宋緒磊，沈國全，路 峻，汪逸然，楊貽功，董建輝，姜 欣

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.蓬萊市葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 蓬萊 265600；3.蓬萊市鈺之錦蒸餾酒研究所，山東 蓬萊 265609）

威士忌是一種由大麥等谷物釀制，在橡木桶中陳釀多年后，調(diào)配成43度左右的烈性蒸餾酒[1-2]。威士忌作為英國的國酒，是與中國白酒、白蘭地、伏特加、朗姆酒和金酒齊名的世界最著名的六大優(yōu)質(zhì)蒸餾酒[3]。威士忌在國際酒類貿(mào)易中占重要地位[4]，從進口的貿(mào)易金額來看，1997年～2017年英國是第一大進口市場，其貿(mào)易金額市場占比約為66.5%～93.7%；從出口貿(mào)易金額可以看出，近年來我國威士忌出口貿(mào)易金額呈增長趨勢[5]。

發(fā)展特色的中國威士忌離不開特色的威士忌酵母，優(yōu)良的威士忌酵母除了具有降糖速度快[6]、發(fā)酵周期短[7-8]、酒精產(chǎn)量高[9]和產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)風(fēng)味物質(zhì)[10]等特點之外，還要在風(fēng)味特征方面具有特色。2020年，WANIKAWA A[11]對使用啤酒酵母發(fā)酵威士忌的研究進展進行了綜述，其中提到啤酒酵母產(chǎn)生的風(fēng)味化合物會直接影響到威士忌酒的品質(zhì)。REID S J等[12]研究了在發(fā)酵初期進行細菌發(fā)酵的效果，結(jié)果表明利用乳桿菌進行預(yù)處理可以改變酒的品質(zhì)。2016年，孟金明[13]通混菌發(fā)酵提高了大麥酒的品質(zhì)，采用順序接種釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和漢遜酵母（Hansenula polymorpha），所得酒樣醇酯比達到1∶1，酒的品質(zhì)有明顯的提高。在風(fēng)味物質(zhì)檢測方面，2019年，JELEN′ H H等[14]采用氣相色譜-嗅覺儀對單一麥芽威士忌的主要風(fēng)味物質(zhì)進行了鑒定，其研究結(jié)果可用于通過揮發(fā)性成分區(qū)分單一麥芽威士忌、單一麥芽泥煤威士忌、谷物威士忌和美國威士忌。2014年，BENDIG P等[15]用氣相色譜-電子捕獲負離子質(zhì)譜測定了兩種蘇格蘭單一麥芽威士忌中的溴酚，開發(fā)了一種適用于測定威士忌中二溴和三溴苯酚的方法。

本研究以大麥芽為原料，選用3種不同酵母（酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3）制備威士忌，對比酵母發(fā)酵性能、理化指標(biāo)及出酒率，氣相色譜（gas chromatography，GC）法測定酒樣的風(fēng)味物質(zhì)，通過氣味活度值（odor activity value，OAV）確定關(guān)鍵香氣化合物及主成分分析（principal component analysis，PCA），并對其進行感官評價，考察不同酵母對威士忌品質(zhì)的影響，通過初步研究為優(yōu)良、特色威士忌酵母菌株的選育及應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與菌株

大麥芽：克里斯普英國進口麥芽。

威士忌專用酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院應(yīng)用微生物菌種中心。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠有限責(zé)任公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、正戊醇、異戊醇、活性戊醇、正己醇、乙醛、異丁醛、乙縮醛、丙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇、乙酸苯乙酯、糠醛、丙酮、3-羥基-2-丁酮（均為分析純）：比利時ACROS 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50 L啤酒釀造設(shè)備：青島優(yōu)易釀自動化設(shè)備技術(shù)有限公司；6394麥芽粉碎機：德國KüNZEL公司；20 L多功能蒸餾器、2.5 L多功能蒸餾器：煙臺吉訊釀酒設(shè)備廠；CLARUS 600氣相色譜儀：珀金埃爾默儀器有限公司；PHS-2F型pH計：上海雷磁儀器有限公司；0-40度、40-70度、70-100度酒精計：武強縣新林儀器儀表有限公司；0-10度、10-20度糖度計：衡水華普儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 威士忌的加工工藝流程及操作要點

原料→粉碎→糖化→發(fā)酵→蒸餾→橡木桶存放→調(diào)配→威士忌

操作要點：

麥汁的糖化：以制作15°P麥汁50 L為目標(biāo)，根據(jù)麥芽的出糖率以及設(shè)備的轉(zhuǎn)化率，計算得麥芽的使用量為11.5 kg，麥芽的粉碎度為1.5 mm，加水的體積為35 L，在糖化過程中于45 ℃保溫30 min，64 ℃保溫60 min，70 ℃保溫20 min[16]，通過碘檢驗作為觀察糖化結(jié)束的方法，若滴加碘液后不變色則糖化完全，變藍則糖化不完全。

發(fā)酵：將麥汁升溫到80 ℃后移入發(fā)酵罐，入罐溫度控制在（30±2）℃，40 g酵母粉先用400 mL水活化30 min后倒入麥汁中，發(fā)酵溫度設(shè)置為28～32 ℃，發(fā)酵72 h，每8 h測定一次糖度，若連續(xù)兩次糖度不變即得發(fā)酵液。每種酵母做3次平行實驗。

發(fā)酵液的蒸餾：使用20 L多功能蒸餾器對發(fā)酵液過蒸餾塔蒸餾，蒸餾溫度控制在（92±2）℃，收集蒸餾出的酒液，每隔10 min用酒精計測定一次蒸餾出酒液的酒精度，酒液酒精度降至5%vol停止收集。然后使用2.5 L多功能蒸餾器對過塔蒸餾出的酒液進行二次蒸餾，蒸餾溫度控制在（82±2）℃，蒸餾時每收集50 mL酒液用酒精計測定一次酒液的酒精度，酒精度為76%vol及以上的酒液為酒頭，60%vol～76%vol的酒液為酒身，40%vol～60%vol的酒液為酒尾，40%vol以下的酒液為廢液。

存放：由于橡木桶存放時間較長，存放前風(fēng)味的差異主要來源于酵母，存放后會減小這種差異[17]，不利于對比酵母對威士忌酒液的影響，因此本研究中僅對比橡木桶存放前的酒液。

調(diào)配：取上述蒸餾后的酒身用蒸餾水稀釋至40%vol，得到威士忌。

1.3.2 分析檢測

pH值的測定：采用pH計；糖度的測定：采用糖度計；總酸含量的測定：參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[18]中第一法電位滴定法；酒精度的測定：參照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[18]中第一法密度瓶法。

1.3.3 出酒率的計算

麥芽出酒率計算公式如下：

1.3.4 威士忌揮發(fā)性香氣物質(zhì)的檢測

采用氣相色譜法測定二次蒸餾后酒身的揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量。準(zhǔn)確吸取5 mL酒液樣品于氣相樣品瓶中，上機測定。氣相色譜條件：進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；色譜柱：CP-WAX 57 CB（50 m×0.25 mm×0.2 μm）；載氣為高純氮氣（N2）（純度≥99.999%），流速1 mL/min；分流比20∶1；升溫程序：40 ℃保溫4 min，4 ℃/min升溫到130 ℃，15 ℃/min升溫到210 ℃，保持15 min。

定性定量的方法：根據(jù)色譜峰出峰時間與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間對照定性組分，并根據(jù)峰面積大小確定物質(zhì)含量。

氣味活度值（OAV）是酒樣中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量與其感官閾值的比值，可以客觀的表現(xiàn)出該香氣成分對于酒樣整體風(fēng)味物質(zhì)的貢獻程度，OAV＞1的香氣成分對酒樣的香氣有顯著影響，OAV越大說明該香氣物質(zhì)對酒樣香氣的影響越大[19]，其計算公式如下：

1.3.5 主成分分析

主成分分析是一種通過降維將多個變量變?yōu)樯贁?shù)綜合變量，用簡化的數(shù)據(jù)反應(yīng)原始變量的大部分信息的統(tǒng)計方法[20]。利用主成分分析法對酒樣的香氣物質(zhì)的氣味活度值進行分析，可以得出香氣綜合得分較高的酒樣，從而選出可以促進威士忌蒸餾酒產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)風(fēng)味的酵母。

1.3.6 感官評價

組成6人感官評價小組（其中男3人、女3人，6人均為國家評委）。感官評價的酒樣為二次蒸餾后的酒身，酒精度為40%vol，每人對酒樣的色澤（20分），香味（30分），滋味（40分）和典型性（10分）進行打分，滿分100分，具體評價標(biāo)準(zhǔn)[21]見表1。

表1 威士忌的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of whisky

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0對酒樣的理化指標(biāo)進行單因素方差分析（P＜0.05），對酒樣的揮發(fā)性香氣物質(zhì)進行主成分分析；用Origin 9.0作圖；用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理。實驗中理化指標(biāo)的測定均重復(fù)測定3次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母的發(fā)酵性能

降糖情況可以反映出酵母的發(fā)酵性能，降糖速度快說明酵母的發(fā)酵速度快[22]。

由圖1可知，發(fā)酵時間在0～24 h時，酵母ACBC-1與酵母ACBC-2的降糖速度較快，酵母ACBC-3的降糖速度較慢；發(fā)酵時間在24～48 h時，酵母ACBC-1和酵母ACBC-2的降糖速度明顯下降，酵母ACBC-3的降糖速度較快；發(fā)酵時間在48～72 h時，3種酵母的降糖速度趨于穩(wěn)定。結(jié)果表明，發(fā)酵結(jié)束時（72 h），酵母ACBC-1殘?zhí)橇繛?.0 g/100 g，酵母ACBC-2殘?zhí)橇繛?.1 g/100 g，酵母ACBC-3的殘?zhí)橇繛?.8 g/100 g。在發(fā)酵結(jié)束時，剩余發(fā)酵液的糖度值越低說明酵母發(fā)酵能力就越強[23]。因此，酵母ACBC-1發(fā)酵性能最強。

圖1 不同酵母的發(fā)酵性能曲線Fig.1 Fermentation performance curves of different yeasts

2.2 不同酵母發(fā)酵液理化指標(biāo)測定

pH值是影響酶活和酵母新陳代謝的重要因素，總酸含量對風(fēng)味有不同的影響。由表2可知，以麥汁作為對照樣，對比3種酵母發(fā)酵液的糖度可知，經(jīng)過發(fā)酵后的麥汁糖度明顯下降，其中酵母ACBC-1發(fā)酵液糖度為3.00 g/100 g，其發(fā)酵能力顯著高于其他兩種酵母（P＜0.05），酵母ACBC-2和酵母ACBC-3的發(fā)酵能力無顯著性差異（P＞0.05）。3種酵母發(fā)酵液的酒精度在5.24%vol～6.42%vol之間，酵母ACBC-2和酵母ACBC-3的產(chǎn)酒精能力無顯著性差異（P＞0.05）。3種酵母發(fā)酵液的pH值在3.66～4.10之間，總酸含量在3.73～4.17 g/L之間，與發(fā)酵前的麥汁相比，3種酵母發(fā)酵液中總酸含量上升，pH值下降，酵母ACBC-2的發(fā)酵液總酸含量（4.17 g/L）顯著高于其他兩種酵母發(fā)酵液（P＜0.05），說明酵母ACBC-2的產(chǎn)酸能力較強。因此，從不同酵母發(fā)酵液的理化指標(biāo)來看，酵母ACBC-1最佳。

表2 麥汁及不同酵母發(fā)酵液的理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of wort and fermentation liquid with different yeasts

2.3 不同酵母發(fā)酵麥芽對出酒率的影響

由表3可知，酵母ACBC-1的單位麥芽出酒率（70.78 mL/kg）高于其他兩種酵母，表明在使用相同質(zhì)量原料的情況下，酵母ACBC-1可以生產(chǎn)出更多的酒精。

表3 不同酵母發(fā)酵麥芽出酒率Table 3 Liquor yield of malt fermented by different yeasts

2.4 不同酵母發(fā)酵對威士忌酒樣揮發(fā)性香氣物質(zhì)的影響

2.4.1 3種酵母制備威士忌酒樣香氣成分分析

由表4可知，3個酒樣中共檢出揮發(fā)性香氣物質(zhì)24種，包括醇類8種，醛類4種，酯類7種，芳香族2種，呋喃類1種，其他類2種。其中醇類化合物含量較高，酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3發(fā)酵制備威士忌蒸餾酒中的醇類化合物含量分別為4 026.57 mg/L、3 124.88 mg/L、4 458.67 mg/L。酒樣ACBC-3的異戊醇含量最高（2 426.67 mg/L），可以為酒體提供水果香和花香，酒樣ACBC-1的正丙醇含量最高（533.05 mg/L），可以為酒體提供花香和青草香。酒樣ACBC-1酯類化合物的含量（148.60 mg/L）和芳香族化合物的含量（164.45 mg/L）明顯高于其他兩個酒樣。

表4 3種酵母制備威士忌中揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of volatile aroma compounds contents in whisky produced by 3 kinds of yeasts

續(xù)表

2.4.2 揮發(fā)性香氣物質(zhì)氣味活度值分析

酒液中的揮發(fā)性香氣成分含量和對酒體香氣的貢獻不一定成正比，還要綜合香氣物質(zhì)的香氣特征和感官閾值來判斷。

由表5可知，3個酒樣共檢出了9種OAV＞1的香氣物質(zhì)，醇類物質(zhì)的OAV＞1的香氣物質(zhì)有4種，酯類物質(zhì)的OAV＞1的香氣物質(zhì)種類最多（5種），說明酯類物質(zhì)對酒樣香氣作用顯著。酒樣ACBC-1乙酸苯乙酯的OAV最高（103.92），給酒液帶來玫瑰香和草莓香，酒樣ACBC-2中OAV較大的物質(zhì)是乙酸異戊酯（OAV為44.98），酒液具有香蕉香，酒樣ACBC-3中OAV較高的物質(zhì)是乙酸苯乙酯（OAV為23.48），賦予酒樣玫瑰香和草莓香。結(jié)果表明，乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯及乙酸苯乙酯是威士忌的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，對酒樣的香氣貢獻最大。

表5 不同酵母制備威士忌酒樣中揮發(fā)性香氣物質(zhì)的氣味活度值Table 5 Odor activity value of volatile aroma substances in whisky samples produced by different yeasts

2.5 主成分分析

不同酵母制備威士忌酒樣風(fēng)味物質(zhì)主成分分析結(jié)果見表6，主成分的特征向量和載荷矩陣見表7，不同酒樣風(fēng)味物質(zhì)主成分分析PCA得分圖及載荷圖見圖2。

圖2 不同酵母制備威士忌酒樣風(fēng)味物質(zhì)主成分分析得分圖（a）及載荷圖（b）Fig.2 Principal components analysis scores (a) and loading plots (b) of flavor substances in whisky samples produced by different yeasts

表6 不同酵母制備威士忌酒樣風(fēng)味物質(zhì)主成分的方差貢獻率Table 6 Variance contribution rate of principal components of flavor compounds in different whisky samples produced by different yeasts

表7 主成分的特征向量和載荷矩陣Table 7 Characteristic vectors and loading matrix of principal components

由表6可知，不同酒樣風(fēng)味物質(zhì)共提取出兩個特征值＞1的主成分，兩個主成分的特征值分別是7.697和3.303，方差貢獻率分別為69.973%和30.027%，累計方差貢獻率為100%，說明2個主成分可以完整反應(yīng)風(fēng)味物質(zhì)的信息。

由表7可知，第一主成分中載荷較高的風(fēng)味物質(zhì)有異戊醇、正丙醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯，載荷值的絕對值均大于0.8，其中正丙醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯為正相關(guān)，異戊醇為負相關(guān)，第一主成分的方差貢獻率為69.973%，說明第一主成分對酒樣風(fēng)味影響最大。第二主成分中載荷值較大的風(fēng)味物質(zhì)有正丁醇、己酸乙酯、乙醛，載荷值的絕對值均＞0.78，其中正丁醇和乙醛為正相關(guān)，己酸乙酯為負相關(guān)，第二主成分的方差貢獻率為30.027%。

由圖2（a）可知，3種酒樣間區(qū)分較好，且不同酒樣分別位于圖的不同區(qū)域。由圖2（b）可知，酒樣ACBC-3位于第一主成分和第二主成分的負半軸，得分均小于0；酒樣ACBC-2位于第一主成分的負半軸和第二主成分的正半軸；酒樣ACBC-1位于第一主成分的正半軸和第二主成分的負半軸。

酒樣ACBC-3中異戊醇含量較高，因此主要分布在第一主成分和第二主成分的負半軸；酒樣ACBC-2中的正丁醇含量較高，因此主要分布在第一主成分的負半軸和第二主成分的正半軸；酒樣ACBC-1中乙酸乙酯、正丙醇、丁酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯含量較高，因此分布在第一主成分的正半軸和第二主成分的負半軸[25]。

2.6 不同酵母對威士忌酒樣風(fēng)味物質(zhì)影響的綜合評價

由表6可知，當(dāng)提取2個主成分時累計方差貢獻率已經(jīng)達到100%，因此兩個主成分就足夠描述不同酒樣的總體風(fēng)味物質(zhì)水平。采用PCA分析，得出F1和F2兩個綜合指標(biāo)代替原來的11個指標(biāo)對威士忌酒樣的風(fēng)味物質(zhì)進行分析，最終得到的2個主成分因子的方程如下：

式中：F1為各個酒樣中第一主成分的綜合指標(biāo)，F(xiàn)2為各個酒樣中第二主成分的綜合指標(biāo)，下同，X1～X11分別表示酒樣中各風(fēng)味物質(zhì)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理的值。

根據(jù)PCA分析的結(jié)果，用各主成分的方差貢獻率作為權(quán)重，對兩個主成分得分進行加權(quán)求和，建立評價函數(shù)F=0.699 73F1+0.300 27F2，式中F表示各個酒樣的綜合評價分值，計算各酒樣的綜合評分，得出酒樣風(fēng)味物質(zhì)水平高低。不同酒樣的主成分得分及綜合得分見表8。

表8 不同酵母制備威士忌酒樣的主成分得分及綜合得分Table 8 Principal components scores and comprehensive scores of whisky samples produced by different yeasts

由表8可知，在3個酒樣中，酒樣ACBC-1綜合得分最高為1.87分，明顯高于其他酒樣，說明其風(fēng)味較好，酒樣ACBC-2綜合得分為0.26，酒樣ACBC-3的綜合得分為負值（-2.13分），說明這兩個酒樣風(fēng)味較差。

2.7 不同酵母制備威士忌的感官評價

不同酵母制備威士忌蒸餾酒酒樣的感官評分雷達圖見圖3。

圖3 不同酒樣感官評分雷達圖Fig.3 Radar chart of sensory evaluation of whisky samples produced by different yeasts

由圖3可知，在色澤方面，3個酒樣感官評分均為20分，酒液澄清透亮；在香氣方面，酒樣ACBC-1平均得分最高為27.8分，酒香愉悅；在滋味方面，酒樣ACBC-1平均得分最高為33.8分，酒體豐滿醇厚，果香純正；在典型性方面，酒樣ACBC-1平均得分為8.4分，典型明確，酒體組分較協(xié)調(diào)。酒樣ACBC-1感官評價綜合得分最高，總分為90分。

3 結(jié)論

該研究以大麥芽為原料，選用3種不同酵母發(fā)酵制備威士忌蒸餾酒。結(jié)果表明，酵母ACBC-1的發(fā)酵性能最好，其發(fā)酵液的理化指標(biāo)良好（總酸3.73 g/L，殘?zhí)?.00 g/100 g，酒精度6.42%vol，pH 4.1），出酒率最高（70.78 mL/kg）。3個酒樣共檢出24種風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類化合物含量最多，占總含量的77%～98%；OAV＞1的酯類化合物種類最多（5種），其中乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯及乙酸苯乙酯是關(guān)鍵香氣物質(zhì)，對酒樣的香氣貢獻最大。酵母ACBC-1制備威士忌感官評分為90分。因此，酵母ACBC-1是適合釀造威士忌的優(yōu)良菌株。