季宇航, 張春渝, 李 丹, 賴鐘雄

(福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002)

凱氏帶(Casparian strip)是被子植物中位于內皮層細胞四周并呈帶狀環(huán)繞在內皮層徑向壁和橫向壁上的結構，控制皮層和維管柱之間的物質運輸[1]。植物根系吸收的水分和礦質元素一般通過兩種途徑進入細胞：一種是通過細胞壁和細胞間隙的質外體途徑；另一種是通過質膜和原生質的共質體途徑。由于凱氏帶的存在和內皮層細胞的物理結構，水和礦質元素不能從質外體進入細胞，所有的水分和無機鹽只有經(jīng)過內皮層的原生質體才能進入維管柱[2]。凱氏帶蛋白(Casparian strip membrane domain proteins, CASP)是特異性出現(xiàn)在凱氏帶形成區(qū)域的膜蛋白[3]，對凱氏帶的形成起著至關重要的作用。目前，凱氏帶基因在一些物種中已有研究。Roppolo et al[3]發(fā)現(xiàn)擬南芥的5個凱氏帶蛋白存在功能冗余的現(xiàn)象，例如CASP1-1異常卻不影響凱氏帶的阻滯功能，推測凱氏帶的形成是多基因形成的復合體共同作用完成的[4]。Wang et al[5]在水稻根內胚層細胞中發(fā)現(xiàn)，OsCASP1基因能在水稻根內與其同源基因發(fā)生互作合成復合物從而影響凱氏帶的形成。OsCASP1～OsCASP5基因中僅有OsCASP1參與凱氏帶的形成過程，對水稻根中礦質元素，尤其是鈣和硅的吸收起作用[6]。除此之外，凱氏帶蛋白還參與了植物耐寒、鹽脅迫等生命過程[7-8]。丁長慶[9]研究表明，西瓜CICASPL及其同源基因AtCASPL4CI在低溫脅迫下都能夠被誘導表達，二者能夠負調控植株的低溫抗性。

香蕉(Musaspp.)是熱帶、亞熱帶廣泛種植的水果，對溫度的變化極其敏感，耐低溫能力差。低溫逆境對香蕉的產(chǎn)量與品質產(chǎn)生巨大的影響。目前，尚未見有關香蕉CASP基因的系統(tǒng)分析及其在低溫下表達情況的報道。本研究以香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中A、B基因組的CASP家族基因數(shù)據(jù)為種子序列，通過生物信息學分析手段對香蕉全基因組CASP家族基因進行鑒定，并結合香蕉低溫轉錄組數(shù)據(jù)對CASP在低溫下的表達情況進行分析，旨在為香蕉CASP基因家族功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗所用的香蕉基因組序列來源于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http：//banana-genome-hub.southgreen.fr/)，所用擬南芥、水稻的參考序列分別從TAIR(http：//www.arabidopsis.org/)和Phytozome(http：//www.phytozome.net/)網(wǎng)站下載。

1.2 香蕉CASP家族成員基本信息及理化性質的獲得

基于香蕉基因組數(shù)據(jù)庫下載了CASP家族基因CDS序列、氨基酸序列、基因結構注釋信息文件以及全基因組序列，通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上的Blast軟件(E=1e-5)在線篩選香蕉A、B基因組中的CASP基因家族成員。通過Pfam、CDD進行成員保守結構域的檢測，將得到的結果在Tbtools軟件[10]中進行可視化后進一步篩選。

將香蕉A、B基因組的CASP基因的氨基酸序列分別輸入到Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)軟件進行在線分析，從而得到該基因家族的理化性質預測結果。

1.3 香蕉CASP基因結構與蛋白質結構分析

將香蕉基因數(shù)據(jù)庫上下載的氨基酸序列文件導入NCBI網(wǎng)站上進行CDD搜索，用Tbtools軟件將得到的結果進行可視化。根據(jù)香蕉基因組數(shù)據(jù)庫下載的基因注釋文件，采用Tbtools軟件分別對香蕉A、B基因組的CASP家族基因進行結構分析。

1.4 構建香蕉基因組CASP家族成員的系統(tǒng)進化樹

用MEGA 7.0的Clustal W對香蕉A、B基因組的CASP基因進行多重序列比對，而后調整默認參數(shù)將自展法系數(shù)(bootstrap)調整為1 000，并采用鄰接法(neighbor-joining, NJ)構建擬南芥、水稻與香蕉A、B基因組CASP成員的系統(tǒng)進化樹。

1.5 香蕉CASP家族的啟動子順式作用元件預測分析

將香蕉基因組數(shù)據(jù)庫中的CASP家族基因序列導入Tbtools軟件，提取各成員轉錄起始位點上游2 000 bp的序列作為啟動子序列，采用Plantcare軟件進行CASP家族成員的順式作用元件預測分析。

2 結果與分析

2.1 香蕉CASP家族成員基本信息及理化性質分析

2.1.1 A基因組 香蕉CASP家族經(jīng)Blast多重篩選后得到61個成員。其中，A基因組有44個，根據(jù)命名法編號為MaCASP01～MaCASP44。44位成員的CDS長度介于459～858 bp之間，相對分子質量介于38.9～72.6 kU之間，等電點介于5.05～5.22之間。

2.1.2 B基因組 香蕉B基因組中共有17個CASP成員，根據(jù)命名法編號為MbCASP01～MbCASP17。17個成員的CDS長度介于240～996 bp之間，相對分子質量介于19.8～266.6 kU之間，等電點位于5.04～5.34之間。

2.2 香蕉CASP家族基因結構與保守結構域分析

2.2.1 A基因組 香蕉CASP家族成員在基因結構上多表現(xiàn)為內含子和外顯子的結構。其中，A基因組中CASP家族成員的基因大小在1～12 kb之間，內含子1～3個，外顯子2～4個(圖1A)。MaCASP06、MaCASP07、MaCASP08、MaCASP26和MaCASP41的內含子均為1個，MaCASP12、MaCASP18以及MaCASP22的內含子有3個，其余基因的內含子均為2個。除了MaCASP19，其余成員單個外顯子在基因組上的跨度都較小。此外，MaCASP16不存在保守結構域，其余成員都至少存在1個保守結構域，主要為DUF588和MARVEL保守結構域(圖1B)。

A.基因結構；B.保守結構域。圖1 香蕉A基因組CASP家族成員的基因結構與保守結構域Figure 1 Gene structure and conserved domain of CASP family members in banana A genome

2.2.2 B基因組 由圖2A可知，B基因組中CASP家族成員的基因大小在0.5～4.5 kb之間，內含子0～7個，外顯子1～8個。MbCASP01、MbCASP02、MbCASP05、MbCASP09、MbCASP10、MbCASP11和MbCASP16的單個內含子長度較大，且MbCASP11的內含子數(shù)目最多。香蕉B基因組的CASP家族成員蛋白分布中除MbCASP03、MbCASP09以外，其余蛋白主要含有DUF588和MARVEL保守結構域(圖2B)。此外，B基因組中MbCASP04、MbCASP05、MbCASP07與MbCASP17的保守結構域長度較短，可能由于蛋白的保守結構域有缺失。

A.基因結構；B.保守結構域。圖2 香蕉B基因組CASP家族成員的基因結構與保守結構域Figure 2 Gene structure and conserved domain of CASP family members in banana B genome

2.3 構建香蕉CASP家族系統(tǒng)進化樹

利用MEGA 7.0對香蕉A、B基因組以及水稻、擬南芥等3個物種共計113條CASP基因進行系統(tǒng)進化樹的構建(圖3)。參考擬南芥和水稻的聚類分析，根據(jù)基因的結構特征及同源性分析可將系統(tǒng)進化樹中的香蕉A、B基因組的CASP家族成員大致分為5組。由圖3可以看出，香蕉A、B基因組和水稻、擬南芥的CASP基因在各組中均有分布，分布在同一個組中的基因具有較近的親緣性。

圖3 香蕉A(Ma)、B(Mb)基因組以及水稻(Os)、擬南芥(At)CASP家族成員的系統(tǒng)進化樹Figure 3 Phylogenetic trees of CASP genes in banana A genome (Ma), banana B (Mb) genome , rice (Os) and Arabidopsis (At)

2.4 香蕉CASP基因家族成員啟動子順式作用元件分析

2.4.1 A基因組 對啟動子順式作用元件進行分析是了解基因家族的重要方式[11]。本研究利用PlantCare在線軟件預測香蕉CASP家族的啟動子順式作用元件。從圖4可見，A基因組中CASP家族成員存在16種順式作用元件，其中光響應元件最多。此外，還有眾多功能各異的特異型元件，比如影響玉米醇溶蛋白代謝調節(jié)、種子特異性調節(jié)、水楊酸響應、低溫響應、茉莉酸甲酯響應、參與晝夜節(jié)律控制、赤霉素響應、胚乳表達、干旱誘導性、細胞周期調控、生長素響應、缺氧特異性誘導、脫落酸響應以及MYB轉錄因子的結合位點等順式作用元件。各成員包含的元件在種類和數(shù)目上不盡相同，這種差異意味著各成員參與信號通路的能力及生物學功能可能不同[12]。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MaCASP01、MaCASP02、MaCASP08、MaCASP11、MaCASP18、MaCASP19、MaCASP22、MaCASP24、MaCASP25和MaCASP36等多個基因上含有影響低溫調控的順式作用元件，表明香蕉A基因中CASP家族成員可能參與抗寒的逆境機制調節(jié)過程。此外，約40%的基因中含有影響干旱調控的順式作用元件，說明A基因組中CASP家族基因可能在抗旱逆境調節(jié)中起作用。

圖4 香蕉A基因組CASP家族的順式作用元件Figure 4 Cis-acting elements of CASP family in banana A genome

2.4.2 B基因組 經(jīng)篩選，B基因組中CASP家族成員存在11個主要順式作用元件(圖5)。與A基因組不同的是，B基因組中存在影響類黃酮生物合成基因調控和分生組織表達的元件。MbCASP01中含有3個生長素反應元件，暗示著該基因可能在生長素反應中發(fā)揮作用。MbCASP12、MbCASP13、MbCASP14、MbCASP16和MbCASP17中只包含光響應元件，說明這5個基因可能主要參與光響應。MbCASP1、MbCASP3、MbCASP4、MbCASP6、MbCASP7、MbCASP9和MbCASP11都含有3種以上的順式作用元件，表明這些基因可能在植物的生理調控上起重要的作用。MbCASP04和MbCASP15等基因含有低溫響應元件，表明這些基因可能參與香蕉的低溫逆境響應過程。約30%存在參與干旱調節(jié)的響應元件，暗示著這些基因可能與抗旱機制調節(jié)相關。

圖5 香蕉B基因組CASP家族的順式作用元件Figure 5 Cis-acting elements of CASP family in banana B genome

2.5 香蕉CASP家族在低溫下的表達分析

通過轉錄組數(shù)據(jù)對香蕉CASP的低溫表達情況分析表明，在13 ℃下，4個成員(MaCASP20、MaCASP26、MaCASP27、MaCASP44)的表達量較28 ℃顯著升高；6個成員(MaCASP21、MaCASP19、MaCASP32、MaCASP43、MaCASP11、MaCASP16)在4 ℃時呈特異表達；MaCASP10在0 ℃時呈現(xiàn)特異表達(圖6)。以上表明，這些成員在低溫下可能發(fā)揮作用。

圖6 香蕉CASP家族成員在不同低溫處理下的表達分析Figure 6 Expression analysis of CASP gene family members under different low temperature treatments in banana

3 討論

3.1 香蕉CASP家族可能具有功能多樣性

MYB轉錄因子通過調控木質部的形成影響凱氏帶的結構從而在植物的形態(tài)建成、生長發(fā)育中起著重要的調控作用[13]。凱氏帶能夠阻斷植物中物質的被動運輸[14]，其功能與結構息息相關。香蕉A、B基因組的CASP家族基因都含有大量的MYB結合位點，猜測其可能間接影響凱氏帶的結構。根據(jù)前人研究，CASP家族作為廣泛存在于被子植物物質運輸途徑的家族，對凱氏帶的形成發(fā)揮了重要作用[4-7]。此外，香蕉CASP基因家族中還含有其他眾多類型的順式作用元件，其中光響應元件數(shù)量最多，可以判斷CASP家族基因對晝夜節(jié)律調控有較大的影響?；蛑羞€包括許多激素、生長素反應的元件，說明香蕉CASP基因家族可能參與了植物的多項生命過程。

3.2 CASP家族在香蕉A、B基因組及不同物種中具有序列差異性

從基礎理化性質來看，相較于A基因組，B基因組中的CASP家族編碼氨基酸的數(shù)目跨度更大，相對分子質量差異也比較顯著。此外，MaCASPs的結構完整，內含子、外顯子跨度小且具有較強的連續(xù)性。MbCASPs則在結構上有所缺失，不同基因的內含子與外顯子數(shù)目差異較大。從順式作用元件分析可以看出，兩者都具有較多類型的響應元件，但不同于A基因組的是，B基因組中CASP基因可能與類黃酮等生物合成有關。

CASP家族在不同的物種中也存在差異。相較于水稻、擬南芥的CASP家族成員數(shù)量，香蕉CASP成員數(shù)量較多，A基因組有44個、B基因組有17個。猜測香蕉CASP家族基因的成員數(shù)比其他植物多的原因可能與其經(jīng)歷了3次全基因組復制有關[15]。CASP蛋白在不同的物種中也存在保守結構域上的差異。在擬南芥、香蕉中存在CASPL(MARVEL)結構域，而目前在水稻中并未發(fā)現(xiàn)相似的保守結構域。說明CASP基因家族成員在不同物種中存在一定的差異。

3.3 香蕉CASP家族可能參與逆境脅迫過程

從A、B基因組的元件類型可以看出，CASP家族基因對逆境調控元件有較強烈的應答，推測可能參與多種抗逆境反應。Yang et al[7]研究發(fā)現(xiàn)，西瓜中存在編碼冷誘導膜蛋白的ClCASPL基因，該基因與擬南芥的類CASP基因(AtCASPL4C1)存在較高的同源性，且都對植物的耐寒性起到一定的作用。劉煒婳[16]研究表明，香蕉中存在4種抗寒重疊基因，對抗逆境脅迫產(chǎn)生顯著影響。香蕉A、B基因組的CASP家族中同樣存在低溫響應順式作用元件，說明可能參與了低溫脅迫的響應。分析低溫轉錄組數(shù)據(jù)表明，MaCASP的一些成員可能在低溫誘導下特異表達。說明它們可能在香蕉的低溫響應中起作用，具體功能還需進一步驗證。