張勝東， 王勛功， 甄 毓??

(1. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室， 山東 青島 266100；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室， 山東 青島 266237；3. 中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院， 山東 青島 266100)

海底地下水排放是一種在不考慮水流組成和驅(qū)動力的情況下，通過海陸界面由海底排放進入近岸海域的尺度在幾米至千米的地下水流[1-2]。它既包括陸源淡水的排放，也包括再循環(huán)海水的排放，再循環(huán)海水的排放主要是由潮汐作用驅(qū)動的。越來越多的研究表明，海底地下水排放是地下水及其溶解化合物(如營養(yǎng)物質(zhì)、金屬化合物等)向海洋交換的最重要途徑之一，該過程可能對沿海生態(tài)系統(tǒng)造成巨大影響[2-3]，即使在潮汐作用下通過砂質(zhì)沉積物的再循環(huán)海水同樣能給近海地區(qū)貢獻可觀的物質(zhì)通量[4-6]，因此潮汐作用在沿海生物地球化學過程和水文循環(huán)中扮演著重要角色。

濱海地區(qū)作為海陸生態(tài)系統(tǒng)重要的過渡地帶，受潮汐作用顯著，使得濱海地區(qū)的物質(zhì)含量變化復雜，生物地球化學過程活躍，導致微生物生物代謝旺盛，種類及數(shù)量相對于其他生態(tài)系統(tǒng)具有很大的差異[7-8]。對美國馬薩諸塞州的科德角地區(qū)濱海濕地地下水生態(tài)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，由于地下淡水與海水混合，可能引起硝化與反硝化微生物生態(tài)位的重疊[9]。Edmonds等[10]對美國佐治亞州奧爾塔馬霍河濱海地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，海水對濱海濕地的入侵，導致被入侵地區(qū)微生物代謝途徑的改變，對微生物群落結構及功能造成一定影響。

微生物是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，由其介導的生物地球化學過程在碳、氮、磷、硫等生源要素循環(huán)中起關鍵作用[11]。沿海地區(qū)污水排放進入地下水系統(tǒng)，被污染的地下水進入濱海地區(qū)導致硝酸鹽污染[12-13]。由于濱海地區(qū)受潮汐作用影響，好氧、厭氧環(huán)境周期性交替，為生態(tài)系統(tǒng)的氮素循環(huán)提供了良好的環(huán)境條件，氮素遷移轉(zhuǎn)化活躍[14-15]。已有研究表明，微生物群落在濱海地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的氮素循環(huán)中具有重要作用，特別是在鹽堿地區(qū)[16]。

目前，潮汐作用對地下水微生物群落結構影響的研究未見報道。青島金沙灘位于山東半島南端，該地區(qū)沒有明顯的入海河流，其潮周期是正規(guī)的半日潮，潮汐作用對濱海淺層地下水影響顯著。因此，研究金沙灘淺層地下水微生物群落受潮汐作用的影響具有重要的科學意義。

本研究在青島金沙灘進行一個潮汐周期內(nèi)的淺層地下水中微生物連續(xù)采樣，分析其群落特征與環(huán)境影響因子，為探討濱海地下水中微生物群落動態(tài)變化規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 金沙灘淺層地下水樣品采集及保存

2016年11月13日在青島市黃島區(qū)金沙灘海水浴場采集地下水中細菌樣品。選取的采樣地點(35.96°N, 120.25°E)位于金沙灘潮上帶，離海距離約100 m，潮汐作用對該采樣點影響明顯且高潮時不會淹沒。在采樣地點采用鐵鍬挖掘出一個約2 m深的坑，每隔2 h用采水器采集2.0 L水樣(見表1)。用200目篩絹對水樣進行初步過濾以去除大顆粒懸浮物，再通過0.22 μm的聚碳酸酯膜過濾，將濾膜折疊放入凍存管中，于液氮中保存用于后續(xù)DNA分析。

表1 樣品信息Table 1 The information of samples

本研究的潮汐信息獲取于中國潮汐網(wǎng)，漲潮時間為10:00—16:00，16:00開始落潮。其中，10：00為最低潮時間，16：00為最高潮時間。

1.2 淺層地下水中理化參數(shù)測定

1.3 淺層地下水中細菌基因組DNA提取

從液氮中取出濾膜，用已滅菌的剪刀剪碎濾膜后置于離心管中，使用Powersoil?DNA Isolation Kit(MOBIO, USA)進行細菌總DNA提取，得到的DNA保存于-80℃冰箱中用于后續(xù)實驗。

1.4 金沙灘淺層地下水中細菌豐度分析

細菌16S rRNA基因qPCR檢測使用FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)試劑盒(羅氏，德國)，利用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對細菌16S rRNA基因進行擴增。擴增條件為：50 ℃ UNG酶激活2 min；95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火2 min，40個循環(huán)。每個地下水樣品設置3個平行樣，并在每個體系中設置1個陰性對照。為保證DNA擴增的特異性，對每個地下水樣品的DNA模板進行熔解曲線分析。

1.5 金沙灘淺層地下水中細菌群落結構及多樣性分析

1.5.1 Illumina高通量測序 使用細菌16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG)和806R(5′-GGA CTA CNN GGG TAT CTA AT)對細菌DNA進行PCR擴增。PCR反應條件為：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。細菌DNA擴增產(chǎn)物長度約為420 bp，產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，純化目的條帶，制備測序文庫，質(zhì)檢合格的測序文庫使用Hiseq2500 PE250平臺進行測序。

1.5.2 數(shù)據(jù)分析及處理 對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量篩選，去除引物、錯配堿基數(shù)大于1的序列以及質(zhì)量分數(shù)小于20的序列以獲得優(yōu)質(zhì)序列[17]，并對序列數(shù)量及長度進行統(tǒng)計。對上述獲得的優(yōu)質(zhì)16S rRNA基因序列以97%的相似水平作為OTU的劃分依據(jù)進行聚類。在QIIME9.0軟件(http://qiime.org)中選用BLAST的方法將代表序列與SILVA(http://www.arb-silva.de/)的SSU rRNA數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得每一個OTU在各分類階元的物種信息。物種注釋后，在各分類水平上對物種進行群落結構的統(tǒng)計分析[18]。使用QIIME9.0軟件對每個樣本在相同測序深度下分別計算Chao1、Shannon等Alpha多樣性指數(shù)，并繪制稀釋曲線。使用Canoco for Windows 5軟件對微生物群落結構與獲得的環(huán)境數(shù)據(jù)進行分析，獲得群落結構與環(huán)境因子之間的相關性。

1.6 序列登錄號

將獲得的細菌16S rRNA基因原始數(shù)據(jù)上傳到NCBISRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫中，登錄號為SRP133872。

2 結果與分析

2.1 淺層地下水中理化參數(shù)分析

表2 青島金沙灘不同采樣時間地下水理化參數(shù)Table 2 Environment parameters of shallow groundwater at different times in the Golden Beach

2.2 淺層地下水中細菌豐度分析

通過對金沙灘淺層地下水中的細菌qPCR分析，細菌16S rRNA基因的熔解曲線為單峰，表明熒光定量PCR反應過程無引物二聚體產(chǎn)生及非特異擴增發(fā)生。通過對各樣品中的細菌進行定量，每毫升水樣中含有的細菌16S rRNA基因的拷貝數(shù)介于7.55×104～2.94×105copies/mL。由圖1可知，細菌的豐度隨著采樣時間的推移表現(xiàn)出先下降后上升再下降的趨勢。通過分析發(fā)現(xiàn)，在漲潮前期，細菌豐度較高，而隨著漲潮時間的推移，細菌豐度降低，在漲潮中期細菌豐度達到較低水平。在漲潮后期及高潮階段，細菌豐度持續(xù)增加，到達退潮階段豐度又發(fā)生了明顯的降低。由于受到漲潮作用的影響，金沙灘濱海地下水中微生物群落豐度可能由于稀釋作用而迅速降低。由于存在地下水回流現(xiàn)象，導致細菌豐度在退潮階段出現(xiàn)明顯降低的趨勢。

圖1 青島金沙灘淺層地下水細菌豐度圖Fig.1 Bacterial abundance in shallow groundwater from Golden Beach

2.3 金沙灘淺層地下水中細菌群落結構及多樣性分析

2.3.1 細菌群落多樣性分析 對采集的地下水樣品進行細菌16S rRNA基因Illumina高通量測序發(fā)現(xiàn)，5個淺層地下水樣品共獲得164 587條高質(zhì)量序列。每個樣品的序列條數(shù)介于29 618～41 418條之間。序列相似度按97%進行歸并和OTU劃分，5個樣品共獲得3 276個OTUs，每個樣品的OTUs數(shù)介于2 185與2 551之間。通過對樣品中細菌α多樣性(見表3)分析發(fā)現(xiàn)，JS5.1的物種豐富度高于其他樣品，而JS4.1的多樣性高于其他樣品。5個樣品的覆蓋度均高于98%，說明得到的高質(zhì)量序列數(shù)能夠有效覆蓋樣品中絕大多數(shù)物種。

表3 青島金沙灘淺層地下水細菌群落多樣性指數(shù)Table 3 The diversity index of bacterial community in shallow groundwater from Golden Beach

2.3.2 細菌群落組成分析 OTU聚類注釋后，對各個樣品所得結果進行統(tǒng)計分析。5個樣品共檢測到45個門、81個綱、154個目、266個科、417個屬、166個種。

通過對綱分類水平研究，共檢測到12個優(yōu)勢菌群(見圖2)。其中變形菌門中的α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteobacteria)、ε-變形菌綱(Epsilonproteobacteria)在各樣品中均屬于優(yōu)勢菌，說明變形菌門是該研究區(qū)域地下水的優(yōu)勢菌。SAR202_clade、梭狀芽胞桿菌(Clostridia)、Cytophagia、芽孢桿菌綱(Bacilli)、Flavobacteriia、Bacteroidia等也是各樣品中的優(yōu)勢菌群。對優(yōu)勢菌群研究發(fā)現(xiàn)，α-變形菌綱在JS1.1及JS2.1中占據(jù)最優(yōu)勢地位，所占比重介于18.83%與35.98%，γ-變形菌綱在JS3.1、JS4.1及JS5.1中占據(jù)最優(yōu)勢地位，所占比重介于22.51%與26.92%之間。γ-變形菌綱在漲潮階段，隨著時間推移其所占比重逐漸上升，在JS4.1樣品中所占的比重達到最大值。

圖2 淺層地下水中綱分類水平上細菌的相對豐度Fig.2 The relative abundance of bacteria at class level in shallow groundwater

通過對細菌屬分類水平的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(見圖3)，不同樣本的細菌群落結構具有較高的多樣性及差異性，且每個站位均有60%以上的菌屬不能確定分類地位，大量未知的微生物資源有待深入研究。Shewanella、Nocardioides、Pseudomonas、Caulobacter、Arcobacter、Oceaniserpentilla、Novosphingobium相對豐度較高，為本研究淺層地下水中的優(yōu)勢類群。對優(yōu)勢屬的研究發(fā)現(xiàn)，Shewanella、Pseudomonas、Arcobacter在漲潮階段，隨著時間推移其所占比重逐漸上升，在退潮階段相對豐度逐漸降低。

圖3 淺層地下水中屬分類水平上細菌的相對豐度Fig.3 The relative abundance of bacteria at genus level in shallow groundwater

2.3.3 細菌群落相似性與差異性分析 對5個樣品進行OTU分布統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(見圖4)，5個樣品的核心OTUs共有948個，約占總數(shù)的28.9%。核心OTUs在各個樣品中所占比重普遍較高，相對豐度均高于84.28%，其中在JS1.1樣品中的相對豐度高達94.9%。通過對核心OTUs在各樣品中的比重分析發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，核心OTUs所占的比重逐漸減少，在JS5.1減少到84.3%。對每個樣品特有的OTU進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，各站位所特有的OTUs在72到148個不等，其中特有的OTUs絕大多數(shù)在各個樣品中的相對豐度小于0.01%，且其豐度之和在各個樣品中的比重均小于1%，所占的比重對金沙灘淺層地下水中細菌群落結構的影響較小。

圖4 淺層地下水中細菌群落OTU分布Venn圖Fig.4 The Venn diagram showing distribution of OTUs in shallow groundwater

由于核心OTUs在各個樣品中所占有的相對豐度均在80%以上，其對各樣品中的細菌群落結構具有支配地位。核心OTUs在各樣品之間的豐度差異是引起不同樣品間細菌群落結構差異的主要因素。隨著漲潮時間的推移，核心OTUs在樣品中比重逐漸降低，非核心OTUs在樣品中的比重逐漸升高。

2.3.4 淺層地下水中細菌樣本聚類分析 通過聚類分析對地下水中的細菌群落構建聚類樹發(fā)現(xiàn)，所有樣品共分為兩個分支，其中JS1.1、JS2.1兩個樣品聚為一個分支，JS3.1、JS4.1及JS5.1聚為另一個分支(見圖5)。

圖5 淺層地下水中細菌聚類圖Fig.5 The cluster of bacterial community in shallow groundwater

通過分析金沙灘的潮周信息，結合聚類樹分析發(fā)現(xiàn)處于漲潮前期的JS1.1、JS2.1樣品與處于退潮階段的JS4.1、JS5.1樣品之間存在較大的差異性。

2.4 淺層地下水中細菌群落與環(huán)境因子的相關性分析

圖6 淺層地下水中細菌群落及環(huán)境因子的RDA分析圖Fig.6 The redundancy analysis of bacterial community and environmental parameters in shallow groundwater

3 討論

本研究中的金沙灘為沙質(zhì)海灘，滲透能力較強，海水與地下水交換作用顯著，潮汐作用對地下水中微生物群落影響具有重要影響。

3.1 濱海淺層地下水中微生物群落多樣性

在綱分類水平上對優(yōu)勢菌群的研究發(fā)現(xiàn)，α-變形菌綱在漲潮前期樣品中占據(jù)最優(yōu)勢地位，而γ-變形菌綱在漲潮后期及退潮樣品中占據(jù)最優(yōu)勢地位。漲潮前后樣品中微生物群落變化明顯，整體來看，α-變形菌綱在樣品中的比重隨著時間推移其所占的比重逐漸降低，具有典型海洋特征的γ-變形菌綱[19]在群落中的比重顯著增高。說明受潮汐作用影響，海水入侵地下水，導致γ-變形菌綱等海洋細菌在群落中的比重逐漸增高。在屬分類水平上對地下水中細菌群落的研究發(fā)現(xiàn)，淺層地下水中含有大量海洋菌群，其中相對豐度較高的主要有Oceaniserpentilla(0.31%～4.27%)、假交替單胞菌屬(0.53%～1.30%)、赤桿菌屬(0.13%～0.62%)、弧菌屬(0.08%～0.58%)、海細菌屬(0.07%～0.28%)、海洋桿菌屬(0.10%～0.22%)、NS3a_marine_group(0.06%～0.17%)、假螺菌屬(0.05%～0.16%)、海洋球菌屬(Oceanococcus)(0.03%～0.15%)、鹽單胞菌(0.03%～0.14%)、Oceanisphaera(0.05%～0.13%)等[20-24]，其可能與海洋水體交換有關。因此，潮汐作用可能會導致濱海淺層地下水中細菌群落組成發(fā)生明顯變化。

通過對細菌群落結構進行分析發(fā)現(xiàn)，受到漲潮作用的影響，樣品中核心OTUs的比重逐漸降低，而非核心OTUs在樣品中的比重逐漸升高，這可能與海洋相關的微生物群落在地下水中的比例逐漸增大有關。目前已有研究表明，海水侵入地下水會導致地下水中微生物群落結構發(fā)生明顯變化[25]。因此，潮汐作用對濱海淺層地下水中微生物群落結構有巨大影響。

通過對各細菌樣本的聚類分析發(fā)現(xiàn)，漲潮前期的樣品之間、退潮階段的樣品之間的相似性較高，而漲潮高潮階段的樣品(JS3.1)與漲潮前期、退潮階段的樣品的差異性較大，漲潮前期與退潮階段的樣品之間差異性也較大。這可能是由于金沙灘為沙質(zhì)海灘且采樣點位于高潮線附近，地下水與海水交換滯后效應較小，受到潮汐的影響明顯。漲潮前期受到海水入侵作用引起地下水中微生物群落變化較小，在高潮期海水對地下水的入侵作用較為劇烈，因而引起地下水中微生物群落結構與漲潮前期微生物群落差異性較大。退潮階段樣品微生物群落結構相似性較高，可能是由于海水退卻及地下水回流，海洋作用對微生物群落的影響減弱。海水與地下水的雙重作用，可能是導致高潮階段樣品與退潮階段樣品微生物群落組成差異性較大的主要原因。

由于采樣站位距海較近，且沙質(zhì)海灘水滲透性好，潮汐作用的滯后效應小，海洋作用顯著，細菌豐度變化劇烈[25]。一個潮周期內(nèi)地下水樣品中的細菌豐度變化規(guī)律能夠基本反映出潮汐作用的影響。對金沙灘濱海淺層地下水中細菌群落豐度的研究發(fā)現(xiàn)，細菌的豐度變化趨勢在漲潮前期及中期表現(xiàn)出先降低后上升的趨勢，在退潮階段又出現(xiàn)了下降趨勢。Trick等[26]研究發(fā)現(xiàn)，地下水的高傳遞性能夠產(chǎn)生明顯的水剪切力，導致沉積物中的微生物發(fā)生吸附解析。細菌的豐度在漲潮前期呈現(xiàn)下降趨勢，可能是受漲潮作用影響，海水對地下水中微生物群落豐度產(chǎn)生稀釋作用。在高潮期，細菌豐度有一定程度的升高，可能是由于潮汐對地下水層的沖刷能力較強，沉積物中的微生物發(fā)生解析進入地下水中，進而導致細菌豐度有一定程度的升高。退潮階段，地下水中的一部分微生物發(fā)生吸附進入沉積物中，導致地下水中細菌豐度降低。因此，潮汐作用會導致濱海淺層地下水中細菌豐度發(fā)生明顯變化。

3.2 濱海淺層地下水中微生物群落生態(tài)功能

微生物群落作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，其在生源要素的生物地球化學循環(huán)中扮演了重要的角色。受到潮汐作用影響，淺層地下水中具有與其他陸地系統(tǒng)不同的微生物群落組成。已有研究發(fā)現(xiàn)，好氧、厭氧周期性交替的環(huán)境，利于氮素的生物地球化學循環(huán)[14-15]。

金沙灘淺層地下水樣品中與硫代謝相關的細菌所占的相對豐度在1.29%～1.80%之間，其中包括可進行硫酸鹽還原的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)，可進行硫氧化過程的Sulfurimonas、硫微螺菌屬(Thiomicrospira)、Sulfurovum、亞硫酸桿菌(Sulfitobacter)等細菌群落。地下水中微生物的硫代謝活動相對較弱，可能是由于該地區(qū)沒有河流輸入，缺乏硫酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的輸入。

4 結語

本研究基于分子生態(tài)學方法探討潮汐作用對淺層地下水中細菌群落結構、多樣性及豐度的影響。結果表明，潮汐作用明顯改變了地下水中細菌群落組成、結構及豐度。受潮汐作用影響，淺層地下水中與氮循環(huán)相關的細菌相對豐度較高、氮代謝活動旺盛。潮汐作用對地下水中微生物群落的影響不容忽視。