梁高照，王茜茜，汪 清

（1深圳市寶安人民醫(yī)院（集團(tuán)）泌尿疾病中心 廣東 深圳 518000）

（2深圳市寶安人民醫(yī)院（集團(tuán)）風(fēng)濕免疫科 廣東 深圳 518000）

精索靜脈曲張（VC）是指男性精索中的蔓狀靜脈叢發(fā)生異常擴(kuò)張、迂曲和延伸，是影響男性生育的主要因素之一。有資料表明[1]，有將近30%的不育癥男性患者同時患有VC。VC出現(xiàn)與吸煙、平時生活習(xí)慣密切相關(guān)，同時過于勞累、長時間進(jìn)行劇烈運(yùn)動也可促使疾病發(fā)生。由于日常生活中，男性經(jīng)常處于過度勞累狀態(tài)，導(dǎo)致其自身植物神經(jīng)紊亂，精索靜脈發(fā)生病變，從而出現(xiàn)VC。當(dāng)前，臨床在VC治療時多采取手術(shù)，據(jù)有關(guān)研究顯示[2]，經(jīng)手術(shù)能提升VC患者的精子DNA質(zhì)量。線粒體DNA氧化受損和多類疾病出現(xiàn)相關(guān)，當(dāng)前有關(guān)手術(shù)對VC患者基于部分線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ、Ⅱ（MT-COI、MTCOII）基因表達(dá)水平的影響較少。為此，本文就VC患者術(shù)前術(shù)后的MT-COI、MT-COII基因表達(dá)水平改變和對精子的影響開展分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年1月—2021年4月本院本院收治VC患者共64例，年齡25～68歲，平均年齡（56.25±5.30）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者平靜時呼吸其精索靜脈最大內(nèi)徑（DR）≥1.8 mm，行Valsalva實(shí)驗(yàn)時，其精索靜脈最大內(nèi)徑（DV）≥2.0 mm；Valsalva實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示為陽性，實(shí)驗(yàn)時頻譜和彩色多普勒測及反流信號，且TR≥1 s，需滿足以上所有標(biāo)準(zhǔn)才能被確診為VC；②符合手術(shù)指征，均于本院開展手術(shù)治療；③均取得患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎心等重要臟器存在嚴(yán)重疾病者；②免疫、血液系統(tǒng)存在疾病者；③存在認(rèn)知障礙或者精神疾病者；④生殖系統(tǒng)存在其他疾病者；⑤近期接觸過毒物、射線或者高溫者；⑥中途退出或者拒絕參與研究者。

1.2 方法及觀察指標(biāo)

所有患者均由相同一組醫(yī)師開展手術(shù)操作，同時術(shù)前術(shù)后對MT-COI、MT-COII基因表達(dá)水平、精子計(jì)數(shù)、精子活力、精液體積以及精子DNA片段化指數(shù)（DFI）開展檢測，方法如下：（1）MT-COI、MT-COII基因檢測：通過RNeasy Mini Kit按照試劑盒中說明書開展操作提取總DNA，后采取DNase 1 Digesting Set將總DNA內(nèi)痕量DNA去除，選擇1 μg的RNA樣品作為模板，經(jīng)PCR法對MT-COI、MT-COII基因全片段（901bp）開展擴(kuò)增處理，擴(kuò)增引物是MT-COI（+）、MT-COII（+）（5’-CAAGCCAACCCC-ATGGCCTCC-3’）與MT-COI（-）、MT-COII（-）（5’-AGTATTTAGTT-GGGGCATTTCAC-3’），同時PCR的擴(kuò)增條件是：95°C環(huán)境下變性4 min，后依據(jù)95°C環(huán)境下變性1 min、50°C環(huán)境下退火1 min以及72°C環(huán)境下延伸2 min反應(yīng)條件進(jìn)行30次循環(huán)，于72°C環(huán)境下進(jìn)行10 min延伸，結(jié)束首次PCR反應(yīng)。選擇1 μg首次PCR擴(kuò)增引物當(dāng)作模板用于第2次PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物是MT-COI（+）、MT-COII（+）（5’-CAAGCCAACCCC-ATGGCCTCC-3’）與 qhR（5’-TCCTGAGCGTCTGAGATG-3’），同時 PCR 的擴(kuò)增條件是：95°C環(huán)境下變性4 min，后依據(jù)95°C環(huán)境下變性30 s、50°C環(huán)境下退火45 s、72°C環(huán)境下延伸1 min反應(yīng)條件進(jìn)行30次循環(huán)，于72°C環(huán)境下延伸10 min后結(jié)束第2次的PCR反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物于1.3%瓊脂糖內(nèi)的電泳條件是5 volt/cm。對瓊脂糖電泳的凝膠內(nèi)多態(tài)性擴(kuò)增片段開展切取，經(jīng)割膠純化有關(guān)試劑盒開展純化，經(jīng)T4 DNA連接酶對pUC-T載體與巢式PCR純化引物開展連接反應(yīng)，經(jīng)Cacl2轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)進(jìn)重組質(zhì)粒到TG1大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，提取及純化質(zhì)粒DNA均依據(jù)傳統(tǒng)方式開展。經(jīng)M13通用引物開展2次序列測定，具體測序反應(yīng)為上海聯(lián)合基因公司進(jìn)行。（2）精子及精液檢測：收集患者禁欲72 h的精液樣本，后于1 h內(nèi)開展檢測，常規(guī)精液參數(shù)采取人工分析方法，分別由3名專業(yè)操作人員獨(dú)立分析，后取三者平均數(shù)值；經(jīng)美國貝克曼Navios流式細(xì)胞儀對精子計(jì)數(shù)及活力進(jìn)行檢測；經(jīng)末端轉(zhuǎn)移酶引導(dǎo)dUTP末端標(biāo)記方法對精子DFI開展檢測，試劑盒為Roche公司提供，嚴(yán)格依據(jù)說明書執(zhí)行各項(xiàng)操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 術(shù)前術(shù)后MT-COI、MT-COII基因表達(dá)比較

術(shù)后，VC患者的MT-COI、MT-COII基因表達(dá)比術(shù)前有降低（P＜0.05），見表1。

表1 術(shù)前術(shù)后MT-COI、MT-COII基因表達(dá)比較（±s, μmol/mg·pro）

表1 術(shù)前術(shù)后MT-COI、MT-COII基因表達(dá)比較（±s, μmol/mg·pro）

組別 例數(shù) MT-COI MT-COII術(shù)前 64 0.32±0.05 0.40±0.06術(shù)后 64 0.18±0.04 0.21±0.05 t 17.491 19.462 P 0.001 0.001

2.2 術(shù)前術(shù)后精子及精液參數(shù)比較

術(shù)后，VC患者的精子活力及計(jì)數(shù)比術(shù)前有升高，精子DFI比術(shù)前有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），精液體積和術(shù)前相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），精子DFI降低（P＜0.05）。見表2。

表2 VC患者術(shù)前術(shù)后精子及精液參數(shù)對比（±s）

表2 VC患者術(shù)前術(shù)后精子及精液參數(shù)對比（±s）

組別 例數(shù) 精子活力（a=b）/%精子計(jì)數(shù)/（miL?mL-1） 精液體積/mL 精子DFI術(shù)前 64 18.85±3.62 34.52±10.20 2.75±0.56 42.65±6.10術(shù)后 64 38.75±6.40 42.86±11.38 2.84±0.52 20.42±3.46 t 21.651 4.366 0.942 25.359 P 0.001 0.001 0.348 0.001

3.討論

VC屬于引發(fā)男性不育的一類主要疾病，會給男性的生育能力帶來嚴(yán)重影響。但當(dāng)前有關(guān)VC導(dǎo)致生殖細(xì)胞出現(xiàn)功能障礙的具體機(jī)制仍未完全明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多認(rèn)為和氧化應(yīng)激相關(guān)，此外，還可能和激素水平變化、睪丸組織的病理生理變化等相關(guān)，但討論較多的為睪丸生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激學(xué)說[3]。

目前，手術(shù)屬于VC患者一類主要療法。MT-COI、MT-COII可調(diào)節(jié)線粒體的氧化呼吸產(chǎn)能，于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)能量代謝、功能發(fā)揮中起著關(guān)鍵性作用，兩類基因表達(dá)水平越高，代表氧化應(yīng)激損傷越為嚴(yán)重[4]。本次研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后，VC患者的MT-COI、MT-COII基因表達(dá)比術(shù)前顯著下降，說明經(jīng)手術(shù)治療能下調(diào)患者M(jìn)T-COI、MT-COII基因的表達(dá)水平。據(jù)有關(guān)研究表明[5]，于VC患者精液內(nèi)伴隨活性氧，活性氧生成過多以及抗氧化作用下降能引發(fā)氧化應(yīng)激，ROS過度可將精子細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化啟動，產(chǎn)生較多脂質(zhì)過氧化物，使得MT-COI、MTCOII水平上升，對精子的細(xì)胞膜產(chǎn)生損傷，引發(fā)精子功能及形態(tài)變化，并能對精子核酸及蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生影響，最終引發(fā)精子DNA受損。雖常規(guī)精液參數(shù)能提供出一定價值信息，但也有一定局限性，精子質(zhì)量多需結(jié)合活動度以及形態(tài)等評定[6]。有學(xué)者認(rèn)為[7]，男性不育患者的正常形態(tài)精子也有高DNA斷裂存在，由此可見，和常規(guī)精液參數(shù)開展比較，檢測DFI有著不可取代的價值。本次研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后VC患者的精子活力及計(jì)數(shù)比術(shù)前升高，且精子DFI比術(shù)前降低，這和鄧浩等[8]研究中的結(jié)果有著良好一致性，說明經(jīng)手術(shù)能改善VC患者的精子參數(shù)，減輕精子DNA受損，該結(jié)果一定程度上證實(shí)了VC手術(shù)能對男性不育開展治療的學(xué)說。

綜上所述，VC患者經(jīng)手術(shù)治療能降低其MT-COI、MT-COII基因表達(dá)水平，提升其精子活力和計(jì)數(shù)，減輕其精子DNA損傷。但研究中依舊有一定不足，例如樣本總量較少，未對后期懷孕率等開展隨訪，這些還需在日后研究中進(jìn)一步完善。