史明煒， 肖曉彤??， 劉 珂， 李 莉， 王玉玨， 趙美訓

(1.中國海洋大學深海圈層與地球系統(tǒng)前沿科學中心和海洋化學理論與工程技術教育部重點實驗室， 山東 青島 266100;2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室， 山東 青島 266237;3.華東師范大學河口海岸學國家重點實驗室，上海 200241)

沿海區(qū)域是氮元素海洋地球化學循環(huán)的重要場所，同時也被認為是厭氧氨氧化作用的重要地區(qū)[13-14]。尤其是在較易受人類活動影響的海灣區(qū)域，沿海人口增加及土地利用擴張導致的營養(yǎng)鹽荷載輸入增加為厭氧氨氧化活動提供了充足的反應底物；同時，營養(yǎng)鹽增加會引發(fā)赤潮和綠潮等生態(tài)災害，可能導致水體低氧區(qū)域增多，為厭氧氨氧化反應提供重要的環(huán)境條件。目前厭氧氨氧化作用主要的分析方法有生物標志物法、同位素標記法和分子信息學。在邊緣海區(qū)域，前人主要使用氮同位素標記法和分子信息學方法對厭氧氨氧化活動進行研究。如Song等[15]通過同位素標記法發(fā)現(xiàn)長江口有13%～50%的固定氮流失來源于厭氧氨氧化反應，Hou 等[16]使用生物信息學方法發(fā)現(xiàn)隨鹽度的增加，長江口沉積物中厭氧氨氧化種群結構由CandidatusBrocadia為主轉變?yōu)镃andidatusScalindua為主。以上兩種方法主要用于研究正在進行的厭氧氨氧化活動，而使用生物標志物法可以區(qū)分厭氧氨氧化菌的來源并獲得較長時間尺度的厭氧氨氧化活動記錄。

梯烷脂是厭氧氨氧化菌產(chǎn)生的特征生物標志物，可以指示海洋水體及沉積物中的厭氧氨氧化活動。梯烷脂主要存在于厭氧氨氧化菌中的厭氧氨氧化體(Anammoxosome)上，核心結構為3～5個鏈接起來的環(huán)丁烷基團(見圖1)。這種膜脂結構特殊，為厭氧氨氧化菌特有，且在自然條件下較為穩(wěn)定，易于辨識，指示性專一。通過對海洋沉積梯烷脂進行分析，能有效地指示該區(qū)域厭氧氨氧化活動的發(fā)生和相關菌種的來源，并進行氮循環(huán)歷史記錄的回溯[17-22]。國內對梯烷脂的研究主要集中在河口的典型缺氧區(qū)域， Hu等[21]通過對長江口水體顆粒物的分析，指出梯烷脂主要來自于水體原位產(chǎn)生；Zhao等[17]對長江口沉積柱的研究發(fā)現(xiàn)梯烷脂能較好地在百年尺度上重建長江口-東海區(qū)域的缺氧及富營養(yǎng)化歷史。但目前鮮有在與人類活動密切相關的海灣的梯烷脂研究。

圖1 核心梯烷脂結構示意圖Fig.1 The structure of ladderane fatty acids

膠州灣位于中國山東半島南部黃海之濱，形成于全新世時期黃海對山東半島的海侵運動，是典型的半封閉-封閉型海灣。其海域面積367.4 km2，但灣口入黃海最窄處僅有3.3 km。膠州灣除了與黃海進行物質交換，還受到陸源輸入和人類活動排放的強烈影響。海灣西部有大沽河、洋河，東部有墨水河、白沙河、李村河等河流匯入，河流入灣總徑流量約9×108m3[23]。膠州灣周圍設置了數(shù)十個污水排放口，主要集中在東岸。海灣內水文狀況主要受潮流和余流的影響，加之河流徑流的輸入，導致海灣水文狀況較復雜，整體易受人類活動排放的影響。膠州灣被中國北部沿海的大型城市青島所環(huán)繞，其海域狀況與青島市海洋經(jīng)濟發(fā)展水平、污水排放及城市化程度密切相關。已有的研究表明，膠州灣水質狀況從20世紀末呈明顯的惡化趨勢，但在21世紀初隨著海洋國家自然保護區(qū)的劃定有所改善。營養(yǎng)鹽濃度在2002年左右呈中度營養(yǎng)和富營養(yǎng)化水平，隨后海水富營養(yǎng)化有所緩解[24]。溶解氧濃度從1998年的9 mg/L迅速下降至2002年的5 mg/L，隨著隨后十年中水質的改善，溶解氧濃度得以上升[25]。本研究使用生物標志物法，運用梯烷脂從有機碳循環(huán)的角度研究膠州灣的厭氧氨氧化活動。本文主要通過生物標志物和總有機質指標(TOC, TOC/TN，δ13C)來研究沉積物中陸海源有機碳的貢獻，通過梯烷脂的分布來討論厭氧氨氧化活動的來源，并探討厭氧氨氧化活動對海洋環(huán)境因素的響應與指示作用。

1 研究區(qū)域及方法

1.1 樣品采集

(藍色圓點為采樣站位。Blue points represent sampling sites)圖2 研究區(qū)域及采樣站位Fig.2 Map of study area and sampling sites

1.2 沉積物粒度及總有機碳分析

有機質會附著在沉積顆粒表面，使沉積顆粒的粒徑增加，為保證絕大多數(shù)有機質能被去除，又不至于高溫破壞顆粒結構，將凍干沉積物樣品置于馬弗爐350 ℃高溫去除有機碳(12 h)。降至室溫后加入分散劑(六偏磷酸鈉溶液，1 mol/L)，隨后使用粒度自動測定儀(Mastersizer 3000)進行測定，測定結果取平均粒度進行分析。

稱取1 g左右凍干沉積物并研磨均勻，使用4 mol/L的鹽酸除去沉積物樣品中的無機碳組分后將樣品在55 ℃的烘箱中烘干，平衡24 h后, 使用CHN元素分析儀(Thermo Flash EA2000)測定TOC和TN。得出原始數(shù)據(jù)后進行校正以避免酸洗過程中的損失對TOC和TN的影響。校正方法如下：

酸洗前稱量凍干沉積物總質量m1，酸洗后稱量凍干沉積物總質量m2，酸洗后實測樣品TOC含量為a。求得校正后的樣品TOC含量為 TOC=a×m2/m1；TN校正方法同TOC。

TOC和TN的標準品為Atropina Standard(TOC=70.56%)和Low Organic Content Soil Standard OAS(TOC=(1.61±0.09)%)，TOC與TN標準偏差使用標準Low Organic Content Soil Standard OAS測得，分別為0.02% (n=6)及0.002% (n=6)。

上述預處理沉積物使用穩(wěn)定同位素比質譜儀(Elemental Analyzer-Isotope Ratio Mass Spectrometer, EA-IRMS)在連續(xù)流模式下進行有機碳的δ13C測定，使用穩(wěn)定同位素比質譜儀測定δ13C的標準品為USGS-40(δ13C =-26.39‰), IAEA-600(δ13C =-27.77‰)和IAEA-CH3(δ13C =-24.72‰),標準偏差使用標準USGS-40(δ13C =-26.39‰)測得為0.6‰(n=6)。

標準偏差公式如下：

式中：Xi為標準品實測值；X為測定均值；n=6。

1.3 生物標志物分析

本研究計算陸源有機質貢獻指標所使用的類脂生物標志物主要包括正構烷烴、甾醇和支鏈甘油二烷基甘油四醚(br-GDGTs)，使用萃取分離法進行富集。將凍干并研磨均勻的沉積物樣品加入內標(C19-醇, C24-氘烷和C46-GDGT)，使用二氯甲烷∶甲醇(3∶1)溶劑進行超聲萃取。萃取后混合液使用氮吹富集，并用6%氫氧化鉀-甲醇溶液水解。水解12 h后使用正己烷萃取，先使用正己烷洗脫正構烷烴組分，再使用二氯甲烷∶甲醇(95∶5)洗脫甾醇和GDGTs組分。正構烷烴和甾醇組分使用氣相色譜儀(FID-GC，Agilent 7890N，色譜柱為HP-1毛細管柱)進行測定，GDGTs組分使用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(HPLC-MS，Agilent1200/Waters-Quattro Ultima Pt mass，色譜柱為Prevail Cyano 正相色譜柱)進行測定。

本研究使用梯烷脂作為厭氧氨氧化的標志物，使用萃取分離法進行富集。凍干并研磨均勻的沉積物樣品加入二氯甲烷∶甲醇(2∶1)溶劑進行萃取，然后使用活化銅粉除去殘余的硫，氮吹富集后用6%氫氧化鉀-甲醇溶液水解。水解12 h后使用正己烷萃取4次，合并萃取液獲得中性組分。在剩余的混合液中加入6 mol/L鹽酸調節(jié)pH，繼續(xù)用正己烷萃取，得到的萃取液經(jīng)無水硫酸鈉脫水后加入三氟化硼-甲醇溶液甲基化處理。甲基化后的脂肪酸甲酯(FAMEs)經(jīng)過正己烷的萃取后加入內標2-羥基-4-甲氧基二苯丙酮，使用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀(HPLC-MS，Agilent1200/Waters-Quattro Ultima Pt mass，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C8反相鍵合色譜柱)進行測定。

1.4 TMBR、BIT和NL5的計算

相對陸源指標TMBR[28]和BIT[29]的計算公式分別如下：

式中：∑(C27+ C29+ C31n-alkanes)為陸地高等植物生物標志物長直鏈烷烴含量；∑(B + D)為海洋浮游植物生物標志物；B代表菜子甾醇含量；D代表甲藻甾醇含量。

式中：Ia + IIa + IIIa代表不同的支鏈甘油二烷基甘油四醚：br-GDGT-I、 br-GDGT-II、br-GDGT-III含量之和，IV代表海洋中泉古菌醇含量。

梯烷脂的NL5指標與厭氧氨氧化菌所生活的溫度相關[30]，公式如下：

式中：ladderane I代表甲酯化處理后的梯烷脂C18-[5]-ladderane FAME(I)含量；ladderane III代表甲酯化處理后的梯烷脂C20-[5]-ladderane FAME(III) 含量。

2 結果

2.1 膠州灣水體及沉積物的環(huán)境參數(shù)

膠州灣夏季底層水體溫度差異較小，為26.0～27.5 ℃，平均26.7 ℃，膠州灣東北角及西部海域水溫較高(見圖3(a))，是由于這些區(qū)域水深較淺，底層水易受太陽輻射影響。底層水鹽度為26.9～31.6，平均為30.8，膠州灣東北角及洋河河口附近鹽度較低，其余站位鹽度均為31.0附近(見圖3(b))。膠州灣底層水三種無機氮鹽(亞硝氮、硝氮、氨氮)空間分布上較為類似，主要的高值區(qū)出現(xiàn)在灣東北部及西部河口區(qū)域(見圖3(c)，3(d)，3(e))。底層水體溶解氧含量為5.2～8.3 mg/L，平均6.3 mg/L，低值區(qū)同樣集中于膠州灣東北角及西部近岸河口區(qū)域(見圖3(f))。

((a)膠州灣底層水體溫度(℃)； (b)膠州灣底層水體鹽度； (c)膠州灣底層水體含量(μmol/L)； (d)膠州灣底層水體含量(μmol/L)； (e)膠州灣底層水體含量(μmol/L)；(f)膠州灣底層水體溶解氧含量(mg/L)。 (a)Bottom sea water temperature (℃) of Jiaozhou Bay; (b)Bottom sea water salinity (psu) of Jiaozhou Bay; (c)Bottom content (μmol/L) of Jiaozhou Bay; (f)Bottom DO content (mg/L) of Jiaozhou Bay.)圖3 膠州灣海底水體參數(shù)Fig.3 Bottom sea water parameters in Jiaozhou Bay

2.2 總有機碳參數(shù)及粒度

膠州灣表層沉積物中的TOC含量為0.06%～0.94%，平均0.48%，高值區(qū)集中在膠州灣東部近岸處(見圖4(a))。表層沉積物總有機質δ13C值為-22.4‰～-19.7‰，δ13C值普遍偏高且極差較小，但是空間分布上呈較明顯的西高東低的趨勢，最低值出現(xiàn)在膠州灣東北角及灣南部出口處(見圖4(b))。表層沉積物的碳氮比TOC/TN為3.7～12.3，平均8.4，碳氮比普遍偏低，空間上呈西低東高的趨勢(見圖4(c))。

表層沉積物的平均粒徑為24～187 μm，大部分底泥為粉砂質(Silt)，而粒徑較高的砂質(Sand)區(qū)集中在三個區(qū)域，分別是海灣東北角，西部大沽河/洋河河口，及膠州灣南部灣口處(見圖4(d))。

((a) 沉積物TOC含量(%)；(b) 沉積物TOC的δ13C值(‰)；(c) 沉積物碳氮比(mol/mol)；(d) 沉積物平均粒徑(μm)。 (a) TOC of sediments (%); (b) TOC-δ13C value of sediments (‰); (c) TOC/TN ratio of sediments (mol/mol); (d) mean grain size of sediments (μm).)圖4 膠州灣沉積物總有機質參數(shù)及平均粒徑Fig.4 Bulk organic matter and mean grain sizes of sediment samples

2.3 生物標志物和比值指標

膠州灣表層沉積物生物標志物的空間分布上，指示陸源有機質貢獻的指標TMBR和BIT都在膠州灣東北部及西部比值較高(見圖5(a)，5(b))，TMBR比值指標為0.23～0.69，平均為0.46，BIT比值指標為0.10～0.29，平均0.17。

((a) 沉積物有機質TBMR指標，數(shù)值由長鏈烷烴及甾醇含量比值得出，代表陸源有機質的貢獻比例；(b) 沉積物有機質BIT指標，數(shù)值由不同GDGT及泉古菌醇含量比值得出，代表陸源有機質的貢獻比例。 (a) Distribution of TMBR index, which is calculated by contents of long chain n-alkanes, brassicasterol and dinosterol; (b) Distribution of BIT index, which is calculated by contents of br-GDGTs and crenachaeol.)圖5 膠州灣沉積有機質陸源貢獻指標Fig.5 Distribution of terrestrial OC contribution indices

膠州灣所有站位的表層沉積物中都檢出了梯烷脂，含量為4～574 μg/g OC，平均含量為163 μg/g OC。在膠州灣西部含量較低，高值站位主要分布膠州灣東部120.3°E附近及灣口處(見圖6(a))。本研究聚焦四種梯烷核心脂，C18-[5]-ladderane FAME(I)，C18-[3]-ladderane FAME(II)，C20-[5]-ladderane FAME(III)和C20-[3]-ladderane FAME(IV)。膠州灣表層沉積物中C20-[5]-ladderane FAME(III)和C20-[3]-ladderane FAME(IV)為主要組分，分別占同站位總梯烷脂含量的23%～66%(平均38%)和24%～77%(平均56%)，且不同組分梯烷脂的空間分布和總梯烷脂空間分布狀況基本一致。

(根據(jù)山東省生態(tài)環(huán)境廳發(fā)布的省控重點污染源排放監(jiān)控數(shù)據(jù)庫，紅點代表膠州灣周圍污水主要輸入；藍點代表膠州灣沿岸河流主要輸入；橙點代表河流-污水混合輸入。 (a) ∑ ladderane/TOC含量區(qū)間分布圖(μg/g OC)；(b) ladderane I/TOC含量分布圖(μg/g OC)；(c) ladderane II/TOC 含量分布圖(μg/g OC)；(d) ladderane III/TOC含量分布圖(μg/g OC)；(e) ladderane IV/TOC含量分布圖(μg/g OC)。 Red dots represent main sewage input, according to the emission monitoring database of key pollution sources released by Shandong Provincial Department of Ecology and Environment. Blue dots represent main river water input of Jiaozhou Bay. Orange dots represent mixing inputs of sewage and river water. Red dots represent main sewage input around Jiaozhou Bay. (a) Distribution of summed TOC-normalized ladderane contents (μg/g OC); (b) Distribution of TOC-normalized ladderane I contents (μg/g OC); (c) Distribution of ladderane II contents (μg/g OC); (d) Distribution of TOC-normalized ladderane III contents (μg/g OC); (e) Distribution of TOC-normalized ladderane IV contents (μg/g OC).)圖6 膠州灣沉積物梯烷脂含量分布圖Fig.6 The spatial distribution of different ladderane FAMEs contentsin sediments

3 討論

3.1 膠州灣有機質來源與貢獻

利用梯烷脂研究海灣厭氧氨氧化活動的關鍵是厘清梯烷脂是由海洋產(chǎn)生還是來自于陸源輸入，因此首先對膠州灣沉積物中有機質的來源進行判斷與討論，并后續(xù)建立有機碳與梯烷脂的相關關系，進一步對梯烷脂的來源及響應進行分析。

總有機質參數(shù)碳氮比值TOC/TN及穩(wěn)定碳同位素δ13C能從總有機碳角度對有機質的來源進行分析。膠州灣沉積物有機質TOC/TN值與δ13C值存在良好的相關關系(r2= 0.82)(見圖7(b))，表明在膠州灣沉積有機質中有機質來源的影響因素相似，可以通過兩者來有效判斷有機質來源。碳氮比高值區(qū)(TOC/TN>9，mol/mol)和δ13C低值區(qū)(δ13C <-21‰)明顯集中于海灣東部沿岸區(qū)域，表明與西北部區(qū)域相比，東部沿岸區(qū)域沉積物中陸源有機質的貢獻更多。一般海源浮游植物碳氮比約為5～7(mol/mol)，接近Redfield比值6.6(mol/mol)，而陸地高等植被的碳氮比高達15～1 000(mol/mol)[31]。海源浮游植物δ13C值一般在-23‰～-12‰[32]，陸地高等植物的δ13C值則更低，為-33‰～-23‰[32]。膠州灣沉積物中碳氮比值平均為8.4(mol/mol)， δ13C值平均為-21.4‰?？偟膩碚f，膠州灣沉積物有機質TOC/TN值較低、δ13C值較高，表明在膠州灣沉積有機質中海源初級生產(chǎn)力可能占主導，原因可能為近年來膠州灣附近各河流中下游設置較多的攔水壩，使得陸源物質如高等植物碎屑較難直接輸入到海灣中。TOC-TN的擬合直線顯示兩者相關性良好，斜率為8.38(高于Redfield比值)，且回歸線落在TN軸的正截距上(見圖7(a))，表現(xiàn)出沉積物對無機氮的吸附作用[33]，可能與膠州灣陸源輸入較多的無機氮鹽相關。膠州灣西北大沽河口區(qū)域δ13C值較高(見圖4(b))，可能受沿海河口區(qū)域C4植物(δ13C值-16‰～-9‰)的影響[34]，另外，土壤來源有機質及農肥也可能是導致海灣地區(qū)δ13C值偏高的原因[35-36]。綜合而言，總有機質參數(shù)表明膠州灣沉積有機質以海源為主導。

((a) 沉積物TOC和TN線性關系圖；(b) 沉積物總有機質的δ13C和TOC/TN線性關系圖。 (a) Plot of sediment TOC and TN; (b) Plot of sediment TOC-δ13C and TOC/TN.)圖7 膠州灣沉積物總有機質參數(shù)線性關系圖Fig.7 Plot of sediment OC parameters

考慮到膠州灣總有機質參數(shù)難以精確指示不同來源有機質貢獻程度，因此使用生物標志物指標對不同來源有機質貢獻進行進一步解析。為了避免沉積物本身性質(如粒度等)對有機質保存的影響，可使用相對陸源指標TMBR和BIT衡量灣底沉積物中海/陸源有機質的貢獻比例。整體來說，TMBR(平均值0.46)和BIT值(平均值0.17)都表明膠州灣沉積物中海源有機質占主要地位，其貢獻約為54%(TMBR得出)和83%(BIT得出)。TMBR指標和BIT指標所指示陸源相對貢獻的空間分布類似，陸源貢獻較高的區(qū)域位于海灣東北部和西部，主要受河流輸入的影響。灣東北部區(qū)域陸源貢獻指標尤其高，雖然此處附近的河流流量較小，僅占膠州灣整體河流入海通量的不到20%[23]，但陸源貢獻指標明顯高于西部河口區(qū)域(見圖5(a)，5(b))。原因可能是海灣東北部區(qū)域較小且較狹窄，不同于西部河口直接面向開闊海域，海灣東北部多條河流輸入的陸源有機質能較多的聚集于此區(qū)域。在本文研究區(qū)域，BIT值普遍低于TMBR值，這可能是由于TMBR所使用的生標(長鏈烷烴)與BIT使用的生標(br-GDGTs)在傳輸機制及存在方式上有所不同。BIT指標使用的br-GDGTs主要由土壤細菌產(chǎn)生， 只能指示河流輸入土壤對海灣沉積有機質的貢獻；同時br-GDGTs在河口區(qū)域的降解也可能是BIT值偏低的原因[37]；而TMBR指標使用的長鏈烷烴存在于高等植物碎屑中，除了隨河流輸入海灣，還可以通過大氣沉降輸送入海[38]。

3.2 膠州灣梯烷脂的成分與來源

膠州灣表層沉積物中普遍檢出梯烷脂。由于膠州灣沉積物平均粒徑的空間分布存在較大差異，為了部分排除粒徑對有機質保存產(chǎn)生的影響，因此在討論梯烷脂的空間分布時使用總有機碳均一化后的梯烷脂含量(ladderane/TOC)來分析。前人研究指出沉積物中的梯烷脂主要來自于活體的厭氧氨氧化細菌，也可能來自于已經(jīng)凋亡或失活的厭氧氨氧化細菌[39]。與其他研究方式不同，沉積物中的梯烷脂不僅能代表正在進行的厭氧氨氧化活動，還能記錄曾經(jīng)進行的厭氧氨氧化活動。通過追溯沉積物中梯烷脂的來源并分析其成分，可以推斷梯烷脂是由外部(包括河流和污水口)輸入海灣還是由海洋原位的厭氧氨氧化活動產(chǎn)生。因此，運用梯烷脂能更好地對膠州灣脫氮的潛力及貢獻進行評估。

膠州灣沉積梯烷脂空間分布不均勻，海灣西部梯烷脂含量普遍偏低，高值區(qū)主要位于膠州灣東北角，北岸的紅島附近，以及團島和前灣港附近的站位(見圖6(a))。對膠州灣沉積梯烷脂與陸源有機質貢獻指標進行相關性比對，結果表明梯烷脂與陸源貢獻指標均無顯著線性關系(見圖8)。這說明沉積物中的梯烷脂不單受陸源或海源主導，需要考慮不同方式的混合對梯烷脂分布的影響。

((a)沉積物BIT指標與總梯烷脂含量線性關系；(b) 沉積物TMBR指標與總梯烷脂含量線性關系。 (a) Plot of BIT index and TOC-normalized ladderane contents; (b) Plot of TMBR index and TOC-normalized ladderane contents.)圖8 膠州灣沉積物有機質陸源貢獻指標與總梯烷脂含量線性關系圖Fig.8 Plot of terrestrial OC contribution indices versus summed TOC-normalized ladderane contents

研究表明，在不同溫度下，厭氧氨氧化菌會通過改變合成的梯烷脂鏈長來保持細胞膜的流動性[30]，一般來說厭氧氨氧化菌所處環(huán)境溫度越高，膜脂上所合成的鏈長較長的ladderane III含量占比會增加，鏈長較短的ladderane I則減少，而基于ladderane III和ladderane I比值的溫度指標NL5值越大。根據(jù)NL5-T經(jīng)驗公式的函數(shù)性質，NL5值反演梯烷脂合成溫度的最適區(qū)間為12～20 ℃[19]，反演溫度的NL5最大值為0.9，對應的溫度約為25 ℃。膠州灣所有站位表層沉積物中梯烷脂NL5值均大于0.9，無法進行具體溫度反演計算，可能是較高的合成溫度使得厭氧氨氧化菌膜脂上所合成的ladderane III含量遠高于ladderane I。根據(jù)膠州灣沉積物NL5的數(shù)值，定性上可以判斷梯烷脂合成的環(huán)境溫度高于25 ℃，與膠州灣夏季平均水溫26.7 ℃較為相符。同樣，祝孟玲等[54]和Zhao等[17]分別對珠江口和東海陸架沉積物中的梯烷脂來源進行了分析，并通過NL5值反演溫度推斷沉積物中梯烷脂可能主要來自于上層水體顆粒物沉降。另外，雖然海洋沉積物中存在厭氧氨氧化活動[27,39,49]，但膠州灣沉積物夏季溫度約為21 ℃[51]，明顯低于夏季水體溫度，與梯烷脂較高的NL5值不符，且夏季表層沉積物間隙水并未明顯缺氧(平均4.5 mg/L)[27]，因此膠州灣沉積物中的梯烷脂可能主要來自于夏季水體顆粒物的沉降。但由于NL5-T經(jīng)驗公式的溫度最佳適用范圍有限(12～20 ℃)，并不能據(jù)此完全排除膠州灣沉積物原位產(chǎn)生梯烷脂的可能性。

厭氧氨氧化菌在海洋水體中主要附著于顆粒物上進行厭氧氨氧化活動[21]。厭氧氨氧化菌主要有五種不同屬，分別為Candidatusbrocadia、Candidatusscalindua、Candidatuskuenenia、Candidatusjettenia、Candidatusanammoxoglobus，不同屬厭氧氨氧化菌種有不同的生理性質及形態(tài)特征，會產(chǎn)生不同種類的梯烷脂，因此可以分析各成分梯烷脂的含量及比例來探究膠州灣沉積物中梯烷脂的不同來源。近海及河流環(huán)境中主要發(fā)現(xiàn)的菌群為Candidatusscalindua，Candidatusbrocadia和Candidatuskuenenia[26-27,40]。其中Scalindua為高鹽種，最常見于大洋環(huán)境；而Brocadia及Kuenenia為低鹽種，主要存在于污水處理反應器及河流/河口區(qū)域[41]。培養(yǎng)試驗的結果顯示，菌種Scalindua的梯烷膜脂中l(wèi)adderane IV為單獨主導，ladderane III/ladderane IV約為0.6；菌種Brocadia和Kuenenia中l(wèi)adderane III和IV共同主導，ladderane III/ladderane IV均為1.0左右[42]。膠州灣中各站位梯烷脂含量差異較大且空間分布不均勻，因此將梯烷脂高值站位(>200 μg/g OC)與低值站位的ladderane III/ladderane IV進行雙樣本t檢驗，以分辨不同站位中梯烷脂的來源。在排除異常值后，高值站位與低值站位ladderane III/ladderane IV存在顯著性差異(p=0.001)。具體來說，梯烷脂高值站位中的ladderane III/ladderane IV較高(見圖9(a))，平均達到了0.9(見圖9(c))，比例更接近淡水菌種Brocadia 和 Kuenenia；而低值站位中l(wèi)adderane III/ladderane IV平均值為0.7，排除異常值后平均值為0.6(見圖9(c))，比例更接近高鹽種厭氧氨氧化菌Scalindua。需要注意的是，梯烷脂高值站位也能檢出Scalindua的特有膜脂ladderane II[42]，因此這些站位可能同樣存在Scalindua菌種。以上結果表明，在梯烷脂低值站位，高鹽種厭氧氨氧化菌Scalindua可能是梯烷脂的主要貢獻者，即梯烷脂主要由海水原位產(chǎn)生；而在梯烷脂高值站位，除了Scalindua的貢獻之外，還可能有較多來自于淡水排放菌種Brocadia和Kuenenia的貢獻，即梯烷脂主要來自于河流/污水輸送的顆粒物。空間分布上，高值站位也集中位于膠州灣沿岸的污水處理廠附近(見圖6(a))。而灣西部的河流(大沽河、洋河)雖然能貢獻膠州灣80%以上的河流入海流量及70%以上的泥沙入海通量[23]，但相比于人口密集的東岸，西部河流流域受人類排放的影響較少[48]，且沉積物平均粒徑較高不利于生物標志物的保存，因此梯烷脂在灣西部無明顯的高值站位。未來在典型區(qū)域的端元(如污水端，河流淡水端及現(xiàn)場生產(chǎn)懸浮顆粒物)以及不同季節(jié)對梯烷脂進行進一步的結構及分布研究能更好的校驗梯烷脂對海灣區(qū)域厭氧氨氧化活動的指示意義。

((a) 梯烷脂低值站位中(<200 μg/g OC)的不同組分含量占比； (b) 梯烷脂高值站位中(> 200 μg/g OC)的不同組分含量占比； (c) 梯烷脂低值及高值站位ladderane III與ladderane IV比值。(a) Compositions of ladderane FAMEs in sites with lower ladderane contents(< 200 μg/g OC); (b) Compositions of ladderane FAMEs in sites with higher ladderane contents(> 200 μg/g OC) ; (c). ladderane III/ladderane IV ratio in sites with lower ladderane contents and sites with higher ladderane contents.)圖9 不同站位梯烷脂不同組分含量占比箱式圖Fig.9 Box plot of ladderane FAMEs in different sites

3.3 膠州灣沉積物梯烷脂的環(huán)境指示意義

目前，厭氧氨氧化活動已經(jīng)在不同環(huán)境中被廣泛發(fā)現(xiàn)，包括大洋、近海、淡水、河口和污水等。根據(jù)青島市海洋環(huán)境公報，青島市夏季(8月)海水水質狀況為一年中最佳，主要表現(xiàn)在無機氮鹽平均濃度較低，富營養(yǎng)化海域面積較小且主要集中在東部沿岸，與本次采樣數(shù)據(jù)相吻合。若使用分子信息學方法研究沉積物的厭氧氨氧化活動，由于采樣時間和季節(jié)的不同，沉積物中存在凋亡或非活性態(tài)的厭氧氨氧化菌，可能因此引入誤差，錯估了研究海域中厭氧氨氧化對氮脫除的貢獻。膠州灣沉積物沉積速率為0.28～0.64 cm/a[45]，因此本研究采集的表層沉積物(0～2 cm)反映的是近幾年的沉積狀況。梯烷脂作為百年尺度上穩(wěn)定的生物標志物，在確定其來源后，能夠反映研究海域的厭氧氨氧化活動狀況(包括已經(jīng)進行的和正在進行的；河流/人為排放的和海水中原位合成的)，從而更好地對氮循環(huán)及脫氮過程進行評價，并綜合指示海洋中的厭氧氨氧化狀況。

表1 膠州灣海底環(huán)境各參數(shù)皮爾森相關關系abTable 1 Pearson correlations of different parameters in Jiaozhou Bay bottom environment

((a)主成分分析載荷圖；(b)主成分分析得分圖，其中紅色圓點代表梯烷脂高值站位，黑色方點代表梯烷脂低值站位。 (a) Loadings plot from principle component analysis; (b) Scores plot from principle component analysis, red dots represent higher ladderane contents sites and black squares represent lower ladderane contents sites.)圖10 膠州灣沉積物梯烷脂及其他參數(shù)的主成分載荷圖及得分圖Fig.10 Loadings plot and scores plot from principle component analysis (PCA) containing ladderanes and other parameters

4 結論

(1)膠州灣表層沉積物有機質中海源貢獻普遍大于陸源貢獻，部分區(qū)域的高陸源有機質貢獻可能受河流輸入的影響。

(2)沉積物中梯烷脂含量的空間分布及其各組分的比例表明，膠州灣區(qū)域存在廣泛的厭氧氨氧化活動，且主要夏季水體顆粒物的沉降而非在沉積物中產(chǎn)生。大部分站位沉積梯烷脂主要來自于海水水體中高鹽種Candidatusscalindua，在梯烷脂高值站位也有菌種Candidatusbrocadia和Candidatuskuenenia的貢獻，主要來源于河流/污水輸入的顆粒物。

致謝：本文相關樣品的采集由馬海力、朋鵬和丁楊提供協(xié)助，樣品總有機質參數(shù)的測定由張海龍和金貴娥給予幫助，作者對以上人員表示誠摯謝意。