成天瓊，陳學(xué)農(nóng)

(1.重慶市合川區(qū)人民醫(yī)院，重慶 合川 401520；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 針灸科，貴州 遵義 563099)

胰腺癌(Pancreatic cancer)是常見(jiàn)消化系統(tǒng)腫瘤，預(yù)后較差，5年生存率不到5%，預(yù)計(jì)到2040年全球胰腺癌的發(fā)病率和死亡率將增長(zhǎng)近80%[1]。胰腺癌的治療選擇有限，只有10%到20%的患者可以接受輔助化療的根治性切除，且手術(shù)后的復(fù)發(fā)率很高[2]。胰腺癌缺乏早期診斷標(biāo)志物，預(yù)后差，是臨床研究的一大難點(diǎn)。

全基因組RNA測(cè)序表明，人類基因組中只有一小部分被轉(zhuǎn)錄為編碼蛋白質(zhì)的mRNA，其余部分為許多類型的非編碼RNA(ncRNA)。既往研究者認(rèn)為其余非蛋白質(zhì)編碼的轉(zhuǎn)錄是無(wú)功能的，非編碼RNA也因此被視為垃圾RNA[3]。但越來(lái)越多的證據(jù)表明，ncRNA具有多種功能及生物學(xué)活性，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和疾病發(fā)生、發(fā)展，如腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和血管生成[4]。在ncRNA中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)和增強(qiáng)子RNA(eRNA)是最豐富的。ncRNA在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用，如LncRNALINC01963在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)較低，通過(guò)上調(diào)lncRNALINC01963在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，可抑制集落數(shù)、細(xì)胞周期、增殖和侵襲，同時(shí)改善細(xì)胞凋亡，從而抑制胰腺癌的進(jìn)展[5]。LncRNAZFAS1通過(guò)RHOA / ROCK2途徑促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移[6]。胰腺癌中異常表達(dá)了許多l(xiāng)ncRNA和eRNA，而對(duì)于eRNA而言，它們?cè)谝认侔┻M(jìn)展中的功能和機(jī)制在很大程度上尚不清楚。故本研究用集成數(shù)據(jù)分析方法來(lái)識(shí)別胰腺腺癌(Pancreatic Adenocarcinoma，PAAD)中的關(guān)鍵eRNA，并探討其在胰腺癌預(yù)后、發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 通過(guò)集成數(shù)據(jù)分析鑒定PAAD中的預(yù)后相關(guān)eRNA 首先從UCSCxena(https://xenabrowser.net/datapages/)下載33種癌癥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)、生存數(shù)據(jù)，用EnsemblBioMart將Ensembl ID轉(zhuǎn)換成基因Symbol。從既往的研究中獲取由PreSTIGE預(yù)測(cè)的組織特異性增強(qiáng)子表達(dá)的lncRNA及其相應(yīng)靶標(biāo)的列表[7-8]。使用交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器TANRIC(癌癥非編碼RNA地圖集)研究TCGA中PAAD隊(duì)列中上述列表中eRNA的表達(dá)水平及其臨床相關(guān)性[9]。提取PAAD樣品中eRNA的表達(dá)量并與生存數(shù)據(jù)合并。按照eRNA表達(dá)量將胰腺癌患者分為高低表達(dá)兩組，Kaplan-Meier 生存分析比較兩組間總體生存(Overall Survival，OS；Log-Rank檢驗(yàn)，P<0.005)。然后研究TANRIC共表達(dá)數(shù)據(jù)，以評(píng)估eRNA與其預(yù)測(cè)的靶基因之間的相關(guān)性。用Spearman相關(guān)性分析上述生存相關(guān)eRNA與其靶基因在胰腺癌中的相關(guān)性，過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)為corFilter>0.4，P<0.001，用“ggplot2”R包作圖。與總生存期(P<0.05)和其靶基因水平(P<0.001)均具有顯著相關(guān)性的eRNA是PAAD中的候選關(guān)鍵eRNA。選取P值最小的生存相關(guān)eRNA后續(xù)進(jìn)一步分析。然后用“l(fā)imma”包分析在不同臨床分組的胰腺癌樣品中關(guān)鍵eRNA表達(dá)是否有差異。

1.2 GO、KEGG富集分析 為了研究關(guān)鍵eRNA相關(guān)編碼基因的可能功能特性，共表達(dá)分析得到關(guān)鍵eRNA在胰腺癌中更多的潛在靶基因。使“clusterProfiler”R包進(jìn)行對(duì)潛在靶基因行GO、KEGG富集分析(校正后P<0.05)，探討關(guān)鍵eRNA在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1.3 泛癌生存及相關(guān)性驗(yàn)證 從33種腫瘤中提取胰腺癌關(guān)鍵預(yù)后相關(guān)eRNA和其靶基因的表達(dá)量，與生存數(shù)據(jù)合并，按照eRNA表達(dá)量將癌癥患者分為高低表達(dá)兩組，Kaplan-Meier生存分析比較兩組間生存差異。驗(yàn)證胰腺癌關(guān)鍵預(yù)后相關(guān)eRNA和其靶基因在泛癌中是否具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 PAAD中預(yù)后相關(guān)eRNA及與其靶基因相關(guān)性分析 從TCGA中PAAD隊(duì)列中RNA測(cè)序數(shù)據(jù)提取胰腺癌eRNA表達(dá)，按中位數(shù)分成高低表達(dá)兩組，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果提示147個(gè)eRNA表達(dá)水平和胰腺癌總體生存率相關(guān)(Kaplan-Meier對(duì)數(shù)檢驗(yàn)，P<0.05)。再進(jìn)一步對(duì)147種eRNA的水平與其預(yù)測(cè)的目標(biāo)基因mRNA的水平作相關(guān)性分析，結(jié)果提示56對(duì)eRNA存在顯著相關(guān)(見(jiàn)表1；Spearman相關(guān)系數(shù)r>0.4，P<0.001)。選取PAAD中預(yù)后相關(guān)最顯著(P<0.000)的eRNA LINC00242進(jìn)一步分析。

表1 與PAAD預(yù)后相關(guān)的eRNA及其靶標(biāo)

續(xù)表

2.2 LINC00242可能是PAAD中的關(guān)鍵eRNA 在PAAD患者中，LINC00242高表達(dá)組比低表達(dá)組顯示出較好的總體生存率(圖1A，Kaplan-Meier對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，P<0.001)。此外，LINC00242和PHF10 mRNA水平成正相關(guān)(圖1B，Spearman的r=0.412，P<0.001)。

2.3 LINC00242與臨床病理特征相關(guān)分析 進(jìn)一步分析LINC00242與患者的臨床病理特征包括生存狀態(tài)、腫瘤分級(jí)、腫瘤分期和腫瘤狀態(tài)，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，胰腺癌組織中LINC00242表達(dá)量低于癌旁組織(見(jiàn)圖2A)，并且LINC00242的表達(dá)在胰腺癌組織不同分化等級(jí)(見(jiàn)圖2B)、臨床分期(見(jiàn)圖2C)以及患者的最終結(jié)局狀態(tài)(見(jiàn)圖2D)方面均存在著明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 PAAD病例臨床特征

2.4 GO、KEGG富集分析 LINC00242共表達(dá)分析顯示在PAAD中1 846個(gè)基因和LINC00242具有相關(guān)性(r>0.4，P<0.001)，是LINC00242在胰腺癌中潛在靶基因。對(duì)以上潛在靶基因行基因本體論(Gene Ontology，GO)、京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，探討LINC00242在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。GO富集分析結(jié)果分別顯示了細(xì)胞成分(Cellular component，CC )、生物學(xué)過(guò)程(Biological process， BP)、分子功能( Molecular function，MF )前10個(gè)最顯著的條目(見(jiàn)圖3A，校正后P<0.05)，基因富集在化學(xué)突觸傳遞調(diào)節(jié)、突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控等生物過(guò)程。為進(jìn)一步驗(yàn)證LINC00242通過(guò)以上生物過(guò)程影響PAAD的發(fā)生發(fā)展，分析富集最顯著的GO條目中基因與LINC00242的相關(guān)性，結(jié)果表明所有富集的基因與LINC00242皆有較高的關(guān)聯(lián)(見(jiàn)表3，r>0.4)。KEGG通路富集分析表明LINC00242主要通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、胰島素分泌、cAMP信號(hào)通路等影響胰腺癌的發(fā)生(見(jiàn)圖3B，校正后P<0.05)。

A：LINC00242在不同腫瘤狀態(tài)的差異表達(dá)；B：腫瘤分級(jí)；C：腫瘤分期；D:生存狀態(tài)。圖2 LINC00242與臨床病理特征相關(guān)分析

表3 最顯著GO條目中富集基因與LINC00242的相關(guān)性

A：BP、CC、MF前10個(gè)最顯著的GO條目；B：前30條顯著富集通路。圖3 潛在靶基因GO、KEGG富集分析

2.5 泛癌預(yù)后及相關(guān)性驗(yàn)證 泛癌生存分析表明eRNA LINC00242與腎上腺皮質(zhì)癌(Adrenocortical carcinoma，ACC)、腎透明細(xì)胞癌(Kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)、PAAD的預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，其中LINC00242低表達(dá)與ACC(見(jiàn)圖4A)、KIRC(見(jiàn)圖4B)良好預(yù)后相關(guān)。LINC00242和PHF10共表達(dá)分析表明在睪丸生殖細(xì)胞瘤(Testicular germ cell tumors，TGCT；見(jiàn)圖5A)、子宮癌肉瘤(Uterine carcinosarcoma，UCS；見(jiàn)圖5B)、肝細(xì)胞癌(Liver hepatocellular carcinoma，LIHC；見(jiàn)圖5C)、葡萄膜黑色素瘤(Uvealmelanoma，UVM；見(jiàn)圖5D)和PAAD 5種癌癥中具有顯著相關(guān)性(r>0.4，P<0.001)。

A：腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)；B：腎透明細(xì)胞癌(KIRC)。圖4 LINC00242與泛癌生存分析

A：LINC00242和PHF10在睪丸生殖細(xì)胞瘤(TGCT)；B：子宮癌肉瘤(UCS)；C：肝細(xì)胞癌(LIHC)；D：葡萄膜黑色素瘤(UVM)4種癌癥中呈正相關(guān)(r> 0.4，P<0.001)。圖5 泛癌驗(yàn)證LINC00242和PHF10相關(guān)性

3 討論

增強(qiáng)子是一類具有組織特異性的DNA調(diào)控元件,可通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子相互作用來(lái)增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄?；罨脑鰪?qiáng)子可轉(zhuǎn)錄生成一類長(zhǎng)鏈非編碼RNA又稱作增強(qiáng)子RNA。eRNA是在基因增強(qiáng)子區(qū)域衍生的lncRNA的特定亞類，能夠順式作用以影響相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。在人類癌癥中，致癌基因或致癌信號(hào)通路的激活通常由于增強(qiáng)子的激活和eRNA的產(chǎn)生引起[10]。為了增進(jìn)對(duì)PAAD中eRNA的了解，本研究鑒定了PAAD中與預(yù)后相關(guān)的eRNA。最后結(jié)果顯示LINC00242是PAAD中最顯著的預(yù)后相關(guān)eRNA(P<0.000)，PHF10是其靶點(diǎn)。LINC00242在胰腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織，且在胰腺癌組織不同分化、臨床分期、患者最終結(jié)局狀態(tài)等表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LINC00242和PHF10的表達(dá)成正相關(guān)，在泛癌驗(yàn)證中顯示LINC00242在ACC、KIRC、PAAD中與總體生存顯著相關(guān)。表明LINC00242在胰腺癌預(yù)后及發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用，為在以eRNA為靶標(biāo)的胰腺癌治療中的臨床應(yīng)用提供參考。

鑒定除其預(yù)測(cè)的靶基因PHF10外的其他共表達(dá)基因來(lái)闡明LINC00242的作用。除了PHF10，本研究還發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中一共有1 846個(gè)與LINC00242的表達(dá)具有顯著相關(guān)性的基因，這些基因是LINC00242在胰腺癌中的潛在靶基因。盡管eRNA功能主要在順式中執(zhí)行，但一些觀察結(jié)果表明eRNA可以介導(dǎo)反式中其他基因的表達(dá)[11-12]，因此可以推測(cè)LINC00242具有直接或間接反式作用。盡管如此，轉(zhuǎn)錄本之間的相關(guān)性并不一定暗示因果關(guān)系，LINC00242是否是增強(qiáng)子活性的功能性成分仍有待確定。但是，根據(jù)基因本體論富集分析，與LINC00242相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄本主要參與突觸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路、有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、胰島素分泌、cAMP信號(hào)通路等通路影響胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。

PI3K-Akt信號(hào)通路參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展[13-14]，胰腺星狀細(xì)胞衍生的外泌體通過(guò)激活PI3K -Akt通路來(lái)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖[15]。胰腺癌最常見(jiàn)的信號(hào)畸變發(fā)生在Wnt / Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，以及在表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)途徑及其相關(guān)配體，EGF和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β中。血漿珠蛋白是EGFR信號(hào)通路的組成部分，在正常細(xì)胞粘附中起重要作用，且與腫瘤微環(huán)境中PI3K / AKT和MAPK信號(hào)通路的差異上調(diào)有關(guān)，表明它可能在胰腺癌發(fā)生中起重要作用[16]。一種新型circRNA(circNFIB1，hsa_circ_0086375)通過(guò)抑制PI3K / Akt途徑抑制胰腺癌的淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移[17]。KRAS突變發(fā)生在所有人類癌癥的1/4中，有研究表明MAPK途徑的各個(gè)成分有潛力作為治療KRAS突變型癌癥的靶標(biāo)[18]。以上都表明PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路在胰腺癌中也起重要作用，這與KEGG富集結(jié)果相符合[19]。

總之，本研究應(yīng)用了一種集成數(shù)據(jù)分析方法來(lái)識(shí)別PAAD中的關(guān)鍵eRNA。結(jié)果表明，LINC00242可能是PAAD的預(yù)后相關(guān)基因，其高表達(dá)在PAAD中預(yù)后良好，可以用作PAAD的組織特異性eRNA，LINC00242的潛在靶標(biāo)是PHF10。隨著研究的不斷深入,LINC00242有望成為新型胰腺癌診斷、預(yù)后標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)。