本研究中,GA3對(duì)離體子葉再生形成的數(shù)量少且呈對(duì)生狀的長(zhǎng)條形葉狀體的再生芽伸長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用,可使其形成葉色淡綠的纖細(xì)再生芽,但它們卻難以生根。與此不同,GA3對(duì)花瓣?duì)钊~狀體及非對(duì)生狀葉狀體的芽伸長(zhǎng)的作用不明顯。基于以上信息,我們創(chuàng)立了一種簡(jiǎn)單易行的能使再生芽伸長(zhǎng)的方法:刪減葉狀體至僅存留1～2對(duì)對(duì)生狀態(tài)的長(zhǎng)條形葉狀體。結(jié)果顯示,經(jīng)刪減的葉狀體在添加外源激素6-BA、ZT和IAA的培養(yǎng)基上被成功誘導(dǎo)再生芽伸長(zhǎng),形成葉色碧綠、健壯的再生芽,它們極易生根,形成根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)健壯的苗,經(jīng)煉苗移栽后,成活率高達(dá)100%。因此,辣椒離體再生不定芽的伸長(zhǎng)與誘導(dǎo)再生的葉狀體狀態(tài)及其數(shù)量緊密相關(guān)。

3.2 辣椒子葉離體再生誘導(dǎo)的組織細(xì)胞學(xué)研究

在植物離體培養(yǎng)中,外植體由特定部位的細(xì)胞先啟動(dòng)分裂形成愈傷組織產(chǎn)生胚性細(xì)胞,分化形成帶有原套和原體的生長(zhǎng)錐等不定芽早期結(jié)構(gòu)或者原胚等體細(xì)胞胚的早期結(jié)構(gòu),這些早期結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)一系列發(fā)育過(guò)程最終形成不定芽或者體細(xì)胞胚[12,16]。據(jù)報(bào)道,辣椒子葉離體培養(yǎng)誘導(dǎo)葉狀體由子葉葉柄端切口處直接誘導(dǎo)的畸形凸起發(fā)育而來(lái),它們難以形成正常的芽,推測(cè)這種畸形發(fā)育的葉狀體可能與分生組織退化有關(guān),而不是現(xiàn)有分生組織的芽發(fā)育缺陷[9]。在本研究中,辣椒離體子葉葉柄端誘導(dǎo)再生形成葉狀體,大部分葉狀體呈玫瑰花瓣?duì)?少部分呈長(zhǎng)條形(其中極少數(shù)呈對(duì)生狀),未見(jiàn)正常芽的分化。組織細(xì)胞學(xué)分析顯示,子葉葉柄端再生的愈傷組織起源于上表皮及其內(nèi)側(cè)的薄壁細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞分裂和分化形成分生細(xì)胞團(tuán),這些分生細(xì)胞團(tuán)的形成具有特定的時(shí)空特征,它們相繼突出上表皮。然而,分生細(xì)胞團(tuán)未見(jiàn)生長(zhǎng)錐等不定芽早期結(jié)構(gòu)的分化,不能直接形成芽,而是與周圍的愈傷組織細(xì)胞一起形成葉狀體。值得一提的是,我們觀察到極少數(shù)呈球型和心型的單獨(dú)的分生細(xì)胞團(tuán),它們可能繼續(xù)分化形成對(duì)生狀的葉狀體。在添加外源細(xì)胞分裂素6-BA和ZT以及生長(zhǎng)素IAA的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,不管GA3的添加與否,均能成功誘導(dǎo)對(duì)生狀葉狀體的再生芽明顯伸長(zhǎng),卻不能誘導(dǎo)非對(duì)生狀的葉狀體再生芽伸長(zhǎng)。因此,辣椒子葉誘導(dǎo)再生過(guò)程中葉狀體的形成可能是其分生組織的芽發(fā)育缺陷,而非分生組織的退化所致；對(duì)生的葉狀體的芽在誘導(dǎo)過(guò)程中能形成,但處于生長(zhǎng)停滯而非退化狀態(tài),隨著葉狀體的刪減,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素的集中使芽能快速生長(zhǎng)伸長(zhǎng)。